一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法及工具病毒载体

本发明属于核医学分子影像领域，具体而言，涉及一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法及工具病毒载体。

背景技术：

1、神经元活动的检测是神经科学研究一大重要内容。现有的用于检测神经元活动的神经科学工具主要包括以下几种：(1)全细胞膜片钳技术，通过特制玻璃微电极吸附于细胞膜表面形成高电阻的封接，破膜形成细胞与玻璃微电极的流通电路后，可通过该电流信号检测活体大脑或离体脑片的动作电位、自发突触后电流等；(2)钙成像技术，利用神经元放电出现短暂钙离子浓度升高这一特性，借助钙离子指示剂将神经元中的钙离子浓度转换成为荧光强度即可实现在体或离体的神经活动检测；(3)即时早期基因表达检测，即时早期基因(如c-fos)是细胞在外部刺激或最先表达的一组基因，在神经元兴奋活动中同样是最敏感的调节基因之一，可作为离体染色指标用于神经元的兴奋性检测；(4)影像学技术，氟[18f]-氟代脱氧葡萄糖(18f-fdg)正电子发射断层显像(pet)能够基于神经活动时糖代谢增加的机理，通过检测神经元对葡萄糖类似物18f-fdg的摄取反映其兴奋性。

2、现有的神经元活动检测工具在推动神经科学研究进步中发挥了巨大作用，但是，各个工具仍受到其本身方法固有的一些限制：(1)膜片钳方法主要用于急性脑片神经元兴奋性的离体检测，尽管近年在体膜片钳技术得到发展，也需要将玻璃微电极插入脑组织中，受到封接难度和检测脑区深度的限制；(2)钙成像技术需要将记录光纤插入至表达钙离子指示剂的部位进行信号采集，存在容易损伤脑组织、光纤难以长期固定维持等限制；(3)即时早期基因的表达只能通过离体染色实验进行检测；(4)影像学技术尽管具备活体无创成像优势，但是只能反映整个脑区所有细胞的神经活动，无法将其中特定类群细胞的信号进行区分，也容易受到许多其他非实验因素的干扰。

3、pet报告基因显像是一种间接成像策略，通过放射性示踪剂靶向在某一基因/蛋白启动子或增强子控制下表达的报告基因产物(通常为酶、转运体或受体)，可以实现同步表达的目标基因或蛋白的可视化评估，也能够用于间接反映报告基因所在细胞的位置和活性。在文献报道中，有研究者使用即时早期基因(如c-fos)作为启动子驱动荧光蛋白表达，用于标记特定情境刺激下兴奋的神经元，但是由于荧光蛋白自身光学性质的限制，相关检测同样只能离体进行。酪氨酸酶(tyr)是一种调控黑色素生成的限速酶，其转染表达能够驱动细胞产生黑色素。借助靶向黑色素的pet分子影像探针，tyr已经作为一种报告基因被用于心梗移植干细胞示踪、肿瘤治疗监测等多个领域。课题组前期研究发现，tyr和黑色素靶向探针18氟-吡啶酰胺-苯甲酰胺(18f-fpabza)可作为报告基因体系在神经系统应用。因此，我们使用即时早期基因(如c-fos)作为启动子驱动tyr报告基因表达，构建了一种新型的神经元活动状态活体检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法及工具病毒载体。

2、本发明通过以下技术方案用于实现神经环路的活体可视化成像目的：构建即时早期基因驱动tyr报道基因表达的工具病毒载体；在局部脑区注射构建的病毒载体使得该脑区神经元活动能够驱动tyr报告基因表达；tyr报道基因在细胞中催化酪氨酸经多步反应成为黑色素；通过pet分子影像检测黑色素，并通过黑色素表达评估神经元活动状态。

3、作为一个实施方案，所述工具病毒载体可以为腺相关病毒、慢病毒、腺病毒中的一种。

4、作为一个实施方案，所述tyr报道基因在细胞中的表达通过即时早期基因作为启动子驱动，包括c-fos启动子、e-sare启动子。

5、作为一个实施方案，所述酪氨酸酶的基因序列如序列1所示。

6、作为一个实施方案，所述酪氨酸酶的氨基酸序列如序列2所示。

7、作为一个实施方案，通过pet探针进行黑色素检测，所述pet探针需同时具有穿透血脑屏障及黑色素检测功能。

8、作为一个实施方案，pet分子影像探针可以为18f-fpabza，18f-fpabza具备良好的血脑屏障穿透能力，无需额外进行血脑屏障开放操作。

9、本发明提供的即时早期基因驱动tyr报道基因表达的工具病毒载体可用于活体可视化神经活动状态。

10、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

11、1、本发明提供的神经活动状态可视化的评估方法，无需在观测部位插入检测电极或光纤，可用于长期的影像监测。

12、2、本发明提供的神经活动状态可视化的评估方法，可应用于任意深度的脑区，不受成像深度限制。

13、3、本发明提供的神经活动状态可视化的评估方法，可通过注射位置、注射体积等因素的控制实现亚脑区神经活动状态检测。

14、4、本发明提供的神经活动状态可视化的tyr报道基因体系，可结合cre-loxp系统实现特定细胞类群神经元的神经活动状态检测。

技术特征：

1.一种可用于活体的可视化的神经元活动状态评估方法，其特征在于，所述方法包括：构建即时早期基因驱动酪氨酸酶(tyr)报道基因表达的工具病毒载体；在局部脑区注射构建的工具病毒载体使得该脑区神经元活动能够驱动tyr报告基因表达；酪氨酸酶报道基因在细胞中催化酪氨酸经多步反应成为黑色素；通过pet分子影像检测黑色素，并通过黑色素表达评估神经元活动状态。

2.根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法，其特征在于，所述工具病毒载体为腺相关病毒、慢病毒、腺病毒中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法，其特征在于，所述工具病毒载体携带即时早期基因作为tyr表达的启动子。

4.根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法，其特征在于，所述启动子选自c-fos启动子或e-sare启动子。

5.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法，其特征在于，工具病毒载体表达酪氨酸酶报道蛋白的基因序列包括如序列1所示序列。

6.根据权利要求1所述根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法，其特征在于，通过pet探针进行黑色素检测，所述pet探针需同时具有穿透血脑屏障及黑色素检测功能。

7.根据权利要求6所述根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法，其特征在于，所述pet探针为18f-fpabza。

8.一种可用于活体的可视化神经活动的工具病毒载体，其特征在于，所述工具病毒载体为即时早期基因驱动tyr报道基因表达的工具病毒载体，为腺相关病毒、慢病毒、腺病毒中的一种。

9.根据权利要求8所述的工具病毒载体，其特征在于，所述工具病毒载体携带即时早期基因作为tyr表达的启动子；所述启动子选自c-fos启动子或e-sare启动子。

10.根据权利要求8所述的工具病毒载体，其特征在于，工具病毒载体表达酪氨酸酶报道蛋白的基因序列包括如序列1所示序列。

技术总结
本发明公开一种可用于活体的可视化的神经活动状态评估方法及工具病毒载体。本发明构建的病毒载体在局部脑区注射后可在神经活动条件下利用即时早期基因的表达驱动酪氨酸酶(TYR)报告基因表达，酪氨酸酶能够在细胞中催化酪氨酸发生多步反应合成黑色素，使用靶向黑色素的核素标记探针，能够有效穿透血脑屏障靶向黑色素实现神经活动状态的活体可视化。该系统的构建为系列脑科学研究提供了一种强有力的研究工具。

技术研发人员：田梅,张宏,金晨涛,钟燕,周瑞,张晓辉,王菁,岑沛立
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15