一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的H9亚型禽流感病毒亚单位疫苗及制备方法和应用与流程

本发明涉及一种h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗及制备方法和应用，更具体一点说，涉及一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗及制备方法和应用，属于基因工程与生物制药领域。

背景技术：

1、h9n2亚型禽流感病毒属于低致病性禽流感病毒，可以引起家禽的呼吸道症状、产蛋率、受精率下降等，并引起继发感染。大规模的感染不仅直接带来经济损失，而且为其他流感病毒提供了广泛的基因库，有研究显示h9n2能为h5n1、h1n1、h3n2、h5n2、h5n6、h7n7、h7n9与h10n8等提供了内部基因，这给下一次流感疫情的爆发带来潜在威胁。

2、目前商用疫苗主要以皮下注射或肌肉注射的形式免疫动物，容易出现应激反应，此外由于无法诱导高效的黏膜免疫，因此无法在病毒入侵呼吸道黏膜后的第一时间起到抗病毒作用，无法阻止禽流感病毒在呼吸道的复制。

技术实现思路

1、为了充分发挥黏膜的屏障作用，激活禽类高效的黏膜免疫系统，同时减少皮内注射、皮下注射带来的应激反应，本发明提供一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗及制备方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

4、1)筛选比对出一条同义ha序列，删除同义ha序列的胞内区与跨膜区，并在蛋白羧基末端添加t4噬菌体纤维蛋白中的三聚化foldon序列与his标签，获得重组基因片段seqid no:2；

5、2)将重组基因片段seq id no:2整合进入杆状病毒表达质粒后，利用sf9细胞表达三聚体ha蛋白；

6、3)对三聚体ha蛋白进行鉴定与纯化，在纯化后的三聚体ha蛋白内添加终浓度0.01-1mg/ml黏膜佐剂-poly(i:c)进行配置，获得亚单位疫苗。

7、优选的，一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗的制备方法，将合成的基因片段seq id no:2插入pfastbac1质粒，获得重组质粒pfastbac1-ha，用重组质粒pfastbac1-ha转化dh10bac感受态细胞，并通过蓝白斑筛选获得重组杆状病毒质粒。

8、本发明一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗，抗原蛋白为h9亚型禽流感病毒同义ha蛋白且包含有poly(i:c)黏膜佐剂。

9、优选的，抗原蛋白包括由seq id no:1所示氨基酸序列组成的蛋白质以及由seqid no:1所示氨基酸序列增加、缺失一个或多个氨基酸组成的蛋白质；

10、所述seq id no:1氨基酸序列：

11、mettslitillvvtvsnadkicigyqstnstetvdtltennvpvthakellltehngmlcatslgqplildtctiegliygnpscdlllegrewsyiverpsavnglcypgnvenleelrslfssarsyqriqifpdtiwnvsydgtstacsgsfyrsmrwltrkngnypiqdaqytnnqgknilfmwginhpptdttqtnlytrtdtttsvateeinrifkpligprplvnglmgrinyywsvlkpgqtlriksdgnliapwyghilsgeshgrilktdlkrgsctvqcqtekgglnttlpfqnvskyafgncskyigikslklavglrnvpsrssrglfgaiagfieggwsglvagwygfqhsndqgvgmaadrdstqkaidkitskvnnivdkmnkqyeiidhefsevetrlnminnkiddqiqdiwaynaellvllenqktldehdanvnnlynkvkralgsnavedgkgcfelyhkcddqcmetirngtynrrkyqeesklerqkiegvsgrlvprgspgyipeaprdgqayvrkdgewvllstflgsahhhhhh。

12、优选的，利用杆状病毒在昆虫细胞sf9中表达目的三聚体ha蛋白。

13、优选的，包含有终浓度0.01-1mg/ml的黏膜佐剂poly(i:c)。

14、本发明一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗的应用，包括在疫苗上的应用。

15、有益效果：能有效提升血清、支气管肺泡灌洗液与鼻腔灌洗液中的iga和igg抗体水平，能够充分发挥黏膜的屏障作用，既能激活禽类高效的黏膜免疫系统，也能减少皮内注射、皮下注射带来的应激反应。

技术特征：

1.一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：将合成的基因片段seq id no:2插入pfastbac1质粒，获得重组质粒pfastbac1-ha，用重组质粒pfastbac1-ha转化dh10bac感受态细胞，并通过蓝白斑筛选获得重组杆状病毒质粒。

3.一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：抗原蛋白为h9亚型禽流感病毒同义ha蛋白且包含有poly(i:c)黏膜佐剂。

4.根据权利要求3所述的一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：

5.根据权利要求3或4所述的一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：利用杆状病毒在昆虫细胞sf9中表达目的三聚体ha蛋白。

6.根据权利要求3所述的一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：抗原蛋白包括三聚体结构，三聚体结构的分子量大于250kda。

7.根据权利要求3所述的一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：包含有终浓度0.01-1mg/ml的黏膜佐剂poly(i:c)。

8.一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的h9亚型禽流感病毒亚单位疫苗的应用，其特征在于：包括在疫苗上的应用。

技术总结
本发明公开的是一种含有聚肌胞苷酸黏膜佐剂的H9亚型禽流感病毒亚单位疫苗及制备方法和应用，亚单位疫苗的抗原包括同义H9HA序列与三聚体Foldon序列，重组基因片段整合进入杆状病毒表达质粒后，利用细胞表达了三聚体HA蛋白，纯化后的蛋白添加终浓度0.01‑1mg/mL黏膜佐剂‑Poly(I:C)配置成疫苗，经过试验表明本发明疫苗能有效提升血清、支气管肺泡灌洗液与鼻腔灌洗液中的IgA和IgG抗体水平，能激活禽类高效的黏膜免疫系统，减少皮内注射、皮下注射带来的应激反应。

技术研发人员：冯华朋,朱顺帆,舒建洪,何玉龙,邬丽
受保护的技术使用者：浙江洪晟生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29