一种高效清除细胞污染的方法

本发明涉及生物，具体涉及一种高效清除细胞污染的方法。

背景技术：

1、细胞培养技术已有近百年历史，细胞培养中的污染主要包括以下几种类型：细菌和真菌污染、病毒污染、其他细胞污染和化学物质污染。为了减少细胞培养中的污染问题，科研人员和生产厂家可以采取一系列预防措施，包括无菌操作、细胞鉴定、经常更换培养基、使用合格的试剂和培养基、处理废弃物等，但是，细胞或组织培养的污染问题依然是科研工作者面临的一个大问题。

2、“黑胶虫”污染现象是细胞培养中一类常见且严重的污染问题，“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”污染具有以下特点: (1)“黑胶虫”在高倍镜下呈现明显的运动性，有丛集性。(2)通常可以通过0.22 μm滤膜，常规换液对其无效。(3)与其他生物体的污染相比，它不使培养液浑浊，也不明显改变其ph值。(4)能够还原四唑盐（mtt）形成蓝色结晶物，说明它具有线粒体或是原核微生物。

3、支原体（mycoplasma）污染是细胞培养中另一类常见且严重的污染问题。支原体是一类最小的无细胞壁细菌，也可通过细菌滤器，导致支原体污染很难预防。它们可以寄生在动物和人类的细胞培养物中，可在细胞表面寄生，也可能侵入细胞内寄生，而且对细胞的生长、代谢和功能产生严重影响。支原体污染通常由以下几种途径引入细胞培养中，源头细胞污染、试剂和培养基污染、实验室环境、操作人员等。支原体污染对细胞培养的影响包括但不限于以下几点，细胞生长受阻、细胞形态改变、细胞代谢异常、基因表达变化等。

4、目前解决细胞或组织培养中污染的常用方法主要包括以下几种：（一）、使用抗生素，对于支原体污染，常用的解决方法是使用特定的抗生素，如环丙沙星、红霉素、四环素等，以抑制和清除支原体，但是，这些抗生素可能需要较长时间的处理，并且对于某些耐药性支原体株效果较差；（二）、使用抗真菌剂，对于真菌或霉菌污染，常用的解决方法是使用抗真菌剂，如两性霉素b（amphotericin b）等。但是这类抗真菌剂通常对培养的动植物细胞有一定的毒性；（三）、细胞冻存和筛选，将受到污染的细胞冻存，并进行筛选，以筛选出没有污染的细胞株。这是一种比较彻底的处理方法，但是，这种方法可能会耗费较多时间和资源；（四）、清洁和消毒，在细胞培养过程中，保持实验室环境的清洁并定期对实验器材进行消毒，可以预防和减少“黑胶虫”或支原体污染。

5、然而，以上方法在解决细胞和组织培养中的“黑胶虫”、支原体或真菌污染时存在一些缺陷：（一）、耐药性问题，支原体dna易发生变异，在药物的筛选作用下，一些支原体株可能会对抗生素产生耐药性，导致抗生素清除污染的效果不佳；（二）、影响细胞健康：某些抗生素、抗支原体剂或者抗真菌剂可能对细胞本身造成毒性，影响细胞的健康和生长；（三）、处理时间较长：对于某些污染，特别是支原体污染，需要较长时间的处理和筛选，影响实验的进度和时间安排；（四）、重复感染：如果根本原因没有得到彻底解决，细胞可能会再次受到“黑胶虫”、支原体或真菌污染。

6、因此，在解决细胞和组织培养中的“黑胶虫”、支原体或真菌污染的问题时需要探索一种新的方法或者手段。

技术实现思路

1、为了高效解决细胞和组织培养中的“黑胶虫”、支原体或真菌等污染的问题，我们提出了一种高效清除细胞污染的方法，包括如下步骤：

2、用清洗液清洗被污染细胞；

3、将聚六亚甲基双胍盐溶液加入培养基，将所述培养基加入被污染细胞的培养器皿后置于恒温培养箱进行培养；

4、清洗细胞后，加入细胞培养基，培养6～24小时

5、观察细胞污染情况是否消除，若否，重复上述步骤。

6、较佳的，所述聚六亚甲基双胍盐为聚六亚甲基双胍盐酸盐或聚六亚甲基双胍磷酸盐。

7、较佳的，所述聚六亚甲基双胍盐溶液的工作浓度为2～5 ppm。

8、较佳的，所述聚六亚甲基双胍盐贮存溶液的溶剂为去离子水、生理盐水、缓冲液或细胞培养基。

9、较佳的，所述聚六亚甲基双胍盐溶液经滤膜或过滤器过滤除菌。

10、较佳的，所述恒温培养箱的温度为25℃～37℃。

11、较佳的，所述恒温培养箱的培养时间为1～24 h。

12、较佳的，所述清洗液为细胞培养基、生理盐水或缓冲液。

13、较佳的，所述缓冲液为细胞等渗的磷酸缓冲液或hepes缓冲液。

14、较佳的，所述清洗数次为2 ～4次。

15、本发明提供的高效清除细胞污染的方法，对细胞或组织培养中的微生物污染，尤其是“黑胶虫”和支原体污染具有高效的杀灭和清除作用，有效成份聚六亚甲基双胍（phmb），是一种广泛用于抗菌和消毒的化合物，具有很好的广谱抗菌性能，对多种细菌、真菌和包膜病毒都有较强的杀灭和抑制作用，且phmb不易导致细菌和真菌产生耐药性，在适当浓度下处理细胞和组织培养，不会对培养细胞产生毒性，phmb的抑菌效率高，只需要短时间处理细胞，即可快速清除微生物污染。

技术特征：

1.一种高效清除细胞污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，所述聚六亚甲基双胍盐为聚六亚甲基双胍盐酸盐或聚六亚甲基双胍磷酸盐。

3.如权利要求1所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，所述加入细胞的聚六亚甲基双胍盐溶液的工作浓度为2～5 ppm。

4.如权利要求1所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，所述聚六亚甲基双胍盐贮存溶液的溶剂为去离子水、生理盐水、缓冲液或细胞培养基。

5.如权利要求1所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，所述聚六亚甲基双胍盐溶液经滤膜或过滤器过滤除菌。

6.如权利要求1所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，所述恒温培养箱的温度为25℃～37℃。

7.如权利要求1所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，所述恒温培养箱的培养时间为1～24 h。

8.如权利要求1所述的清除细胞污染的方法，其特征在于，所述清洗液为细胞培养基、生理盐水或缓冲液。

9.如权利要求4或8所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，所述缓冲液为细胞等渗的磷酸缓冲液或hepes缓冲液。

10.如权利要求1所述的高效清除细胞污染的方法，其特征在于，用清洗液清洗被污染细胞的次数为2～4次。

技术总结
本发明公开一种高效清除细胞污染的方法，包括如下步骤：用清洗液清洗被污染细胞；将聚六亚甲基双胍盐溶液加入培养基，将所述培养基加入被污染细胞的培养器皿后置于恒温培养箱进行培养；清洗细胞后，加入细胞培养基，培养6～24小时观察细胞污染情况是否消除，若否，重复上述步骤。本方法抑菌效率高，成本低廉，且不会对细胞产生任何负效应。

技术研发人员：郑怀信,姬建生,索菲亚·好·郑,轩小燕,谢沛原,王鹏
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15