一种口服酵母介导的产气荚膜梭菌α毒素重组DNA疫苗

本发明属于基因工程，涉及预防产气荚膜梭菌感染的免疫制剂，具体涉及一种靶向肠道树突状细胞(dcs)递送产气荚膜梭菌α毒素抗原基因的口服重组酵母dna疫苗。

背景技术：

1、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)广泛存在于自然界，是一种革兰氏阳性棒状厌氧菌，菌体呈现短杆状，没有鞭毛、无法运动、能形成孢子，在厌氧环境中生长状态良好，37℃～45℃为其最适的生长温度。产气荚膜梭菌的菌体表面能产生明显的荚膜，是一种条件性病原体，其分泌的肠毒素通过肠黏膜吸收，与人类的食源性疾病和动物疾病有关，可导致人体肌肉坏死(气性坏疽)、坏死性肠炎和食物中毒，以及在动物体内引起各种急性的胃肠道中毒，尤其在仔猪和羔羊中导致高发病率和高死亡率，给养殖业造成重大的经济损失。

2、产气荚膜梭菌分为a型、b型、c型、d型、e型、f型和g型，这7种类型的产气荚膜梭菌菌株都分泌α毒素(cpa)。α毒素是最基本、最重要的毒力因子，在产气荚膜梭菌致病过程中有着重要的作用。α毒素是一种含锌磷脂酶c，具有酶和毒素的双重性质，已被证实是引起气性坏疽和坏死性肠炎的主要毒素，能够破坏细胞膜，并引起溶血和组织坏死。另外α毒素也被称为鞘磷脂酶，能够水解神经鞘磷脂，从而导致膜结构紊乱。

3、以酵母作为载体的口服制剂，例如中国专利201310647359.3、202011262351.1，不仅能有效地将功能性核酸分子(shrna、表达载体)输送到黏膜免疫系统，以激活保护性黏膜乃至全身免疫反应，而且输送载体本身也安全无害。但对于产气荚膜梭菌感染而言，通过口服酵母以期有效的介导黏膜免疫反应和全身体液免疫反应、对机体提供安全保护，则并不容易实现，主要原因包括：用于表达抗原分子的dna需要借助酵母递送至抗原递呈细胞(apcs)，例如dc细胞，并在dc细胞中表达和抗原加工，该过程中载体的递送效率、载体表达后形成的抗原分子的呈递效率成为影响抗原免疫效果的重要因素。

4、目前已经公开的有关产气荚膜梭菌的基因工程疫苗主要包括以具有若干个氨基酸突变的毒素蛋白、毒素蛋白亚基或不同毒素的融合蛋白为有效成分的减毒或灭活免疫制剂，例如201811619231.5(涉及第176位组氨酸突变为天冬酰胺的α毒素)、202111141441.x(涉及包含α毒素c-末端结构域的融合蛋白)。而开发产气荚膜梭菌相应的dna或mrna疫苗仍属于技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种口服酵母介导的产气荚膜梭菌α毒素重组dna疫苗，增强经酵母递送的产气荚膜梭菌α毒素抗原基因在激活黏膜免疫反应、产生中和抗体中的效率。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、一种口服重组酵母免疫制剂，该免疫制剂包括酵母菌株以及由该酵母菌株携带的产气荚膜梭菌α毒素重组表达载体，所述重组表达载体包括用于编码突变的产气荚膜梭菌α毒素的突变型plc基因序列或用于编码截短的产气荚膜梭菌α毒素的截短型plc基因序列，所述突变型plc基因序列和截短型plc基因序列包括产气荚膜梭菌α毒素的c-末端结构域的编码序列。

4、优选的，所述突变的产气荚膜梭菌α毒素为第126位组氨酸突变为甘氨酸(即h126g)的产气荚膜梭菌α毒素。

5、优选的，所述截短的产气荚膜梭菌α毒素为产气荚膜梭菌α毒素的c-末端结构域。

6、优选的，所述重组表达载体还包括cmv启动子和polya尾，重组表达载体具有cmv启动子-突变型plc基因序列-polya尾的基因表达盒元件排列，或者重组表达载体具有cmv启动子-截短型plc基因序列-polya尾的基因表达盒元件排列。

7、优选的，所述重组表达载体是将突变型plc基因序列或截短型plc基因序列克隆到载体骨架而得到的。

8、优选的，所述载体骨架来源于酵母穿梭型表达载体jmb84-cmv，jmb84-cmv载体的核苷酸序列如seq.id.no.5所示。

9、优选的，所述酵母菌株为酿酒酵母。

10、优选的，所述重组表达载体通过醋酸锂转化法(liac)导入到酵母菌株中。

11、优选的，所述免疫制剂为dna疫苗、用于增强体液免疫(siga、igg)的佐剂或用于促进树突状细胞成熟的佐剂。

12、上述产气荚膜梭菌α毒素重组表达载体或口服重组酵母免疫制剂(如dna疫苗)在制备用于防治产气荚膜梭菌感染的药物中的应用。

13、优选的，所述药物用于预防动物(如猪、羊)急性胃肠道中毒。

14、本发明的有益效果体现在：

15、本发明提供的口服免疫制剂中，重组酵母可将其携带的产气荚膜梭菌α毒素重组表达载体于胃肠道环境进行靶向递送，从而通过激活免疫系统使机体高效产生相应的中和抗体，保护黏膜表面乃至整个机体免受产气荚膜梭菌感染引发的毒力作用。

16、进一步的，本发明采用的产气荚膜梭菌α毒素重组表达载体含有定点突变或截短的产气荚膜梭菌α毒素(第126位组氨酸突变为甘氨酸的产气荚膜梭菌α毒素，或截短的产气荚膜梭菌α毒素)的编码序列，可以在口服相应重组酵母后产生更高滴度的siga，以及更快地激活黏膜免疫和系统免疫。

技术特征：

1.一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：该免疫制剂包括酵母菌株以及由该酵母菌株携带的产气荚膜梭菌α毒素重组表达载体，所述重组表达载体包括用于编码突变的产气荚膜梭菌α毒素的突变型plc基因序列或用于编码截短的产气荚膜梭菌α毒素的截短型plc基因序列，所述突变型plc基因序列和截短型plc基因序列包括产气荚膜梭菌α毒素的c-末端结构域的编码序列。

2.根据权利要求1所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述突变的产气荚膜梭菌α毒素为第126位组氨酸突变为甘氨酸的产气荚膜梭菌α毒素。

3.根据权利要求1所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述截短的产气荚膜梭菌α毒素为产气荚膜梭菌α毒素的c-末端结构域。

4.根据权利要求1所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述重组表达载体还包括cmv启动子和polya尾，重组表达载体具有cmv启动子-突变型plc基因序列-polya尾的基因表达盒元件排列，或者重组表达载体具有cmv启动子-截短型plc基因序列-polya尾的基因表达盒元件排列。

5.根据权利要求1所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述重组表达载体是将突变型plc基因序列或截短型plc基因序列克隆到载体骨架而得到的。

6.根据权利要求5所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述载体骨架来源于jmb84-cmv载体，该载体的核苷酸序列如seq.id.no.5所示。

7.根据权利要求1所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述酵母菌株为酿酒酵母。

8.根据权利要求1所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述重组表达载体通过醋酸锂转化法导入到酵母菌株中。

9.根据权利要求1所述一种口服重组酵母免疫制剂，其特征在于：所述免疫制剂为dna疫苗、用于增强体液免疫的佐剂或用于促进树突状细胞成熟的佐剂。

10.一种产气荚膜梭菌α毒素重组表达载体或如权利要求1所述的口服重组酵母免疫制剂在制备用于防治产气荚膜梭菌感染的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种口服酵母介导的产气荚膜梭菌α毒素重组DNA疫苗，通过重组酿酒酵母靶向递送携带plc基因定点突变片段或截短后的C‑末端结构域片段的表达载体，随着该表达载体在树突状细胞内激活相应片段的转录和翻译，并由宿主机制呈递抗原，宿主机体的黏膜免疫反应激活，从而通过相应的中和抗体对产气荚膜梭菌引起的感染进行预防。

技术研发人员：徐坤,杨小军,张文强,杜丽宏,姚长长,麻啸涛,朱宇飞,贾邵娜,刘宇飞,蔡畅,赵霞芳,汪楚涵,单聪慧
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15