一种仿生脂蛋白纳米盘的制备方法和应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种仿生脂蛋白纳米盘的制备方法和应用。

背景技术：

1、二十世纪以来，全球生活环境不断恶化、各类污染日趋加剧，围绕于人类周围的致癌因素日益剧增，肿瘤的发病率也逐年递增，癌症已然成为全球致死率最高的疾病之一。在种类众多的肿瘤中，多形性胶质母细胞瘤(gbm)是成人最为常见的颅内恶性肿瘤。gbm患者的中位生存期仅为12个月，生存率极低仅为5%。高能电离放射治疗(radiotherapy, rt)杀死肿瘤细胞是目前临床对gbm患者最大安全手术切除后的标准治疗方法。然而，放疗后获得的生存效果仍然不理想，并且在很大程度上受到低剂量放疗策略和肿瘤细胞dna修复反应的限制。因此，寻找有效的治疗方法来克服gbm的放疗耐药是迫切的临床需要。

2、rad51在肿瘤的dna dsb修复过程中起着关键作用，促进断裂和未断裂dna模板链之间的dna相关联，复制同源序列进行修复。与正常脑组织相比，rad51在gbm患者的胶质母细胞瘤组织中高度表达，rad51高表达的患者生存率较低。现目前，现有技术直接采用吉西他滨（gemcitabine，gem）药物，以抑制rad51的表达，但吉西他滨药物自身效果有限，因此，还仍需开发一种新药物，对吉西他滨进行优化和修饰，以提升其对rad51的抑制，进一步提升药效。

3、此外，部份现有技术会直接使用治疗药物，但由于人体存在代谢功能，会导致药物在未达到肿瘤处就提前进行释放，生物利用率低，治疗效果欠佳。因此，为提升疗效，另外一部分现有技术将药物负载于载体材料，来达到有效的控制释放。现目前，大部分研究会采用生物相容性高分子材料、纳米粒子、蛋白质纳米颗粒、聚合物微球等对药物进行包载，虽然一定程度上能够提高药物的生物利用度，但仍然存在药物靶向性低、载药率低及生物利用度低等问题。

4、综上，现目前吉西他滨药物对于rad51的抑制有限，且还存在药物靶向性低、载药率低、生物利用率低等问题，因此急需研发一种新药、设计一种新的供药平台，以提高药物的靶向性和生物利用度，进一步提升肿瘤的治疗效果。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，以进一步提升肿瘤的治疗效果。

2、本发明提供的基础方案为：一种仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，包括ng的制备和c-lng的制备，其中c-lng的制备包括下述步骤：

3、（1）将ccl5多肽和dspe-peg2000-mal溶解于dmf和三乙胺中，于室温下进行搅拌，然后用透析法纯化反应溶液，冷冻干燥得到白色固体粉末dspe-peg-ccl5；（本文所述的dspe是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的英文缩写，所述peg是聚乙醇的英文缩写，所述mal是马来酰亚胺的英文缩写，所述dmf是n,n-二甲基甲酰胺的英文缩写）

4、（2）取甲醇于烧瓶中，再将dppc、dspe-peg2000-ccl5和ng溶解于甲醇，再加入醋酸，蒸发至干燥，在烧瓶中形成薄膜；（本文所述dppc是二棕榈酰磷脂酰胆碱的英文缩写）

5、（3）再用超纯水将膜分散，用探针在冰浴中进行超声，然后在混合溶液中加入apoa1肽，进行热冷循环，得到c-lng，即本发明的仿生脂蛋白纳米盘（仿生脂蛋白纳米盘是一种盘状纳米粒，其内部包载了新药ng，纳米盘外部具有一圈缝隙，apoa1环绕于缝隙周围将其包住）。本发明中所述的ng是指发明人研发出的新药呋咱-吉西他滨的缩写。本文所述的c-lng，c指代的是趋化因子ccl5，l指代的是天然高密度蛋白hdl，而本申请的制备中采用的是apoa1，apoa1是hdl的主要蛋白成分。

6、本发明的工作原理及优点在于：

7、本发明对吉西他滨进行了优化和修饰，发明人研发出的新药ng，目前尚未见对此化合物的任何报道，且该药物对于肿瘤的治疗效果有显著提升。ng作为一种有效的放射增敏剂，通过干扰rad51病灶形成来抑制dna链延伸，切断与肿瘤生存益处相关的dna损伤修复途径来增敏放疗耐药，以扩大放疗疗效。同时，谷胱甘肽(gsh)触发的no供体偶联物释放的no可以与rt诱导的氧自由基(o2−)反应生成过氧亚硝酸基阴离子(onoo−)，这是一种强大的硝化和氧化剂。生成的onoo−不仅可以引起肿瘤细胞的脂质过氧化，同时还能抑制rad51的表达，与吉西他滨协作增强肿瘤的放疗，进一步提升药效和肿瘤的治疗效果。

8、本发明的c-lng具有双重靶向功能，靶向性极高，其中ccl5的自组织可以实现肿瘤靶向，形成趋化性驱动的给药系统；同时，天然高密度脂蛋白中的主要蛋白apoa1可与sr-bi结合，将药物递送至肿瘤组织，进一步增强靶向性。ccl5与apoa1的双重靶向，能够更精确地将ng药物运输至病灶处，降低药物在非病灶处的释放，不会导致药物在正常组织内聚集形成毒性作用，能够大幅度提升药效。

9、此外，apoa1不仅有促进靶向递送的功能，同时还作为本发明纳米盘的封口、捆绑物质，提高药物的生物利用度。ng药物被包载于纳米盘中，纳米盘外部具有一圈缝隙，极容易导致药物在运送过程中进行泄露，因此，apoa1环绕于缝隙周围将其包住，可以防止药物的泄露，提升其生物利用率。现有技术中一种物质一般只具有一种功能，而本申请的发明人在探索中发现apoa1具有双重功能，能够同时发挥多种作用，在药物的制备中降低了成本。

10、另外，现有技术中的盘状纳米粒包载效果差，载药率极低，而本申请的发明人在大量的实践和分析中发现，通过在c-lng的制备过程中加入醋酸，使得药物更加容易被成功包载，药物的包载效果更好，载药率更高。此外，纳米盘的过量使用，会对人体造成一定的副作用，因此在包载相同质量药物的情况下，本申请所使用的纳米盘数量更少，能够减少药物对人体带来的副作用或毒性反应，更有利于人体健康。

11、进一步，步骤（1）所述ccl5多肽质量为14-20 mg。

12、进一步，步骤（1）所述dspe-peg2000-mal质量为22-26 mg。

13、进一步，步骤（1）所述搅拌时间为16-28 h。

14、进一步，步骤（2）所述dppc、dspe-peg2000-ccl5和ng的重量比为6:3:1。

15、进一步，步骤（2）所述醋酸为0.1-0.5 ml。

16、进一步，步骤（3）所述超声时间为1-4分钟。

17、进一步，步骤（3）所述热冷循环温度为4℃~ 50℃。

18、采用本发明任一一种制备方法所制得的仿生脂蛋白纳米盘，涉及在肿瘤药物中的应用。

19、采用本发明任一一种制备方法所制得的仿生脂蛋白纳米盘，涉及在多形性胶质母细胞瘤中的应用。

技术特征：

1.一种仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，包括ng的制备和c-lng的制备，其特征在于，c-lng的制备包括下述步骤：

2.如权利要求1所述仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述ccl5多肽质量为14-20 mg。

3.如权利要求2所述仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述dspe-peg2000-mal质量为22-26 mg。

4.如权利要求3所述仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述搅拌时间为16-28 h。

5.如权利要求4所述仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述dppc、dspe-peg2000-ccl5和ng的重量比为6:3:1。

6.如权利要求5所述仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述醋酸为0.1-0.5 ml。

7.如权利要求6所述仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述超声时间为1-4分钟。

8.如权利要求7所述仿生脂蛋白纳米盘的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述热冷循环温度为4℃~ 50℃。

9.使用权利要求1-8任一所述的一种制备方法所制得的仿生脂蛋白纳米盘，涉及在肿瘤药物中的应用。

10.使用权利要求1-8任一所述的一种制备方法所制得的仿生脂蛋白纳米盘，涉及在多形性胶质母细胞瘤中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种仿生脂蛋白纳米盘的制备方法和应用，以提升肿瘤的治疗效果。本发明提供的仿生脂蛋白纳米盘的制备方法包括下述步骤：先将CCL5多肽和DSPE‑PEG2000‑mal溶解于DMF和三乙胺中，于室温下进行搅拌，然后用透析法纯化反应溶液，冷冻干燥得到白色固体粉末；再取甲醇于烧瓶中，将DPPC、DSPE‑PEG2000‑CCL5和NG溶解于甲醇，然后加入醋酸，蒸发至干燥，在烧瓶中形成薄膜；再用超纯水将膜分散，用探针在冰浴中进行超声，然后在混合溶液中加入ApoA1肽，进行热冷循环，得到C‑LNG。本发明对吉西他滨进行了优化和修饰，研发出的新药NG，对于肿瘤的治疗效果有显著提升，且C‑LNG的靶向性和载药率极高，能够进一步提升药物的药效。

技术研发人员：刘国栋,张志文,孙茂源,毛锦宁
受保护的技术使用者：重庆医科大学附属第二医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15