酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法

本发明属于生物医药材料领域，涉及到酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，综合运用多种计算方法和手段筛选对γ-谷氨酰转移酶ggt、多种肿瘤高表达的氨肽酶apn、肿瘤成纤维细胞过表达的活化蛋白酶fap、浸润性肿瘤高表达金属基质蛋白酶mmp具有酶响应性的抗肿瘤药物输送聚合物载体。

背景技术：

1、恶性肿瘤的高效治疗一直是我国的重大需求。尽管肿瘤免疫治疗等新兴疗法不断涌现，化疗仍是临床治疗肿瘤的主要手段之一，并在其它治疗方法中发挥重要的辅助作用，但是存在毒副作用大、疗效有限等应用瓶颈。纳米药物技术是降低化疗毒副作用的重要手段。

2、国内外学者围绕提高纳米药物的临床疗效做了大量工作。分析纳米药物从血液向瘤内蓄积、渗透、细胞内吞和胞内药物释放的整个体内输送过程，发现纳米药物从肿瘤血管外渗和在肿瘤组织内渗透扩散是阻碍其发挥临床药效的两大瓶颈。目前，纳米药物在肿瘤内蓄积的理论基础仍是epr效应，即纳米药物通过肿瘤毛细血管壁的孔隙从血液被动扩散进入肿瘤组织。但近年来大量研究表明，临床患者肿瘤毛细血管的通透性远比动物模型的弱且呈现很强的异质性(因肿瘤分期、部位、癌种和患者而异)，导致纳米药物难以从血管外渗进入肿瘤组织。另一方面，肿瘤组织内具有细胞密度高、基质致密以及瘤内压高等病理特征，而纳米药物尺寸大、扩散系数小，使其在瘤内的扩散非常困难，无法将药物递送至远离血管的细胞。这两大瓶颈导致了目前临床纳米药物疗效低，也造成了大量新开发的纳米药物转化失败。

3、载体材料或纳米药物在细胞膜上的吸附是触发细胞内吞及随后转胞运的关键。合作团队(浙大申有青教授)在前期工作中发现，聚合物-喜树碱偶联物经细胞膜上的γ-谷氨酰转移酶(ggt)催化酰胺水解产生氨基并带上正电荷后可吸附在细胞膜上，聚合物-喜树碱偶联物通过快速的胞膜窖介导的内吞-外泌(转胞吞作用)，跨内皮的转运，进而发现，聚合物-喜树碱偶联物可均匀地分布于肿瘤组织，具有高效的肿瘤抑制活性(naturenanotechnology(2019)799–809)。不过，之前的实验表征酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体与蛋白酶的相互作用费时费力，从而导致很难在很大的空间范围内对酶响应抗肿瘤药物输送聚合物进行优化和筛选。

技术实现思路

1、针对上述背景技术存在的缺陷，本发明提供一种酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法。该方法在理性优化和设计酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体中可以准确的评估酶响应聚合物与蛋白酶的结合强度，提供一种计算机模拟的、相较实验更为省时省力的酶响应聚合物与蛋白酶的亲和力计算方法，是获得高效酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的新途径。

2、本发明采用以下技术方案：

3、一种酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，包括如下步骤：

4、(i)基于密度泛函理论的第一性原理，选用b3lyp泛函+6-31g基组，对各候选响应聚合物载体单体及其取代结构进行几何优化并计算其原子电荷，开发相应的全原子分子力场；

5、(ii)基于步骤(i)的全原子分子力场，批量化构建酶响应聚合物的力场；

6、(iii)采用分子对接和分子动力学研究酶响应聚合物与蛋白酶的结合模式；基于蛋白酶的力场进行分子动力学模拟，研究酶响应聚合物与蛋白酶的稳定构象；

7、(iv)采用增强采样的复本交换分子动力学模拟研究酶响应聚合物载体折叠的热力学行为及稳定构象；

8、(v)采用元动力学方法对比研究酶响应聚合物载体与蛋白酶的结合强度；

9、(vi)采用耦合量子力学/分子力场对比研究酶响应聚合物载体与蛋白酶的催化效率；

10、(vii)基于步骤(iii)-(vi)的计算结果筛选得到高效的酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体。

11、上述技术方案中，进一步地，步骤(i)中，所述密度泛函理论的第一性原理计算采用gaussian软件，所述全原子分子力场为通用amber力场，全原子分子力场的构建具体采用的软件为ambertools。

12、进一步地，所述步骤(iii)、(v)和(vi)中蛋白酶包括γ-谷氨酰转移酶ggt、多种肿瘤高表达的氨肽酶apn、肿瘤成纤维细胞过表达的活化蛋白酶fap、浸润性肿瘤高表达金属基质蛋白酶mmp，这些酶的力场采用amber14力场。

13、进一步地，步骤(iv)中，所述增强采样的复本交换分子动力学模拟采用溶质退火副本交换(rest)。

14、进一步地，步骤(v)中，所述元动力学方法采用well-tempered元动力学模拟，该方法可保证计算结果的平滑收敛。具体实现采用gromacs+plumed软件包实现。

15、本发明有益效果如下：

16、本发明方法创新性地综合将多种分子计算模拟技术进行有效整合，针对酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体，通过将不同计算方法的优点进行整合，系统性的对聚合物载体和蛋白酶的多方面性能进行研究，包括结合强度和催化效率等对酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体十分关键的性质。本发明方法是一种计算机模拟的、相较实验更为省时省力的酶响应聚合物与蛋白酶的亲和力和酶催化效率预测的计算方法，可作为高效获得酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的新途径。

17、本发明运用计算机建模酶响应聚合物载体，采用增强采样的复本交换分子动力学模拟研究酶响应载体折叠的热力学行为及稳定构象，采用元动力学算法计算酶响应聚合物载体与蛋白酶的结合强度；采用耦合量子力学/分子力场对酶响应聚合物库实现精准且泛用的结合亲和力筛选，从而设计筛选出高效酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体。

技术特征：

1.一种酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，其特征是，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，其特征是，步骤(i)中，所述全原子分子力场为通用amber力场。

3.根据权利要求1所述的酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，其特征是，步骤(iii)中，所述蛋白酶的力场采用amber14力场。

4.根据权利要求1所述的酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，其特征是，所述步骤(iii)、(v)和(vi)中蛋白酶包括γ-谷氨酰转移酶ggt、氨肽酶apn、活化蛋白酶fap、金属基质蛋白酶mmp。

5.根据权利要求1所述的酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，其特征是，步骤(iv)中，所述增强采样的复本交换分子动力学模拟采用溶质退火副本交换。

6.根据权利要求1所述的酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法，其特征是，步骤(v)中，所述元动力学方法采用well-tempered元动力学模拟。

技术总结
本发明公开了一种酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的高通量筛选方法。该方法为：基于密度泛函理论(DFT)的第一性原理对各候选响应聚合物载体单体及其取代结构进行几何优化并计算原子电荷，开发相应的全原子分子力场；基于原子分子力场，批量化构建酶响应聚合物的力场；研究酶响应聚合物载体与蛋白酶的结合模式及稳定构象、酶响应聚合物载体折叠的热力学行为及稳定构象、酶响应聚合物载体与蛋白酶的结合强度以及酶响应聚合物载体与蛋白酶的催化效率，基于上述研究结果筛选出适合于抗肿瘤药物输送的酶响应聚合物载体。该方法可作为高效获得酶响应抗肿瘤药物输送聚合物载体的新途径。

技术研发人员：周如鸿,黄建湘
受保护的技术使用者：上海浙江大学高等研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16