一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法

本发明涉及中药活性成分分离，特别涉及一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法。

背景技术：

1、畲药三叶青(terastigma hemsleyamm diels et gilg)又名金线吊葫芦、蛇附子、石抱子，为葡萄科三叶崖爬藤属蔓生植物，是我国特有药用植物、福建特色畲药，主要以藤叶和地下块根入药，其性凉，味甘微苦，具有清热解毒、祛风除湿、消肿止痛等功效。现代药理研究表明，三叶青具有抗肝损伤、抗肿瘤、抗炎等作用，临床上主要用于治疗肺炎、乙型肝炎、急性支气管炎等疾病。三叶青化学成分丰富，主要含有黄酮、酚酸、三萜类等，其中三萜类化合物是三叶青重要的次生代谢产物，其具有降胆固醇、止咳、抗癌等显著药理活性。

2、现有技术存在三叶青中三萜化合物的相关报道，如刘东等从三叶青中分离鉴定蒲公英萜醇、蒲公英赛醇等；许阿娟等，采用uv-vis法测定三叶青药材中总三萜含量。现有充足的证据证明药材中的成分常包裹在植物细胞壁内，采用传统提取方法难以释放，提取率低，效率低(王云洁等，酶法在中药提取中的应用进展)。近年来，酶辅助提取法广泛应用于植物中黄酮、酚酸的提取工艺研究。纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等专属性酶可选择性破坏植物纤维素、细胞壁等致密结构，使得植物胞内成分更容易溶解、扩散，从而提高中药材中有效成分的溶出率。其中，酶解温度、酶解时间、酶解ph、酶添加量均对三叶青总三萜提取可能存在实质的影响，因此亟需一种基于酶辅助提取三叶青总三萜的优化方法。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于响应面法(box-behnken)优化酶法辅助提取三叶青总三萜的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法，基于box-behnken响应面法，以sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解ph、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程：

3、y＝2.21-6.500e-003a-0.058b-8.333e-003c-0.071d+0.085ab-0.018ac-0.067ad-0.042bc+0.075bd+0.044cd-0.32a2-0.22b2-0.21c2-0.18d2；

4、其中，a为酶添加量，b为酶解ph，c为酶解时间，d为酶解温度，y为总三萜提取率。

5、本发明的有益效果在于：本发明在单因素试验考察酶添加量、酶解ph、酶解温度、酶解时间的基础上，采用box-behnken响应面法优化酶辅助的三叶青总三萜提取工艺。经过多项方程拟合，结果表面拟合方程显著，确定的酶辅助三叶青总三萜的最佳提取条件：以纤维素酶进行酶解，酶添加量为1.99％、酶解ph为4.82、酶解温度为42.56℃、酶解时间为88.62min。在此提取条件下，三叶青提取率的预测值为2.23％，经放大验证试验，三叶青总三萜提取率为2.18％±0.07％，rsd为2.24，与模型接近。

技术特征：

1.一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法，其特征在于，基于box-behnken响应面法，以sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解ph、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述总三萜提取率以sebiferenic acid提取率所确定，sebiferenic acid质量浓度c对544nm吸收波长下的吸光度a的线性回归方程为：a＝0.0461c+0.0391。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述线性回归方程按如下方法获得：

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述三叶青总三萜按如下方法提取：

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酶选自半纤维素酶、纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶、木瓜蛋白酶中的一种。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述酶按如下方法确定：所述酶辅助提取三叶青总三萜的方法为：将经过预处理的三叶青块根粉末用水混悬后，调节ph为5.0，加入所述酶使每5g底物中至少含有2500u的酶，均匀分散并在45℃下酶解60min，取上清液后计算三叶青总三萜提取率，选取三叶青总三萜提取率最高的酶为实验酶种。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，最优所述酶添加量按如下方法确定：将经过预处理的三叶青块根粉末用水混悬后，以酶解ph为5.0，酶解温度为45℃，酶解时间为60min，设置占三叶青块根粉末质量1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、5.0％的酶进行平行酶解，取上清后计算三叶青总三萜提取率，获得三叶青总三萜提取率最高的酶添加量。

8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，最优所述酶解ph按如下方法确定：将经过预处理的三叶青块根粉末用水混悬后，以酶添加量为2.5％，酶解温度为45℃，酶解时间为60min，设置3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的酶解ph进行平行酶解，取上清后计算三叶青总三萜提取率，获得三叶青总三萜提取率最高的酶解ph。

9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，最优所述酶解时间按如下方法确定：将经过预处理的三叶青块根粉末用水混悬后，以酶添加量为2.5％，酶解温度为45℃，酶解ph为5.0，设置30、60、90、120、150min的酶解时间进行平行酶解，取上清后计算三叶青总三萜提取率，获得三叶青总三萜提取率最高的酶解时间。

10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，最优所述酶解温度按如下方法确定：将经过预处理的三叶青块根粉末用水混悬后，以酶添加量为2.5％，酶解ph为5.0，酶解时间为60min，设置25、35、45、55、65℃的酶解温度进行平行酶解，取上清后计算三叶青总三萜提取率，获得三叶青总三萜提取率最高的酶解温度。

技术总结
本发明涉及中药活性成分分离技术领域，特别涉及一种基于响应面法优化酶辅助提取三叶青总三萜的方法。其中，所述方法基于Box‑Behnken响应面法，以Sebiferenic acid质量浓度为响应值，选取酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间四个响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕所述中心上下各取一个水平值作为响应面水平，对各响应变量数据进行多元回归分析，获得回归方程以及得到最佳酶解条件：以纤维素酶酶解，酶添加量(A)为1.99％、酶解pH值(B)为4.82、酶解温度(D)为42.56℃、酶解时间(C)为88.62min。

技术研发人员：范世明,许文,徐惠龙,林瑶,卢明菲,杨楠,叶淼,徐伟
受保护的技术使用者：福建中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11