iPS细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体为一种ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用。

背景技术：

1、银屑病俗称牛皮癣,是一种常见的慢性、复发性炎性皮肤病,具有特征性皮肤病变。银屑病的皮损从开始到最终消退大致可分为3个时期：进行期、静止期和消退期。目前，银屑病的治疗主要采用局部疗法、光疗、维甲酸、免疫抑制药物、免疫调节剂、生物制剂和中药等。然而，由于银屑病的常规治疗效果仍不理想，因此迫切需要更新的方法。

2、细胞疗法已显示出对治疗银屑病有希望的效果。最近的研究表明，细胞疗法的治疗益处与其细胞外囊泡密切相关。细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是可由几乎所有细胞释放的一类脂质双层包裹的颗粒，可作为载体向邻近或远处目标细胞运输生物活性物质，通过这种细胞间通讯方式调控广泛的生理或病理反应。evs是一个总称，涵盖了通过多种机制产生的异质膜囊泡群。两个主要的evs亚群包括微泡(mv)和外泌体(exo)。近年的研究表明，evs穿梭在多种类型的细胞中，参与了银屑病、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、大疱性类天疱疮等慢性炎症性皮肤病和自身免疫性疾病的发病过程。

3、几乎所有类型的细胞都可以分泌evs,同时evs也广泛存在于体液中,包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等，然而用于临床试验和治疗的evs存在几大问题：(1)evs需求量巨大；(2)需要合适的供体并可能会对供体带来损伤；(3)不同来源的evs可能存在异质性；(4)不同来源的evs难以统一标准，这些问题都严重阻碍了evs的临床试验和治疗应用。而ipsc的特点是无限增殖和产生特化细胞谱系的潜力，诱导多能干细胞来源的细胞外囊泡(ipsc-evs)可以很好的解决以上问题，是临床治疗领域的新型evs来源。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，通过利用ipsc-evs的免疫调节作用为银屑病提供了一种有效的治疗方法，解决了上述背景技术中所提出的问题。

3、(二)技术方案

4、本发明提供如下技术方案：一种ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，包括如下操作：

5、s1、ipsc-evs的制备；

6、s2、ipsc-evs乳剂的配制；

7、s3、ipsc-evs的荧光标记；

8、s4、咪喹莫特imq诱导的银屑病小鼠模型；

9、s5、il-17、il-23和c5b-9测量分析；

10、s6、人体皮肤渗透试验。

11、优选的，所述s1中研究局部应用的ipsc-evs是否可以减轻银屑病相关的炎症；ipsc-evs通过连续超速离心从48小时孵育的ipsc条件培养基中分离；分离的ipsc-evs通过透射电子显微镜、蛋白质印迹分析和动态光散射等进行表征鉴定。

12、优选的，所述s2中ipsc-evs的水包油乳剂由下表中的成分组成；针对皮肤渗透率进行研究，将ipsc-evs用alexa fluor 488抗体标记试剂盒进行荧光标记，使用前，通过将混合物置于由管道连接的双注射器装置中乳化混合物，并通过交替推动注射器柱塞20次使一个注射器中的内容物以交替方式推入另一个注射器中进行混合。

13、优选的，所述s3中ipsc-evs用alexa fluor 488胺反应性荧光探针标记；将0.8mlpbs或0.8ml pbs中的1mg ipsc-evs与1mg alexa fluor 488荧光探针在体积为1ml的0.1m碳酸氢钠缓冲液中孵育1小时，同时轻轻摇动并避光。通过将两种混合物通过bio-gel p30聚丙烯酰胺凝胶柱，去除过量未反应的探针；分别代表标记ipsc-evs和标记对照的相应滤液通过0.22μm过滤器进行无菌过滤；标记的ipsc-evs或标记对照，用于如下所述的水包油乳剂中；用于外显率的乳剂的最终ipsc-evs浓度为0μg/ml ipsc-evs标签为对照乳剂，200μg ipsc-evs和400μg ipsc-evs。

14、优选的，所述s5中将皮肤样本解冻并在15ml试管中切成碎片，然后在2ml tris缓冲液中加10μl蛋白酶抑制剂在4℃中均浆2分钟；均浆后，将样品离心。

15、优选的，所述s6中将标记的ipsc-evs或标签对照水包油乳剂乳膏应用于人体皮肤外植体，以评估局部应用的ipsc-evs的外显率；使用的最终ipsc-evs浓度为0、200和400μgipsc-evs/ml乳剂。

16、优选的，在患者知情同意的情况下，从腹部整形手术中获得全层丢弃的人体皮肤；除去皮下组织/脂肪，仅保留由真皮和表皮组成的完整皮肤；之后，将皮肤在70％乙醇中浸泡2s以去除污染，在1×pbs中漂洗3min，然后置于37℃ co2的denova去污培养基中2hrs孵化器。

17、优选的，将皮肤外植体切成0.5x 2.5厘米的条带；条带的平均厚度为0.45±0.05cm，表面积为1.0cm2；将条带放置在6孔板的transwell可渗透支持物中，顶部上皮表面向上，空气-介质界面处保持1ml denova皮肤外植体介质。

18、优选的，使用阳性分配器移液器将20μl的pbs和20μl标签对照，或200或400μg/ml标记的ipsc-evs分别应用于条带的顶端表面；将条带在37℃培养箱中孵育0、12或24小时。

19、优选的，在每个培养期结束时，收集培养基并用pbs轻轻洗涤皮肤；将条带吸干，然后放入oct速冻培养基混合物中，在液氮中快速冷冻并切片；将3μm切片安装在载玻片上并进行苏木精和伊红染色(h&e)分析和荧光筛选。

20、与现有技术相比，本发明提供了一种ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，具备以下有益效果：

21、1、该ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，ipsc-evs解决了不同来源的evs可能存在异质性问题，不同来源的evs难以统一标准，这些问题都严重阻碍了evs的临床治疗。ipsc-evs是临床治疗领域的新型evs来源。

22、2、该ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，在咪喹莫特(imq)银屑病小鼠模型中局部应用ipsc-evs可显着降低小鼠皮肤中的il-17和终末补体激活复合物c5b-9。中性粒细胞浸润到角质层是银屑病的特征，中性粒细胞通过释放中性粒细胞(nets)是银屑病中il-17的主要细胞来源。我们提出局部应用的ipsc-evs抑制角质层中的补体激活，这减轻了nets从积聚在角质层内和角质层下的嗜中性粒细胞释放il-17。我们的数据通过利用ipsc-evs的免疫调节作用为银屑病提供了一种有前途的治疗方法。

技术特征：

1.一种ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：包括如下操作：

2.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：所述s1中研究局部应用的ipsc-evs是否可以减轻银屑病相关的炎症；ipsc-evs通过连续超速离心从48小时孵育的ipsc条件培养基中分离；分离的ipsc-evs通过透射电子显微镜、蛋白质印迹分析和动态光散射等进行表征鉴定。

3.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：所述s2中ipsc-evs的水包油乳剂由下表中的成分组成；针对皮肤渗透率进行研究，将ipsc-evs用alexa fluor 488抗体标记试剂盒进行荧光标记，使用前，通过将混合物置于由管道连接的双注射器装置中乳化混合物，并通过交替推动注射器柱塞20次使一个注射器中的内容物以交替方式推入另一个注射器中进行混合。

4.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：所述s3中ipsc-evs用alexa fluor 488胺反应性荧光探针标记；将0.8ml pbs或0.8mlpbs中的1mg ipsc-evs与1mg alexa fluor488荧光探针在体积为1ml的0.1m碳酸氢钠缓冲液中孵育1小时，同时轻轻摇动并避光；通过将两种混合物通过bio-gelp30聚丙烯酰胺凝胶柱，去除过量未反应的探针；分别代表标记ipsc-evs和标记对照的相应滤液通过0.22μm过滤器进行无菌过滤；标记的ipsc-evs或标记对照，用于如下所述的水包油乳剂中；用于外显率的乳剂的最终ipsc-evs浓度为0μg/ml ipsc-evs标签为对照乳剂，200μg ipsc-evs和400μg ipsc-evs。

5.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：所述s5中将皮肤样本解冻并在15ml试管中切成碎片，然后在2ml tris缓冲液中加10μl蛋白酶抑制剂在4℃中均浆2分钟；均浆后，将样品离心。

6.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：所述s6中将标记的ipsc-evs或标签对照水包油乳剂乳膏应用于人体皮肤外植体，以评估局部应用的ipsc-evs的外显率；使用的最终ipsc-evs浓度为0、200和400μg ipsc-evs/ml乳剂。

7.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：在患者知情同意的情况下，从腹部整形手术中获得全层丢弃的人体皮肤；除去皮下组织/脂肪，仅保留由真皮和表皮组成的完整皮肤；之后，将皮肤在70％乙醇中浸泡2s以去除污染，在1×pbs中漂洗3min，然后置于37℃ co2的denova去污培养基中2hrs孵化器。

8.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：将皮肤外植体切成0.5x 2.5厘米的条带；条带的平均厚度为0.45±0.05cm，表面积为1.0cm2；将条带放置在6孔板的transwell可渗透支持物中，顶部上皮表面向上，空气-介质界面处保持1ml denova皮肤外植体介质。

9.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：使用阳性分配器移液器将20μl的pbs和20μl标签对照，或200或400μg/ml标记的ipsc-evs分别应用于条带的顶端表面；将条带在37℃培养箱中孵育0、12或24小时。

10.根据权利要求1所述的ips细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，其特征在于：在每个培养期结束时，收集培养基并用pbs轻轻洗涤皮肤；将条带吸干，然后放入oct速冻培养基混合物中，在液氮中快速冷冻并切片；将3μm切片安装在载玻片上并进行苏木精和伊红染色h&e分析和荧光筛选。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，且公开了一种iPS细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，包括如下操作：S1、iPSC‑EVs的制备；S2、iPSC‑EVs乳剂的配制；S3、iPSC‑EVs的荧光标记；S4、咪喹莫特IMQ诱导的银屑病小鼠模型；S5、IL‑17、IL‑23和C5b‑9测量分析；S6、人体皮肤渗透试验。该iPS细胞来源的细胞外囊泡在治疗银屑病中的应用，iPSC‑EVs解决了不同来源的EVs可能存在异质性问题，不同来源的EVs难以统一标准，这些问题都严重阻碍了EVs的临床治疗。iPSC‑EVs是临床治疗领域的新型EVs来源，我们的数据通过利用iPSC‑EVs的免疫调节作用为银屑病提供了一种有前途的治疗方法。

技术研发人员：蔡艳,黎飞,孙智勇,王燕
受保护的技术使用者：珠海市乐维品牌管理有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16