多靶性NK细胞及其基于肿瘤细胞膜的诱导方法与流程

本发明涉及nk细胞，尤其涉及一种多靶性nk细胞及其基于肿瘤细胞膜的诱导方法。

背景技术：

1、现有的细胞疗法car-t存在一定的局限性，首先，car的制备需要理想的“肿瘤抗原”。“肿瘤抗原”是car-t细胞识别肿瘤细胞，并对其进行精准打击的关键，但目前在实体瘤中可选择的抗原极其有限。仅有少数几个靶点具有成为car-t细胞疗法靶点的能力。

2、其次，car-t细胞疗法可能造成较为严重的副作用，会产生细胞因子风暴（crs）与移植物抗宿主病（gvhd）。因此，其应用通常需要住院严密观察，且对医疗团队提出了较高的要求。

3、第三，目前car-t细胞疗法的制备依赖于患者自身的淋巴细胞，有极强的个体性，基本上一个人只能用自己的car-t细胞产品。一方面，car-t细胞疗法的量产和普及受到了一定限制；另一方面，若患者自身无充足的淋巴细胞储备，则无法进行car-t细胞制备，从而无法接受car-t细胞治疗。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种多靶性nk细胞，所述多靶性nk细胞应用于制备或治疗肿瘤细胞的药物组合物中。

2、根据本发明提供的多靶性nk细胞，所述肿瘤细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、直结肠癌细胞、白血病细胞、骨癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞或膀胱癌细胞中的一种。

3、本发明还提供一种多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，包括如下步骤：

4、s1：制备含有肿瘤细胞膜的培养液；

5、s2：将肿瘤患者nk细胞置于所述含有肿瘤细胞膜的培养液中进行培养，获得多靶性nk细胞。

6、根据本发明提供的多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，所述s1步骤包括如下步骤：

7、s11：通过胰酶消化收集肿瘤细胞，并使用pbs清洗所述肿瘤细胞；

8、s12：将所述肿瘤细胞置于细胞裂解缓冲液中，进行吹打混匀，在3~4℃下保存12~16h，获得肿瘤细胞悬浊液；

9、s13：将所述肿瘤细胞悬液置于超声细胞破碎仪中进行超声10~15min，获得第一上清液；

10、s14：将所述第一上清液置于离心管中，进行离心，获得第二上清液；将所述第二上清液置于另一离心管中，进行离心，获得第一细胞沉淀；

11、s15：将所述第一细胞沉淀进行重悬后，进行离心，获得第二细胞沉淀；

12、s16：将所述第二细胞沉淀进行重悬后，利用bca定浓度，获得含有肿瘤细胞膜的培养液。

13、根据本发明提供的多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，所述裂解缓冲液的制备方法为：将nahco3和edta置于mill q超纯水中，进行搅拌，获得第一混合溶液，将pmsf置于所述第一混合溶液中，获得所述裂解缓冲溶液。

14、根据本发明提供的多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，所述s2步骤包括如下步骤：

15、s21：获取患者外周血，将所述患者外周血和淋巴分离液按照1:1~1:1.5进行混合，离心后获得分离血液层；

16、s22：将nk reagent包被液和dpbs加入至所述分离血液层中，进行离心，获得血浆层和淋巴层pbmc；

17、s23：将所述血浆层进行离心，获得灭活自体血浆；

18、s24：将所述淋巴层pbmc置于dpbs中，进行离心，弃去上清，获得下层悬浊液，将dpbs悬浊细胞加入所述下层悬浊液中，进行多次离心，获得nk细胞悬液；

19、s25：将所述灭活自体血浆加入至所述nk细胞悬液中，获得所述肿瘤患者nk细胞；

20、s26：将所述肿瘤患者nk细胞置于所述含有肿瘤细胞膜的培养液中进行培养14天，获得多靶性nk细胞；

21、其中，培养期间需要向所述含有肿瘤细胞膜的培养液中加入il-2，并进行换液。

22、本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果之一：

23、1.本发明提供的一种多靶性nk细胞及其基于肿瘤细胞膜的诱导方法，不需要基因编辑工序，通过提取特定肿瘤细胞的细胞膜，即可诱导nk细胞具备多靶性杀伤特定肿瘤细胞的能力。

24、2.本发明提供的一种多靶性nk细胞及其基于肿瘤细胞膜的诱导方法，其诱导用细胞膜可以是患者自体，也可以是异体，甚至可以是细胞系来源。大大提高了肿瘤细胞治疗的规模化和经济化。

25、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种多靶性nk细胞，其特征在于，所述多靶性nk细胞应用于制备或治疗肿瘤细胞的药物组合物中。

2.根据权利要求1所述的多靶性nk细胞，其特征在于，所述肿瘤细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、直结肠癌细胞、白血病细胞、骨癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞或膀胱癌细胞中的一种。

3.一种如权利要求1-2任一项所述的多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，其特征在于，所述s1步骤包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，其特征在于，所述裂解缓冲液的制备方法为：将nahco3和edta置于mill q超纯水中，进行搅拌，获得第一混合溶液，将pmsf置于所述第一混合溶液中，获得所述裂解缓冲溶液。

6.根据权利要求3所述的多靶性nk细胞基于肿瘤细胞膜的诱导方法，其特征在于，所述s2步骤包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及NK细胞技术领域，提供一种多靶性NK细胞及其基于肿瘤细胞膜的诱导方法，不需要基因编辑工序，通过提取特定肿瘤细胞的细胞膜，即可诱导NK细胞具备多靶性杀伤特定肿瘤细胞的能力，并且其诱导用细胞膜可以是患者自体，也可以是异体，甚至可以是细胞系来源。大大提高了肿瘤细胞治疗的规模化和经济化。

技术研发人员：欧来良,蒋新邦,王泉川
受保护的技术使用者：天津康赛诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1