肠毒素脂质体及其在制备抗肿瘤药中的应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种肠毒素脂质体及其在制备抗肿瘤药中的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤又称为癌症，是人类死亡的主要原因之一。虽然随着现代医疗科技的发展，部分恶性肿瘤疾病可以得到有效治疗、缓解，甚至治愈，但还是有大量的癌症无法得到有效治疗，最终导致死亡。肿瘤和免疫的关系非常密切。许多癌症的产生和身体免疫平衡被打破有关。增强身体免疫功能有助于抗肿瘤治疗。目前临床癌症的主要治疗方案有放疗、化疗、手术治疗、免疫治疗等，其中化疗是临床上采用的最主要方式，但患者耐受性低，毒副作用较大，治疗效果有限。免疫治疗是新兴的一种癌症治疗策略，具有很高的临床应用价值。肺癌一直是所有癌症类型中发病率和死亡率排在前3名的癌症。同时，肺器官也是许多恶性肿瘤发生转移的“靶器官”。

2、金黄色葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌产生的一种细菌超抗原，也是超抗原药物的主要成分。肠毒素具有极强地刺激t淋巴细胞增殖的能力，这种刺激导致大量细胞因子(如tnf-α、il-2、ifn-γ)释放，广泛激活cd4+和cd8+t细胞的产生，发挥细胞毒作用，具有广泛的抗肿瘤和促进骨折和骨愈合的功能。以肠毒素为主要成分的金葡素注射液(批准文号：s19990010)已在中国上市，但是该药物具有成分不明、副作用过大、免疫刺激过强的缺点，用于抗肿瘤治疗时容易引发“炎症风暴”和免疫细胞耗竭，阻碍了其临床应用。

3、脂质体是一种现代药物剂型，是由磷脂和胆固醇通过分子自组装形成的内外均为水相的双分子层膜囊泡，粒径一般为几百纳米，用于包裹药物可获得靶向、缓释等效果，有助于药效的发挥和减少药物的毒副作用。目前已上市的脂质体药物包括两性霉素b脂质体、阿霉素脂质体等。

技术实现思路

1、本发明针对肠毒素治疗癌症副作用大、治疗效果不佳的问题，提供一种肠毒素脂质体及其在制备抗肿瘤药中的应用。肠毒素脂质体用于治疗癌症，可降低其副作用，提高治疗效果。

2、本发明中的肠毒素脂质体由脂质体包裹肠毒素形成，包含磷脂、胆固醇、肠毒素。

3、本发明中的肠毒素脂质体的粒径选自50nm～1000nm，优选自100nm～600nm，更优选自200nm～500nm。

4、肠毒素脂质体中各成分的比例没有限制，只要满足使用的要求和治疗要求就可以。肠毒素脂质体中肠毒素含量选自0.01％～0.5％质量比，优选自0.02％～0.2％质量比，更优选自0.03％～0.1％质量比。

5、本发明中的肠毒素选自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)产生的全部类型的肠毒素，包括肠毒素a、肠毒素b、肠毒素c，优选的是肠毒素c。肠毒素c选自肠毒素c1、肠毒素c2、肠毒素c3，优选的是肠毒素c2。肠毒素的来源包括细菌裂解物提取、基因工程菌发酵提纯。

6、本发明中的磷脂选自猪肺磷脂、牛肺磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、胆固醇、脑磷脂、胆固醇乙酰脂、蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、硬脂酰胺，优选自卵磷脂、大豆磷脂、胆固醇、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱，更优选自猪肺磷脂、牛肺磷脂、卵磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的一种或几种，优选自猪肺磷脂、牛肺磷脂、卵磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的一种或几种，进一步优选自猪肺磷脂、卵磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、胆固醇中的一种或几种，更优选自猪肺磷脂、蛋黄卵磷脂、胆固醇中的一种或几种。

7、肠毒素脂质体中磷脂和胆固醇的比例选自100∶1～2∶1质量比，优选的是10∶1～4∶1质量比。

8、肠毒素脂质体中除了磷脂、胆固醇、肠毒素外，还可以添加其他附加剂，用于稳定、抗氧化等作用，具体品种不受限制，如维生素e、十八胺。

9、肠毒素脂质体制备方法选自薄膜分散法、逆相蒸发法、冻干空白脂质体重建法，优选冻干空白脂质体重建法。这些制备方法可以参考相关专业书籍和文献，由专业技术人员设计和操作完成，得到稳定的肠毒素脂质体混悬液。本发明肠毒素脂质体的制备步骤没有限制，只要获得相应的肠毒素脂质体就可满足本发明的要求。本发明优先采用冻干空白脂质体重建法制备肠毒素脂质体。由于肠毒素是水溶性蛋白质，该方法能够避免肠毒素接触有机溶剂而变性造成药效下降，保持了肠毒素的活性。

10、当使用冻干空白脂质体重建法制备肠毒素脂质体时，制备方法包括如下步骤：

11、(1)使用有机溶剂溶解磷脂和胆固醇，旋转蒸发除去有机溶剂，得到均匀的薄膜，加入水相成分进行水化，加入冻干保护剂后冻干得到空白脂质体；

12、(2)将肠毒素水溶液和步骤1中得到的空白脂质体混合后进行孵育，得到肠毒素脂质体。

13、在上述制备方法中，步骤(1)中的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙醚、异丙醚、乙醇，优选的是乙醚；步骤(1)中的旋转蒸发条件为温度控制在30℃～50℃范围，旋转速率为20rpm～100rpm，优选温度控制在35℃～45℃，旋转速率为20rpm～30rpm；步骤(1)中水化用磷酸盐缓冲溶液的ph选自7.0～8.0，优选的是7.4；步骤(1)中的冻干保护剂为甘露醇；步骤(1)中甘露醇和蛋黄卵磷脂的质量比选自2～5∶1，优选自2.5～3.5∶1，最优选的为3∶1；步骤(2)中的肠毒素溶液为肠毒素溶于磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)；步骤(2)中肠毒素水溶液的浓度选自0.1～1mg/ml，优选自0.2～0.3mg/ml，最优选的为0.25mg/ml。步骤(2)中的孵育条件为温度30℃～45℃、时间20～40min，优选温度控制在35～40℃、时间25～35min，最优选的为温度37℃、时间30min。

14、本发明中的肠毒素脂质体，可用于治疗各种癌症，特别是肺癌。动物药效研究证明，本发明公开的肠毒素脂质体尾静脉注射后肺部药物分布增多，对肺癌的治疗效果好。

技术特征：

1.一种肠毒素脂质体，其特征在于可用于治疗肺癌。

2.如权利要求1所述的肠毒素脂质体，其特征在于肠毒素脂质体含有以下组分：肠毒素、脂质。

3.如权利要求1所述的肠毒素脂质体，其特征在于肠毒素脂质体的粒径为50nm～1000nm。

4.如权利要求1所述的肠毒素脂质体，其特征在于肠毒素脂质体制备方法选自薄膜分散法、逆相蒸发法、冻干空白脂质体重建法。

5.如权利要求2所述的肠毒素脂质体，其特征在于脂质选自猪肺磷脂、牛肺磷脂、卵磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱。

6.如权利要求2所述的肠毒素脂质体，其特征在于肠毒素选自金黄色葡萄球菌产生的全部类型肠毒素。

7.如权利要求2所述的肠毒素脂质体，其特征在于肠毒素的来源选自细菌裂解物提取、基因工程菌发酵提纯。

8.如权利要求1所述的肠毒素脂质体，其特征在于肠毒素脂质体的制备采用如下步骤：取20mg蛋黄卵磷脂和4mg胆固醇加入5ml无水乙醚溶解，37℃水浴条件下25rpm旋蒸除去有机溶剂，形成均匀的淡黄色薄膜，37℃水浴条件下加入ph7.4的pbs溶液水化30min，所得乳液依次通过0.45μm和0.22μm滤膜除去杂质，加入60mg甘露醇作为冻干保护剂，进行冻干得到空白脂质体，将2ml浓度为250μg/ml的肠毒素溶液加入到上述空白脂质体中，37℃孵育30min，即得肠毒素脂质体。

技术总结
本发明公开了肠毒素脂质体及其在制备抗肿瘤药中的应用，属于生物医药技术领域。本发明中的肠毒素脂质体通过静脉注射给药后具有治疗肺癌的作用，且疗效相较肠毒素溶液更好、肺部分布更多、副作用更小。本发明采用冻干空白脂质体重建法冷制备肠毒素脂质体，从而更好保持肠毒素的高级结构，保证其生物活性更优。药效研究证明，肠毒素脂质体通过激活免疫细胞发挥抗肿瘤活性，治疗肺癌效果好。

技术研发人员：袁伯川,金义光,杜丽娜,严秋成,张锋,李章玉
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15