一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料的制备方法与流程

本发明涉及脱细胞，具体为一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料的制备方法。

背景技术：

1、脱细胞羊膜基质材料是通过脱细胞工艺去除羊膜组织细胞而保留胶原蛋白支架结构的基质材料，由于其保留羊膜组织固有胶原蛋白支架结构、较低的免疫原性和良好的生物降解性,难以被人工合成材料所模仿,越来越受到人们的关注。脱细胞羊膜基质材料可广泛用于再生医学与组织工程领域，并且由于其可以采取多种形式，包括膜片、粉末和水凝胶，因此其用途日益广泛。

2、现有的脱细胞羊膜基质材料制备方法虽然能够获得无菌的脱细胞羊膜基质材料，但均会不同程度影响此类生物材料的微观结构及有效生物成分，为此，我们提出一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料的制备方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料的制备方法，解决了上述背景技术中提出的现有脱细胞羊膜基质材料制备方法，虽然能够获得无菌的脱细胞羊膜基质材料，但均会不同程度影响此类生物材料的微观结构及有效生物成分，因此不利于实际使用的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现。本发明第一方面提供一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料的制备方法，所述制备方法包括以下具体步骤：

3、a.将新鲜羊膜进行清洗和生物酶处理；

4、b.将处理后的羊膜材料置于超临界二氧化碳环境中脱除羊膜材料中的组织细胞成分、同时灭活微生物；

5、c.从超临界二氧化碳环境中取出脱细胞的羊膜基质材料，进行病毒灭活处理和深度清洗处理。

6、所述步骤a包括如下具体步骤：

7、步骤1清洗处理

8、新鲜羊膜的剥离和清洗，清洗后的羊膜材料置于超纯水、无菌水或生理盐水中浸泡20-30分钟，然后漂洗，获得洁净的羊膜材料；

9、步骤2酶处理

10、将清洗后的羊膜材料滤干，加入生物酶溶液，处理2-4小时后倒去生物酶溶液后清洗去除残留酶溶液。进一步地，所述清洗为加入超纯水、无菌水或生理盐水清洗。

11、所述生物酶为脂肪酶或胰酶。优选地，所述生物酶溶液进一步含有乙二胺四乙酸二钠。进一步地，所述生物酶为胰酶和乙二胺四乙酸二钠混合液。进一步地，羊膜材料与胰酶溶液比例为1:3-5。更进一步地，所述胰酶溶液中胰酶浓度为0.25％，乙二胺四乙酸二钠浓度为10mm。更进一步地，胰酶和乙二胺四乙酸二钠混合液处理条件为37℃恒温水浴酶解2-4小时。

12、所述步骤b包括如下具体步骤：

13、步骤3超临界二氧化碳处理

14、将清洗后的羊膜材料置于双层透气灭菌袋内后放入超临界二氧化碳萃取釜中，加入超临界二氧化碳携带剂，通过高压泵泵入二氧化碳气体，保持压力至9.3-15mpa，温度保持在33-37℃，流量0.08-0.15升/分钟保持1-2小时，最后以0.4-0.8mpa/10分钟的速率将萃取釜内压力降低至常压，打开萃取釜取出灭菌袋直接进入病毒灭活步骤或封口后-80℃冻存待需要时解冻后再进入病毒灭活处理步骤。优选地，通过高压泵泵入二氧化碳气体，保持压力至9.9±0.48mpa，温度为35±0.7℃，流量0.1±0.02升/分钟保持时间60±5分钟，然后以0.4-0.8mpa/10分钟的速率将萃取釜内压力降低至常压。进一步地，所述超临界二氧化碳携带剂为0.02％(v/v)过氧乙酸、0.05％(v/v)过氧化氢、0.8％v/v无菌水。

15、所述灭菌处理即为病毒灭活处理。

16、所述病毒灭活所使用的病毒灭活剂选自过氧乙酸、过氧化氢、过氧辛酸、乙醇溶液中的一种或几种。进一步地，所述病毒灭活剂选自0.02％(v/v)过氧乙酸、0.05％(v/v)过氧化氢、0.02％过氧辛酸或8％乙醇的一种或几种。进一步地，病毒灭活剂处理时间为4-6小时。

17、所述步骤c包括如下具体步骤：

18、步骤4病毒灭活

19、使用病毒灭活剂处理步骤b获得的产物。

20、步骤5深度清洗

21、将步骤4处理后的羊膜材料用超纯水、无菌水和生理盐水清洗，清洗后剪成碎片，然后与超纯水、无菌水和生理盐水混合形成浆料，再离心去除细胞残渣获得除杂后的羊膜材料。

22、步骤6干燥

23、滤干/压干步骤5处理好的组织材料，放真空干燥机或冷冻冻干机中干燥。

24、步骤7粉碎

25、干燥后的脱细胞羊膜基质材料用液氮研磨机研磨，过筛，获得基质微粒；优选地，所述基质微粒粒径为50-500微米。

26、步骤8成品罐装

27、将筛选好的微粒称量，然后将微粒灌注入容器。

28、步骤9终端灭菌

29、采用低剂量辐照进行终端灭菌。进一步地，采用钴60或电子束进行终端辐照灭菌。优选地，电子束灭菌剂量为5kgy到30kgy，更优选地，灭菌剂量为5kgy。

30、所述制备方法进一步包括：

31、步骤10相容性检测

32、取适量灭菌后的脱细胞羊膜基质材料，用pbs、生理盐水或细胞培养基37℃,72±2h浸提，浸提后高速离心10分钟，取上清过滤后作为待测样本，鉴定检测脱细胞羊膜基质体外细胞生物相容性，确保脱细胞羊膜基质生物相容性符合预设标准。

33、本发明第二方面提供根据本发明第一方面任一所述制备方法制备得到的脱细胞羊膜基质材料。

34、本发明提供了一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料及其制备方法，具备以下有益效果：

35、该高生物相容性脱细胞羊膜基质材料采用羊膜组织为制备原料，有利于形成高生物相容性脱细胞羊膜基质，细胞脱除后能够在有效去除抗原物质的同时，确保生物材料的理化性质不受影响。脱细胞羊膜基质材料是组织细胞生长、增殖和分化的理想载体，基于脱细胞羊膜基质材料引导的组织修复，形成正常组织，相比于动物源性或者人工合成类的材料，生物相容性更好，免疫原性更低，能够更好地与原有受损组织融合并诱导原位组织修复，适用于各种人体软组织缺损和创伤的修补、受损和薄弱组织的强化。脱细胞人羊膜基质材料可用于面部软组织填充、关节腔注射、子宫内膜修复、女性盆底重建等。

36、该高生物相容性脱细胞羊膜基质材料在制备的过程中，采用生物酶与超临界二氧化碳技术相结合的处理工艺。生物酶的作用是消化蛋白从而降低细胞膜通透性，超临界二氧化碳处理是通过使细胞内外环境酸化、以及使细胞复制必须的蛋白失活，从而发挥灭活细胞和微生物功效。生物酶与超临界二氧化碳相结合处理组织细胞，可降低生物酶的使用量，并可缩短生物酶的处理时长。引入超临界二氧化碳流体技术，可大大降低终端辐照灭菌所需要的辐照剂量，且更好的保持了组织原有的结构，进一步提高了生物相容性；并且在干燥粉碎后进行相容性检测，确保脱细胞羊膜基质生物相容性符合预设标准。

技术特征：

1.一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a包括如下具体步骤：

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物酶为脂肪酶或胰酶。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超临界二氧化碳处理的压力9.3-15mpa，温度为33-37℃，流量0.08-0.15升/分钟保持1-2小时，最后以0.4-0.8mpa/10分钟的速率降低至常压。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b包括如下具体步骤：

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活所使用的病毒灭活剂选自过氧乙酸、过氧化氢、过氧辛酸、乙醇溶液中的一种或几种。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c包括如下具体步骤：

8.如权利要求1-7任一所述制备方法制备得到的脱细胞羊膜基质材料。

技术总结
本发明公开了一种高生物相容性脱细胞羊膜基质材料的制备方法，涉及脱细胞技术领域。该高生物相容性脱细胞基质材料采用产妇分娩后被作为废弃物的新生儿羊膜组织为制备原料，采用生物酶与超临界二氧化碳流体技术相结合对组织材料进行脱细胞、灭菌和病毒灭活处理，可大大降低终端辐照灭菌所需要的辐照剂量，更好的保留脱细胞羊膜基质材料的天然组织微观结构及有效生物成分，进一步提高了生物相容性。

技术研发人员：汤苏阳,张美荣,李一佳,石洋,郑莉莉
受保护的技术使用者：华夏（青岛）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16