一种靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体及其制备方法和应用

本发明属于基因工程或者纳米材料，具体涉及的是一种靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，肿瘤发病率和死亡率不断升高。肿瘤治疗效果差、副作用大，药物靶向精准性差导致肿瘤给我们带来更大的威胁。随着医学技术的进步与发展，使用生物安全性高的蛋白类纳米粒子作为药物载体靶向治疗肿瘤受到研究学者的广泛关注。

2、铁蛋白是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中的铁储存蛋白，负责参与和维持铁代谢平衡。典型的铁蛋白是24个蛋白亚基自组装形成的中空纳米笼状结构(外径为12nm，内径为8nm)。铁蛋白亚基由轻链(l-chain，19kda)和重链(h-chain，21kda)组成。铁蛋白不仅生物相容性好，稳定性高，而且重组人重链铁蛋白hftn(由铁蛋白h亚基自组装形成的铁蛋白纳米笼)具有靶向性，可与多种肿瘤细胞的细胞膜上过量表达的转铁蛋白受体tfr1特异性结合。此外，铁蛋白具有随着ph变化而自动解离和聚合的能力，因此hftn作为一种良好的生物载体得到越来越多的关注，而lintt1是一种对肿瘤细胞线粒体膜上p32受体具有高亲和力的靶向肽。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，加强重组人重链铁蛋白hftn对肿瘤的穿透和靶向能力，提供一种靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体及其制备方法和应用，将药物、聚集诱导发光材料、成像剂或者光敏剂载入到重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn内部，进而实现肿瘤细胞的靶向治疗。

2、本发明的主要构思是：通过分子克隆技术把肿瘤归巢穿透肽线性tt1(lintt1，序列：akrgarsta)融合到hftn的n端获得重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn，然后通过调节ph值使聚集诱导发光材料aie、药物、成像剂、光敏剂等包裹进入到重组人重链铁蛋白hftn的内部，构建一个具有强靶向性和穿透能力的纳米载体。

3、本发明采用的技术方案为：

4、一种靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体，其空间结构为：在具有纳米笼结构的重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn的内部包裹药物、聚集诱导发光材料、成像剂或者光敏剂中的一种或多种；所述重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn的化学结构为：肿瘤穿透线性归巢肽lintt1与铁蛋白hftn的n端连接。

5、进一步的，所述重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn为重组人重链铁蛋白。

6、一种如上所述靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

7、s1、首先，将铁蛋白hftn序列通过pcr扩增后与pgex-6p-1共同使用bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切处理；然后，连接转化得到含有铁蛋白hftn序列的pgex-6p-1重组质粒；

8、s2、以步骤s1得到的重组质粒pgex-6p-1为基础，通过分子克隆的方法将肿瘤穿透线性归巢肽lintt1连接到铁蛋白hftn的n端，制得重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn编码序列的重组质粒pgex-6p-1；

9、s3、首先，将步骤s2得到的重组质粒pgex-6p-1转化到大肠杆菌e.coilbl21(de3)感受态细胞中，接种于含氨苄青霉素的培养基中培养；然后，向培养基中加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导进行表达；最后，离心收集沉淀，并通过超声破碎沉淀，离心收集上清，并依次通过亲和层析、阴离子交换层析及凝胶过滤层析进行纯化，制得具有靶向肽的重组铁蛋白粒子lintt1-hftn的溶液；

10、s4、将步骤s3制得的具有靶向肽的重组铁蛋白粒子lintt1-hftn的溶液与药物、聚集诱导发光材料aie(mettmn)、成像剂或者光敏剂中的一种或多种混合，首先将混合溶液的ph值调节到2.0，室温搅拌后铁蛋白hftn纳米笼解离，药物、聚集诱导发光材料、成像剂或者光敏剂中的一种或多种包裹入hftn纳米笼中；然后将重组铁蛋白溶液的ph值调节到8.0，铁蛋白hftn纳米笼重新聚合，最后使用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗，制得重组铁蛋白纳米载体。通过较强的靶向能力和细胞穿透能力，使得药物在肿瘤部位进行释放，以实现靶向肿瘤并进行治疗的目的。

11、进一步的，在所述步骤s1中，所述分子克隆的方法采用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的基因序列为：aaaacgtggtgcacgtagcaccgcaggtggtggtggtagcatgaccaccgcgagcacc，反向引物的基因序列为：ctacgtgcaccacgttttgcggatcccaggggcccctggaacag；

12、所述肿瘤穿透线性归巢肽lintt1的序列为：akrgarsta；

13、所述铁蛋白hftn的氨基酸序列为：

14、mttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqs

15、heerehaeklmklqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamecalhleknvnqsllelh

16、klatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdnes。

17、进一步的，在所述步骤s3中，聚集诱导发光材料aie(mettmn)的分子式为c28h21n3s，相对分子质量为431.557，激发波长为488nm，发射波长为681nm，在白光的照射下产生ros。

18、进一步的，所述药物为紫杉醇(ptx)，紫杉醇的分子式为c47h51no14，相对分子质量为853.9。

19、上述靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体可以应用在肿瘤靶向治疗药物中。

20、与现有技术相比本发明的有益效果为：

21、本发明通过基因突变将肿瘤归巢穿透肽线性tt1(lintt1)akrgarsta融合到hftn的n端(lintt1-hftn)，hftn可与肿瘤部位高表达的转铁蛋白受体结合，而lintt1可以靶向肿瘤细胞膜和线粒体膜高表达的p32受体。此外，由于肿瘤部位ph值较低，低ph值可使hftn纳米笼打开，从而将纳米笼包裹的药物释放到肿瘤部位，杀死肿瘤细胞。

22、因此，本发明构建了一个具有较强的双靶向能力和肿瘤细胞穿透能力的，可包裹aie、药物、成像剂、光敏剂等的纳米载体，可以实现肿瘤细胞的可视化和光动力治疗，给后续铁蛋白靶向和穿透肿瘤提供了很好的载体模型，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体，其特征在于：所述重组铁蛋白纳米载体的空间结构为：在具有纳米笼结构的重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn的内部包裹药物、聚集诱导发光材料、成像剂或者光敏剂中的一种或多种；所述重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn的化学结构为：肿瘤穿透线性归巢肽lintt1与铁蛋白hftn的n端连接。

2.根据权利要求1所述的一种靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体，其特征在于：所述重组铁蛋白纳米粒子lintt1-hftn为重组人重链铁蛋白。

3.一种如权利要求1所述靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.一种如权利要求3所述靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体的制备方法，其特征在于：在所述步骤s1中，所述分子克隆的方法采用的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的基因序列为：aaaacgtggtgcacgtagcaccgcaggtggtggtggtagcatgaccaccgcgagcacc，反向引物的基因序列为：ctacgtgcaccacgttttgcggatcccaggggcccctggaacag；

5.一种如权利要求3所述靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体的制备方法，其特征在于：在所述步骤s3中，聚集诱导发光材料aie的分子式为c28h21n3s，相对分子质量为431.557，激发波长为488nm，发射波长为681nm，在白光的照射下产生ros。

6.一种如权利要求3所述靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体的制备方法，其特征在于：所述药物为紫杉醇，紫杉醇的分子式为c47h51no14，相对分子质量为853.9。

7.一种如权利要求1所述靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体在肿瘤靶向治疗药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种靶向细胞的重组铁蛋白纳米载体及其制备方法和应用，属于基因工程或者纳米材料技术领域，加强重组人重链铁蛋白HFtn对肿瘤的穿透和靶向能力，解决方案为：通过分子克隆技术把肿瘤归巢穿透肽线性TT1融合到HFtn的N端获得重组铁蛋白纳米粒子LinTT1‑HFtn，然后通过调节pH值使聚集诱导发光材料、药物、成像剂、光敏剂等包裹进入到重组人重链铁蛋白HFtn的内部，构建具有强靶向性和穿透能力的纳米载体。本发明合成的纳米系统将肿瘤归巢穿透肽连接到人铁蛋白重链上，可以实现肿瘤细胞的可视化和光动力治疗，给后续铁蛋白靶向和穿透肿瘤提供了很好的载体模型，具有良好的应用前景。

技术研发人员：王德平,周鑫,蒋芳颖,郑健,曹济民
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12