一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用的制作方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用。

背景技术：

1、蜱是一种常见的动物体表寄生虫，也是多种动物疾病的传播媒介。褐黄血蜱（ haemaphysalis flava）属于硬蜱科血蜱属，可寄生在犬、猫、山羊、刺猬、野猪以及鸟类体表，同时它也是危害野生大熊猫的优势蜱种。据报道褐黄血蜱能够携带立克次体（ rickettsia rickettsii）、贝氏柯克斯体（ coxiella burnetii）、埃氏疏螺旋体（ borrelia  afzelii）和无形体（ anaplasma）等诸多病原体，引起宿主或人类感染多种疾病，对动物和人类健康造成极大威胁。化学防控是控制蜱和蜱传疾病有效方法，但大量使用化学药物可导致耐药蜱的产生以及环境的污染问题，相比之下抗蜱疫苗更加环保并且能有效减少蜱的数量，是替代化学杀虫剂控制蜱感染和病原传播的有效方法。

2、av422蛋白是一种保守蜱唾液腺蛋白，其能在蜱的吸血过程中起到抑制血液凝固的作用，并且av422蛋白是蜱虫体内独有的一种蛋白，在其它节肢动物和脊柱动物体内没有同源物，这可能意味着当该蛋白作为疫苗靶向抗原时，对脊椎动物宿主可能不会产生副作用。有研究发现篦子硬蜱（ ixodes ricinus）重组蛋白rirav422能够与感染过网纹革蜱（ dermacentor reticulatus）的大鼠血清和有过蜱虫感染史的猎犬和人血清发生交叉反应，表明av422蛋白具备交叉免疫反应性特征。

3、有研究报道长角血蜱（ haemaphysalis longicornis）甘肃株p27/30基因的核苷酸序列和氨基酸序列与长角血蜱日本okayama株、长角血蜱四川孤雌生殖株均存在差异，推测蜱株的地域性分布差异可能导致虫株之间的氨基酸序列存在一定的差异。因此，加大褐黄血蜱唾液腺蛋白hfav422在抗蜱疫苗中的研究对动物保护和人类健康有重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，褐黄血蜱唾液腺蛋白制备的抗蜱疫苗能够明显提高动物体内特异性igg抗体水平，并能同时引起th1型和th2型免疫反应，具有良好的抗蜱效果，并且对脊椎动物宿主无副作用。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，褐黄血蜱唾液腺蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、进一步，编码褐黄血蜱唾液腺蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明还提供一种抗蜱疫苗，包括褐黄血蜱唾液腺蛋白。

5、本发明还提供一种褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，包括以下步骤：

6、（1）提取褐黄血蜱的总rna作为模板进行反转录，得cdna；

7、（2）设计引物，以步骤（1）所得cdna为模板进行pcr扩增，得褐黄血蜱唾液腺蛋白基因；

8、（3）将步骤（2）所得褐黄血蜱唾液腺蛋白基因插入pmd19-t载体，转化至dh5α感受态细胞，得阳性克隆菌；

9、（4）将步骤（3）所得阳性克隆菌进行扩大培养并提取质粒，然后酶切获得目的基因片段，再用t4连接酶连接表达载体，得重组载体；

10、（5）用步骤（4）所得重组载体转化bl21感受态细胞，并通过诱导剂iptg诱导表达；

11、（6）对诱导表达的蛋白质进行纯化，得褐黄血蜱唾液腺蛋白。

12、进一步，步骤（2）中，引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。

13、进一步，步骤（4）中，表达载体为pet32a(+)。

14、进一步，步骤（5）中，感受态细胞为bl21感受态细胞。

15、综上所述，本发明具有以下优点：

16、1、将褐黄血蜱唾液腺蛋白应用于抗蜱疫苗，能够明显提高动物体内特异性igg抗体水平，并能同时引起th1型和th2型免疫反应，具有良好的抗蜱效果。

17、2、av422蛋白具备交叉免疫反应性特征，本发明褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法制备的褐黄血蜱唾液腺蛋白rhfav422，具有开发为控制不同蜱种的抗蜱疫苗的潜力。

18、3、av422蛋白是蜱虫体内独有的一种蛋白，在其它节肢动物和脊柱动物体内没有同源物，本发明褐黄血蜱唾液腺蛋白rhfav422作为疫苗靶向抗原，对脊椎动物宿主不会产生副作用。

19、4、使用抗蜱疫苗诱导宿主产生针对蜱虫和蜱媒病原体感染的免疫保护是一种经济有效的替代方法，可以减少化学杀虫剂的使用和耐药蜱的产生，将褐黄血蜱唾液腺蛋白应用于抗蜱疫苗既能直接预防蜱类的感染，又能通过蜱摄取宿主体内的抗体与蜱体内靶蛋白相互作用后破坏靶蛋白的功能，从而影响蜱的摄食、蜕皮和繁殖来控制蜱的数量。

技术特征：

1. 一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，其特征在于，所述褐黄血蜱唾液腺蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述褐黄血蜱唾液腺蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种抗蜱疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白。

4.一种权利要求1所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。

6.如权利要求4所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述表达载体为pet32a(+)。

7.如权利要求4所述的褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述感受态细胞为bl21感受态细胞。

技术总结
本发明公开了一种褐黄血蜱唾液腺蛋白在抗蜱疫苗中的应用，涉及生物工程技术领域，褐黄血蜱唾液腺蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该褐黄血蜱唾液腺蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种包括褐黄血蜱唾液腺蛋白的抗蜱疫苗，以及一种褐黄血蜱唾液腺蛋白的制备方法。褐黄血蜱唾液腺蛋白制备的抗蜱疫苗能够明显提高动物体内特异性IgG抗体水平，并能同时引起Th1型和Th2型免疫反应，具有良好的抗蜱效果，并且对脊椎动物宿主无副作用。

技术研发人员：刘颂蕊,岳婵娟,范雪阳,侯蓉,齐敦武,马锐,古江,张东升,李运莉,张洪文
受保护的技术使用者：成都大熊猫繁育研究基地
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16