同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法

本发明涉及一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，属于纳米医学领域。

背景技术：

1、 2018年，癌症在中国居民死亡原因中排名第二，而在2020年已经跃居第一。放疗和化疗是临床上普遍应用的癌症治疗方法，但是放疗中累积辐射剂量的限制和放、化疗严重的毒副作用是放化疗在癌症临床治疗中的明显不足。发展安全、高效的替代疗法一直是癌症治疗研究领域的努力目标。声动力治疗(sonodynamic therapy, sdt)是一种新型疗法，主要组成包括超声和声敏剂。利用超声波，尤其是聚焦超声无创地将声能聚焦于深部组织，激活声敏剂产生抗肿瘤效应。超声穿透组织的能力达到5-10cm，在组织穿透能力方面远优于光动力疗法。

2、声动力治疗过程中需消耗大量氧气，然而实体瘤内部由于氧气供应不足导致存在乏氧区域，因此声动力治疗面临效率较低无法有效杀灭乏氧肿瘤细胞的问题。且声动力治疗过程中会破坏肿瘤血管、阻断氧气的进一步供应，造成治疗后的肿瘤组织乏氧状况愈加严重。

3、克服乏氧对促进声动力治疗临床应用具有重大现实意义。一方面，肿瘤细胞内存在高浓度双氧水（h2o2），可被二氧化锰（mno2）原位催化产生氧气，增加声动力治疗所需的氧气；另一方面，由于癌细胞对线粒体呼吸的独特依赖性，通过线粒体呼吸链抑制剂靶向癌症线粒体可以有效节约线粒体呼吸造成的氧气消耗，从而间接增加声动力治疗可用的氧气量。因此，设计能够通过同时产氧与节氧的纳米药物对于高效提升治疗声动力治疗肿瘤的效果具有重要意义。

技术实现思路

1、为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，本发明的技术方案是：

2、一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、 s1、将中空二氧化锰纳米粒子同时包载声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂，形成混合溶液；

4、s2、制备单宁酸修饰的透明质酸；

5、s3、将步骤s1制备的混合溶液与步骤s2制备的透明质酸溶液再次混合，滴加金属离子水溶液交联形成金属多酚网格，最终得到同时产氧与节氧的纳米粒子。

6、 所述的步骤s1具体为：将中空二氧化锰纳米粒子分散于磷酸缓冲盐溶液中形成中空二氧化锰纳米粒子溶液，该中空二氧化锰纳米粒子溶液的浓度为1~3 mg/ml；同时，将声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂溶解于二甲亚砜中，溶解声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂的二甲亚砜浓度调整为2~3 mg/ml，然后对二甲亚砜进行磁力搅拌至充分溶解，之后滴加至中空二氧化锰纳米粒子溶液中，室温下搅拌12~24小时后，依次经过离心、磷酸缓冲盐溶液清洗后，重新分散于去离子水中，使中空二氧化锰纳米粒子溶液浓度为1~3 mg/ml。

7、所述的步骤s2具体为：

8、将透明质酸溶解于磷酸缓冲盐溶液中，使磷酸缓冲盐溶液的浓度为2~3 mg/ml；再加入浓度为1~2 mg/ml的edc与浓度为0.75~1.5 mg/ml的nhs，活化30 min，形成透明质酸混合溶液；然后将氨基化单宁酸加入到透明质酸混合溶液，形成浓度为4~8 mg/ml的二级混合溶液，之后加入2~5 ml二甲亚砜至固体完全溶解，室温下反应12~24小时；先后用二甲亚砜与去离子水混合溶液、去离子水子透析后，冻干得到接枝率为5%~10%的单宁酸修饰的透明质酸。

9、 所述的步骤s3具体为：将接枝率为5%~10%的单宁酸修饰的透明质酸溶解于去离子水中，透明质酸与去离子水形成的混合溶液浓度为5~10 mg/ml，滴加1~3 ml的混合溶液至包载声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂的中空二氧化锰纳米粒子溶液中；室温下搅拌30 min后，10 min内滴加1 mg/ml的金属离子水溶液10~20 ml，加入tris-hcl缓冲液调节ph到8.0并搅拌10 min；最后8000 rmp离心5~15 min，用去离子水清洗两次后得到可同时产氧与节氧的纳米粒子。

10、在所述的步骤s1中，所述中空二氧化锰纳米粒子的粒径为50~200 nm。

11、所述声敏剂为司帕沙星、二氢卟吩e6、曙红、原卟啉、吲哚菁绿的一种或几种按照任意比例混合而成。

12、所述线粒体呼吸链抑制剂为阿托伐醌、寡霉素、抗霉素a、鱼藤酮、安密妥、杀粉蝶菌素的一种或几种按照任意比例混合而成。

13、所述透明质酸的分子量为1~100万。

14、所述透明质酸单体与氨基化单宁酸的摩尔比例为1：0.1~1：0.2；所述透明质酸单体与edc的摩尔比例为1：1~1：2；所述edc和nhs的摩尔比为1：1。

15、所述金属离子溶液中的金属离子为铁离子、铜离子、钙离子、锌离子、二价锰离子、铝离子的一种或几种按照任意比例混合而成。

16、 在所述的步骤s1中，所述的磷酸缓冲盐溶液ph 8.0，0.1mol/l；在所述的步骤s2中，所述的磷酸缓冲盐溶液的ph 5.0，浓度为0.1mol/l；在所述的步骤s3中，所述的tris-hcl缓冲液的ph 10.5，浓度为25 mg/ml。

17、本发明的优点是：声敏剂和线粒体呼吸链抑制剂的中空二氧化锰（h-mno2）纳米粒子可主动靶向乳腺癌细胞并释放两种药物，在肿瘤细胞内产生氧气同时减少氧气消耗，从而增强乳腺癌声动力治疗的效果。

18、将声敏剂和线粒体呼吸链抑制剂共负载在中空二氧化锰（h-mno2）纳米粒子后，以金属离子与单宁酸修饰的透明质酸交联的金属多酚网格构建ph响应型药物释放阀门得到一种可通过同时产氧与节氧联合增强声动力治疗乳腺癌效果的纳米粒子。该纳米粒子可以利用透明质酸主动靶向乳腺癌细胞，并具有优越的ph响应性释药能力，实现声敏剂的可控释放，达到声动力治疗乳腺癌的效果。同时载体中空二氧化锰纳米粒子可以在肿瘤细胞内原位催化细胞内高浓度双氧水（h2o2）产生氧气，同时所释放的线粒体呼吸链抑制剂可以抑制乳腺癌细胞线粒体呼吸减少氧气消耗，通过产氧与节氧联合高效增强乳腺癌声动力治疗的效果。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、本发明的优点之一是纳米粒子以金属离子与单宁酸修饰的透明质酸交联的金属多酚网格作为阀门，既可以利用透明质酸将药物主动靶向递送进入乳腺癌细胞中，又实现了药物在乳腺癌细胞中的ph响应性释放，增加了药物的生物利用度。

21、本发明的优点之二是利用中空二氧化锰包载声敏剂，载体中空二氧化锰纳米粒子可以在肿瘤细胞内原位催化细胞内高浓度双氧水（h2o2）产生声动力治疗所需氧气， 缓解肿瘤乏氧从而增强声动力治疗效果。

22、本发明的优点之三是同时包载声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂，利用所释放的线粒体呼吸链抑制剂减少线粒体对氧气的消耗，进一步增强声动力治疗乳腺癌的效果。

技术特征：

1.一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的可同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的步骤s1具体为：将中空二氧化锰纳米粒子分散于磷酸缓冲盐溶液中形成中空二氧化锰纳米粒子溶液，该中空二氧化锰纳米粒子溶液的浓度为1~3 mg/ml；同时，将声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂溶解于二甲亚砜中，溶解声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂的二甲亚砜浓度调整为2~3 mg/ml，然后对二甲亚砜进行磁力搅拌至充分溶解，之后滴加至中空二氧化锰纳米粒子溶液中，室温下搅拌12~24小时后，依次经过离心、磷酸缓冲盐溶液清洗后，重新分散于去离子水中，使中空二氧化锰纳米粒子溶液浓度为1~3 mg/ml。

3.根据权利要求1所述的同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的步骤s2具体为：

4.根据权利要求3所述的同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的步骤s3具体为：

5.根据权利要求2所述的一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，在所述的步骤s1中，所述中空二氧化锰纳米粒子的粒径为50~200 nm。

6.根据权利要求2所述的一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述声敏剂为司帕沙星、二氢卟吩e6、曙红、原卟啉、吲哚菁绿的一种或几种按照任意比例混合而成。

7.根据权利要求2所述的一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述线粒体呼吸链抑制剂为阿托伐醌、寡霉素、抗霉素a、鱼藤酮、安密妥、杀粉蝶菌素的一种或几种按照任意比例混合而成。

8.根据权利要求3所述的一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述透明质酸的分子量为1~100万。

9.根据权利要求3所述的一种同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述透明质酸单体与氨基化单宁酸的摩尔比例为1：0.1~1：0.2；所述透明质酸单体与edc的摩尔比例为1：1~1：2；所述edc和nhs的摩尔比为1：1；所述金属离子溶液中的金属离子为铁离子、铜离子、钙离子、锌离子、二价锰离子、铝离子的一种或几种按照任意比例混合而成。

10.根据权利要求4所述的可同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，其特征在于，在所述的步骤s1中，所述的磷酸缓冲盐溶液ph 8.0，0.1mol/l；在所述的步骤s2中，所述的磷酸缓冲盐溶液的ph 5.0，浓度为0.1mol/l；在所述的步骤s3中，所述的tris-hcl缓冲液的ph10.5，浓度为25 mg/ml。

技术总结
本发明涉及一种可同时产氧与节氧的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：S1、将中空二氧化锰纳米粒子同时包载声敏剂与线粒体呼吸链抑制剂，形成混合溶液；S2、制备单宁酸修饰的透明质酸；S3、将步骤S1制备的混合溶液与步骤S2制备的透明质酸溶液再次混合，滴加金属离子水溶液交联形成金属多酚网格，最终得到同时产氧与节氧的纳米粒子。本发明的优点是：声敏剂和线粒体呼吸链抑制剂的中空二氧化锰（H‑MnO<subgt;2</subgt;）纳米粒子可主动靶向乳腺癌细胞并释放两种药物，在肿瘤细胞内产生氧气同时减少氧气消耗，从而增强乳腺癌声动力治疗的效果。

技术研发人员：刘允,郭宁,王冠海,程帆,夏玉,刘理涵,崔燎
受保护的技术使用者：广东医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12