丝素融合蛋白在制备皮肤损伤外用产品中的应用

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种具有nt3活性的丝素融合蛋白及其在皮肤损伤修复中的应用。

背景技术：

1、随着组织工程、生物材料学等新兴学科的发展，越来越多的生物材料被用在皮肤损伤上。适合的修复皮肤损伤的生物材料应当能促进伤口愈合，减少疤痕的形成。目前，许多伤口敷料，包括水凝胶、无机复合微球以及功能性纳米纤维膜，已被设计用于伤口愈合。但是伤口愈合是一个非常耗时的过程，它会引起疼痛和进一步损伤，为了减少创面疼痛，加快创面愈合过程，设计创新的生物活性材料是很有必要的。天然生物材料，如壳聚糖、胶原蛋白、明胶、丝素等，均具有类似细胞外基质的结构，它们不仅细胞毒性低，有良好的细胞相容性，而且有较低的抗原性。天然的生物材料有利于诱导细胞增殖，迁移和分化，此外由于它们对细胞表面受体有特定的识别位点，因此不容易引起免疫排斥反应。丝素蛋白是一种不溶性的生物蛋白，在生物医学应用中有良好的生物相容性，它已被美国食品和药物管理局(fda)批准为人类医用生物材料。目前，丝素由于其生物相容性和生物降解性较慢，被广泛应用于组织工程支架。此外，丝素还可以通过促进胶原蛋白的重组来加速伤口的愈合。

2、神经生长因子家族，包括神经生长因子(ngf)、脑源性神经营养因子(bdnf)和神经营养因子-3 (nt-3)，已被证明在心血管发育中发挥关键作用。有文献报道，肌内注射nt-3可显著促进缺血肢体肌肉血管生成。血管生成是促进伤口愈合的关键步骤。

3、然而nt-3在损伤部位扩散迅速，寻找一种有效的方法保持nt-3在适当浓度是至关重要的。同时营养因子在体内的不稳定性以及有限的来源使得它们的使用受到了很大的限制。并且关于nt-3的研究大多集中于对神经元轴突再生的影响，促进脊髓损伤或是坐骨损伤的恢复，其在皮肤损伤方面还鲜有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种丝素融合蛋白，通过一段柔性linker链将神经营养因子nt-3与丝素轻链结合构成重组蛋白，此重组蛋白可与丝素蛋白发生自组装，形成一种能长时间发挥稳定作用的修复皮肤损伤的新型材料，此材料能够抑制炎症，促进三型胶原沉积，促进毛囊新生，使伤口无疤痕愈合。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种丝素融合蛋白，其氨基酸序列为：

4、mhhhhhhapsvtinqysdneiprdiddgkassvisrawdyvddtdksiailnvqeilkdmasqgdyasqasavaqtagiiahlsagipgdacaaanvinsytdgvrsgnfagfrqslgpffghvgqnlnlinqlvinpgqlrysvgpalgcagggriydfeaawdailassdssflneeycivkrlynsrnsqsnniaayitahllppvaqvfhqsagsitdllrgvgngndatglvanaqryiaqaasqvhvggggsggggsyaehkshrgeysvcdseslwvtdkssaidirghqvtvlgeiktgnspvkqyfyetrckearpvkngcrgiddkhwnsqcktsqtyvraltsennklvgwrwiridtscvcalsrkigrt（seq_1）。

5、在本发明中，上述蛋白的制备方法为：

6、（1）重组表达载体的构建：合成包含有丝素蛋白轻链以及nt-3的基因片段，连接至pet-30表达载体，完成重组表达载体的构建。

7、（2）重组蛋白的表达及纯化：将步骤（1）获得的重组表达载体转入bl21大肠杆菌，37℃诱导小试管表达并鉴定后放大表达及细胞收集，超声破碎，使用ni-nta纯化重组蛋白鉴定并检测。

8、上述丝素融合蛋白在制备外用产品中的应用。

9、进一步地，所述外用产品还包括再生丝素。

10、在本发明中，所述再生丝素的制备方法为：

11、步骤1，取桑蚕丝在0.5% nahco3溶液中煮沸脱胶；

12、步骤2，将脱胶的蚕丝纤维水洗后，溶解在cacl2、h2o和c2h5oh的混合液（摩尔比1:8:2）中，然后用蒸馏水透析，透析袋截留分子量约为12000-14000 da，冻干后得到再生丝素。

13、进一步地，所述外用制剂中，再生丝素和丝素融合蛋白的用量比为：每1 ml 0.2g/ml的再生丝素溶液中加入2 μl 100 μg/ml的丝素融合蛋白溶液。

14、一种外用制剂，包括上述丝素融合蛋白和再生丝素。

15、本发明所述的丝素融合蛋白和再生丝素，制成溶液后可直接涂抹或与常用于皮肤损伤的敷料混合后进行皮肤损伤的治疗，也可将混合溶液在四度冰箱晾干成膜得到具有nt-3活性的丝素蛋白膜，之后制成纱布或创口贴用于伤口治疗。

16、有益效果

17、本发明中所用到的主要材料为丝素蛋白，以及融合nt-3的丝素蛋白轻链，在制备过程中没有加入例如交联剂、表面活性剂等任何有毒、副作用的物质，因此具有良好的生物相容性。

18、本发明中所提供的皮肤损伤修复材料，引入了融合有nt-3的丝素蛋白轻链，保留了轻链的二硫键，并在nt3与轻链中间加入一段柔性linker链。在丝素溶液中丝素蛋白在自组装，nt-3将随着保留二硫键的丝素轻链一同被固定在丝素中，并且fibl-linker-nt3具有的柔性链，有利于nt3与其他nt3向不同方向结合。

19、在修复皮肤损伤过程中，通过伤口恢复情况的观察，丝素以及融合nt-3的丝素蛋白轻链处理后，显示出明显的促进伤口恢复，抑制伤口处的炎症，促进三型胶原沉积，增加血管面积，上皮长度以及新生毛囊个数，促进皮肤损伤向无疤痕愈合方向进行。

技术特征：

1.丝素融合蛋白在制备皮肤损伤外用产品中的应用，其特征在于，所述丝素融合蛋白其氨基酸序列为：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤损伤外用产品还包括再生丝素。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述再生丝素的制备方法为：

4.一种外用制剂，其特征在于，包括丝素融合蛋白和再生丝素，所述丝素融合蛋白的氨基酸序列为：

技术总结
本发明公开了丝素融合蛋白在制备皮肤损伤外用产品中的应用。所述的丝素融合蛋白是通过一段柔性linker链将神经营养因子NT‑3与丝素轻链结合构成，该丝素融合蛋白可与丝素蛋白发生自组装，形成一种能长时间发挥稳定作用的修复皮肤损伤的新型材料，此材料能够抑制炎症，促进三型胶原沉积，促进毛囊新生，使伤口无疤痕愈合。

技术研发人员：刘炎,严莹莹,刘梅,管徒晨,顾晓松
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16