核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送的制作方法

本公开文本涉及用于在一个或多个细胞中瞬时激活温度敏感性剂(ts剂)的方法，例如通过使一个或多个细胞与ts剂接触并在允许温度下瞬时孵育细胞以诱导所述细胞中ts剂的活性。对于离体治疗策略，将一个或多个细胞在允许温度下用治疗性ts剂离体处理，随后在非允许温度(例如，受试者的正常核心体温)下将细胞转移到受试者。对于体内治疗策略，将治疗性ts剂递送至维持在允许温度下的受试者，从而允许所述治疗性ts剂在有限的时间内在体内起作用，然后当受试者的核心体温恢复正常时或当受试者的表面体温升高(例如，非允许温度)时，永久关闭ts剂。可替代地，将治疗性ts剂递送至受试者，随后通过将受试者的核心体温降低至允许温度以诱导受试者的细胞中治疗性ts剂的活性来瞬时激活ts剂。

背景技术：

1、将治疗性基因产物递送至人体细胞、组织和器官是巨大的挑战。对于需要持续表达基因以补充患者中基因缺陷的传统基因疗法，这已经通过使用病毒载体如逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒实现。然而，同样重要的策略基因疗法涉及基因的瞬时、短期表达。对于这样的应用，不需要基因的持续表达，并且实际上这可能对细胞有害。

2、例如，cas9是切割dna的细菌酶。它是基于crispr/cas9的基因编辑复合物的重要组分，其已被考虑用于基因疗法。指导rna和cas9均可由单个仙台病毒载体上的基因编码(park等人,2016)。为了在治疗上使用基因编辑系统，必须将含有crispr-cas9的载体引入人体细胞或人体内。然而，cas9的持续表达可导致dna断裂和突变的引入。因此，希望cas9在短时间内表达，例如，约数小时或数天，而不是一周或更长时间。

3、基因短期表达的另一个应用是用于细胞重编程。最近，已经表明一组转录因子的异位表达可以将细胞转化为治疗上有用的细胞类型。例如，一组三种转录因子可以将胰管细胞转化为分泌胰岛素的胰腺β细胞(zhou等人,2008)。另一组转录因子可以将成纤维细胞转化为心肌细胞(ieda等人,2010)。认为将这些转录因子体内递送至人体内可用作一种类型的再生医学。然而，希望使这些有效的改变细胞身份的转录因子仅瞬时表达，因为这些有效转录因子的持续表达可能造成损害。

4、如上述例子所强调的，使用导致基因持续表达的病毒载体的传统基因疗法可能是不希望的。对于基因产物的限时表达，已经开始使用将合成的或体外转录的mrna递送至细胞中(warren等人,2010)。然而，这些方法存在若干问题。例如，递送至细胞、组织和器官的mrna的量是有限的，因此，蛋白质产物的量可能不足以在体内产生具有生物学意义的效果。

5、此外，由于rna的快速更新(turn-over)，其通常仅持续最多12小时(warren等人,2010；goparaju等人,2017)，必须多次将合成的rna转染到细胞中。对于人多能干细胞如胚胎干细胞和诱导多能干细胞(ips)的强制分化，需要在几天的过程内每天转染两次(akiyama等人,2016；goparaju等人2017)。为了从人成纤维细胞生成ips细胞，必须持续超过两周每天转染合成rna的混合物(warren等人,2010)。这不仅麻烦，而且效率低。

6、对于ips细胞的生成，这个问题通过使用自我复制rna来解决，这使得仅在一次递送后能够长期表达(yoshioka等人,2013)。自我复制rna是单链rna，其通常通过去除编码病毒颗粒形成所需的结构蛋白的dna而从甲病毒(jose等人,2009)，例如委内瑞拉马脑炎病毒(veev)、辛德比斯病毒(sinv)和塞姆利基森林病毒(sfv)产生(petrakova等人,2005)。自我复制rna编码非结构蛋白(nsp)，所述非结构蛋白作为rna依赖性rna聚合酶来复制自我复制rna自身并产生用于翻译的转录物。自我复制rna也可包括编码目的蛋白的目的基因(goi)和其他遗传元件。由于其rna的正反馈产生，自我复制rna可以以高水平表达goi。可以将自我复制rna作为裸rna(即合成rna)或作为病毒颗粒递送至哺乳动物细胞，所述病毒颗粒可通过包装辅助细胞补充缺失的病毒结构蛋白而产生。

7、自我复制rna载体的优点是它们的自我复制特征，这导致goi表达水平的增强。然而，将rna/蛋白质递送至哺乳动物细胞的自我复制rna载体的缺点之一是它们的持续表达。通常，rna依赖性rna聚合酶和goi的正反馈产生会持续，这可导致用裸rna形式的自我复制rna转染或用病毒形式的自我复制rna感染的细胞死亡。

8、因此，基因疗法领域需要瞬时表达编码目的蛋白的goi的工具，例如治疗剂或外来抗原(例如病原体的抗原)。特别地，期望控制rna载体和自我复制rna的转录和翻译。

技术实现思路

1、基于目的基因(goi)限时表达的必要性，需要瞬时基因产物递送系统，其中核酸或蛋白质可以在体外或体内被递送至特定细胞或在特定细胞中表达，其中核酸/蛋白质的量足以具有生物学上有意义的效果，并且其中瞬时表达可以在实现生物学上有意义的效果后永久关闭。为了满足这些和其他需要，本公开文本涉及用于在受试者中(体内)或在培养的细胞中(离体)瞬时诱导温度敏感性剂(ts剂)如治疗性ts剂的活性的方法。在一些实施方案中，所述治疗性ts剂与温和的治疗性低体温组合使用。在其他实施方案中，所述治疗性ts剂与温和的治疗性高体温或局部加热组合使用。在一些实施方案中，所述ts剂是ts-rna分子或ts-蛋白质分子。在一些实施方案中，所述ts剂由插入温度敏感性病毒载体中的异源核酸或自我复制rna编码。在一些实施方案中，所述病毒载体选自但不限于仙台病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和α病毒载体。在一些实施方案中，所述自我复制rna包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子。在一些实施方案中，所述甲病毒选自但不限于委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。在一些实施方案中，所述目的基因产物不是zscan4。

2、本公开文本的上述和其他目的和特征将从以下参照附图进行的详细描述中变得更清楚。

技术特征：

1.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对抗原的免疫应答的组合物，所述组合物包含赋形剂和编码所述抗原的温度敏感性剂(ts剂)，其中所述ts剂是温度敏感性仙台病毒载体，并且其中所述ts剂能够在允许温度下表达所述抗原但在非允许温度下不表达所述抗原，且所述抗原是冠状病毒的刺突蛋白或其片段。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述冠状病毒是2019-ncov并且所述抗原包含所述2019-ncov的受体结合结构域(rbd)。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述允许温度是31℃至35℃，所述非允许温度是37℃±0.5℃。

4.一种用于在哺乳动物受试者中刺激针对抗原的免疫应答的组合物，其包含赋形剂和编码所述抗原的温度敏感性剂(ts剂)，其中所述ts剂是包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子的温度敏感性自我复制rna，并且其中所述ts剂能够在允许温度下表达所述抗原但在非允许温度下不表达所述抗原，且所述抗原是冠状病毒的刺突蛋白或其片段。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。

7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述冠状病毒是2019-ncov并且所述抗原包含所述2019-ncov的受体结合结构域(rbd)。

8.根据权利要求4所述的组合物，其中所述允许温度是31℃至35℃，所述非允许温度是37℃±0.5℃。

9.一种温度敏感性剂(ts剂)，其中所述ts剂是包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子的温度敏感性自我复制rna，且其中所述ts剂包含插入12-18个核苷酸的非结构蛋白编码区，所述插入导致非结构蛋白2(nsp2)的表达，所述nsp2在该nsp2的β片层5与β片层6之间包含4至6个另外的氨基酸。

10.根据权利要求9所述的温度敏感性剂，其中所述另外的氨基酸包含选自seq idno:38(gcgrt)、seq id no:39(tgaaa)和seq id no:40(lrphp)的一个序列。

11.根据权利要求9所述的温度敏感性剂，其中所述另外的氨基酸包含seq idno:39(tgaaa)的序列。

12.根据权利要求9所述的温度敏感性剂，其中所述nsp2的氨基酸序列包含选自seq idno:29-36的一个序列。

13.根据权利要求9所述的温度敏感性剂，其中所述ts剂编码病原体的抗原，且所述ts剂能够在允许温度下表达所述抗原但在非允许温度下不表达所述抗原。

14.根据权利要求13所述的温度敏感性剂，其中所述抗原是病毒抗原，且所述病毒抗原不是甲病毒抗原。

15.根据权利要求9所述的温度敏感性剂，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。

16.根据权利要求9所述的温度敏感性剂，其中所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。

17.根据权利要求9所述的温度敏感性剂，其中所述ts剂编码药剂，且其中所述ts剂能够在允许温度下表达所述药剂但在非允许温度下不表达所述药剂。

18.根据权利要求17所述的温度敏感性剂，其中所述允许温度是31℃至35℃，所述非允许温度是37℃±0.5℃。

19.根据权利要求18所述的温度敏感性剂，其中所述药剂包含蛋白质。

20.根据权利要求18所述的温度敏感性剂，所述药剂选自非编码rna、sirna、shrna和核酸内切酶编辑系统。

技术总结
本申请涉及核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送，具体涉及用于在一个或多个细胞中瞬时激活温度敏感性剂的方法，例如通过使一个或多个细胞与温度敏感性剂接触并在允许温度下瞬时孵育所述细胞以诱导所述细胞中温度敏感性剂的活性。另外，本公开文本涉及使受试者中的一个或多个细胞与温度敏感性剂接触，然后将所述受试者的核心体温降低至允许温度以诱导所述细胞中温度敏感性剂的活性的方法。本公开文本还涉及使受试者中的一个或多个细胞与温度敏感性剂接触从而将受试者的表面体温维持在允许温度以诱导所述细胞中温度敏感性剂的活性的方法。还公开了用温度敏感性治疗剂治疗受试者的方法。

技术研发人员：S·H·M·柯
受保护的技术使用者：伊利克斯根治疗公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13