亮绿SF淡黄在制备新冠病毒抑制剂中的应用

本发明属于生物医药，具体涉及亮绿sf淡黄在制备新冠病毒抑制剂中的应用。

背景技术：

1、虽然基因工程疫苗、mrna疫苗、腺病毒活载体疫苗和灭活疫苗等的上市有效地阻断了sars-cov-2的大流行并显著地降低了covid-19重症发病率和死亡率，但自2020年底以来，sars-cov-2毒株持续出现了多种突变和变异，其中就有三种变异株被列为“关注变异株”(variant of interest，voi)：eg.5变异株，xbb.1.5变异株和xbb.1.16变异株。由于变异株免疫逃逸能力增强，使其在全球流行毒株中的占比增长较快，展现出更强的传播优势。既往感染产生的中和抗体对部分变异株的中和能力出现降低。人们对“病毒免疫逃逸”感到担忧。因此，领先于病毒变异和另一种传播的步伐是很重要的。迫切需要开发普适的、新的冠状病毒疫苗和药物。

2、在新冠病毒蛋白中，核衣壳蛋白是病毒体的核心成分。它与病毒基因组rna结合，将rna包装成一个核糖核蛋白复合物。除了组装，核衣壳蛋白还具有其他功能，包括在病毒mrna转录和复制、细胞骨架组织和免疫调节中发挥作用。特别是，sars-cov-2的核衣壳蛋白已被发现通过其双链rna结合活性作为rna沉默的病毒抑制剂来对抗宿主rnai介导的抗病毒反应。使其成为诊断和疫苗药物开发的关键目标。

3、sars-cov-2核衣壳蛋白是一种结构异质的、419个氨基酸长的、多域的rna结合蛋白。和其他新冠病毒一样，sars-cov-2核衣壳蛋白同样有两个保守的、独立折叠的结构域，称为n端域(n-terminal domain，ntd)和c端域(c-terminal domain，ctd)。这两个结构域由一个称为中央连接区(central linking region，lkr)的内在无序区(inherentlydisordered region，idr)连接。lkr包括一个富含ser/arg(sr)的区域，其中包含推定的磷酸化位点。此外，冠状病毒的n端域和c端域两侧通常有两个idr，它们被称为n-臂和c-尾。ntd负责rna结合，ctd负责rna结合和二聚体化，idr负责调节ntd和ctd的rna结合活性和低聚体化。

4、由于核衣壳蛋白的rna结合活性对病毒的核糖核蛋白复合物形成和基因组复制至关重要，阻断n端域的rna结合已被证明是开发抗病毒药物的良好策略。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明通过计算机辅助设计与筛选得到一种对sars-cov-2核衣壳蛋白与病毒rna结合过程具有抑制作用的化合物，并通过生物学实验对抑制效果进行了验证。

2、本发明所筛选的化合物为亮绿sf淡黄(light green yellowwish)，其结构式如式(i)所示(分子式为c37h37n2nao9s3，分子量为772.88，cas号为5141-20-8)，

3、

4、本发明中化合物的筛选和效果验证步骤如下：

5、(1)计算机辅助设计与筛选

6、利用计算机辅助药物分子设计平台moe(molecular operating environment)进行sars-cov-2抑制剂筛选。对接模块选择基于结构的vs(sbvs)。选择sars-cov-2核衣壳蛋白的n-末端结构域作为受体蛋白，pdb id为7cdz2。受体的分子结合部位选择在残基f53、s105、r107、y109、y111和r149附近。在此之后，所有的化合物都通过与“诱导匹配”(inducedfit)协议的灵活对接进行了排序。对接后，通过moe中的指纹簇模块对化合物进行结构聚类，最终确定潜在的抑制剂。

7、(2)分子生物学实验验证

8、①sars-cov-2核衣壳蛋白原核表达

9、通过基因合成构建核衣壳蛋白表达载体，为了促进核衣壳蛋白的可溶表达，在核衣壳蛋白氨基端融合表达类泛素蛋白(small ubiquitin-like modifier，sumo)。构建成功的表达载体标记为pet28a-sumo-n。将表达载体pet28a-sumo-n转入大肠杆菌感受态细胞bl21中，利用表达载体的卡那霉素抗性筛选阳性菌。挑取阳性菌到含卡那霉素的液体lb培养基中，通过iptg诱导表达核衣壳蛋白，最终收集菌体，将菌体暂时保存在-80℃，备用。

10、②sars-cov-2核衣壳蛋白纯化

11、超声破碎菌体，破碎液中加入聚乙烯亚胺(pei)，使核酸沉淀去除。随后离心，收集上清液。向上清液中缓慢加入配制好的饱和(nh)2so4溶液，静置后离心。收集含sars-cov-2核衣壳蛋白的沉淀。随后将沉淀的蛋白重新溶解，通过透析去除残留的pei和(nh)2so4。最后，通过镍柱纯化核衣壳蛋白。

12、③生物膜干涉技术(bio-layer interferometry,简称bli)

13、(3)利用生物膜干涉技术实时监测sars-cov-2核衣壳蛋白和小分子抑制剂之间是否有相互作用以及相互作用的强弱。

14、本发明还公开了一种新冠病毒抑制剂，新冠病毒抑制剂包括如式(i)所示的化合物。

15、进一步，新冠病毒抑制剂还包括药学上可接受的盐。

16、本发明的有益效果是：本发明以sars-cov-2核衣壳蛋白的n-末端结构域为靶点，通过建模、虚拟筛选、对接和分子动力学等计算手段筛选潜在化合物，并通过生物学实验进行验证，最终筛选到了表现出较高结合亲和力的小分子抑制剂亮绿sf淡黄，所筛选出的化合物能够通过抑制sars-cov-2核衣壳蛋白与病毒rna的结合过程来抑制sars-cov-2的复制，从而实现新冠治疗的目的。

技术特征：

1.亮绿sf淡黄在制备新冠病毒抑制剂中的应用，所述亮绿sf淡黄的结构式如式(i)所示；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制剂为新冠病毒核衣壳蛋白rna结合抑制剂。

3.一种新冠病毒抑制剂，其特征在于：包括如式(i)所示的化合物。

4.根据权利要求3所述的新冠病毒抑制剂，其特征在于：还包括药学上可接受的盐。

技术总结
本发明公开了亮绿SF淡黄在制备新冠病毒抑制剂中的应用，属于生物医药技术领域。本发明以SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白的N‑末端结构域为靶点，通过建模、虚拟筛选、对接和分子动力学等计算手段筛选潜在化合物，并通过生物学实验进行验证，最终筛选到了表现出较高结合亲和力的小分子抑制剂亮绿SF淡黄，所筛选出的化合物能够通过抑制SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白与病毒RNA的结合过程来抑制SARS‑CoV‑2的复制，从而实现新冠治疗的目的。

技术研发人员：张树军,陈晨,张正福,夏艺
受保护的技术使用者：西南医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15