一种有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管及其制备方法

本发明涉及人工血管，尤其涉及一种有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管及其制备方法。

背景技术：

1、心血管疾病是人类健康的第一杀手，其发病率和致死率远高于其他疾病。血管移植是治疗心血管疾病的有效手段之一。临床上，包括乳内动脉、桡动脉和大隐静脉在内的自体血管是进行血管移植的金标准，但是大约30％的患者由于血管来源有限和尺寸不匹配等原因，没有合适的自体血管可用。

2、组织工程技术的发展为人体血管缺损修复和重建提供了新的解决方案，组织工程血管是一种用组织工程学方法构建的具有良好生物相容性和力学特性的血管替代物。目前已经有部分组织工程血管进行了临床试验，其中最具代表性的是美国耶鲁大学的laurae.niklason教授课题组。他们将血管平滑肌细胞(smcs)种植在聚乙醇酸(pga)管状支架上，经过一定时间的培养，pga降解，smcs分泌细胞外基质填充空隙，形成由细胞和细胞外基质构成的血管材料，经过脱细胞处理后，降低其免疫原性，得到仅有脱细胞基质构成的组织工程血管材料，这种组织工程血管在大动物外周动脉搭桥、动静脉造瘘和心脏搭桥等模型中展现了较好的血管再生能力，具有较好的临床应用前景。目前，由该方法制备的6mm直径的血管材料已经植入肾透析患者手臂部位，用于血液透析，临床实验结果显示该血管材料具有较好的内皮和smcs再生。但是，该血管材料动物或人体植入后还有一定的血栓形成情况。此外，利用这一方法制备的血管材料需要在体外培养smcs达8周之久，不仅增加了制造成本，还容易因为细胞染菌而失败，而且需要复杂的动态培养设备，这些在一定程度上限制了其临床应用。

3、相比于上述体外组织工程，利用体内组织工程技术构建人工血管是一种更为简便、快捷的方法，其原理是利用机体对外源物产生自发的免疫包裹反应。传统的方法是将管状物植入宿主皮下，待组织包裹完成后，进行脱细胞处理，得到细胞外基质人工血管，但是该血管力学强度不足，无法维持管状结构，不易缝合，而且植入动脉系统易出现血管膨胀和吻合口狭窄。为此，我们在管状接收器上制备聚合物熔融纺丝纤维骨架，将其作为模板植入动物皮下，利用宿主对外源物自发的免疫包裹反应，完成对模板材料细胞化与细胞外基质的沉积，取出已被组织包裹的模板材料，移除管状接收器，经脱细胞处理，即可制备出由聚合物纤维骨架与脱细胞的细胞外基质构成的生物型复合人工血管材料，实现脱细胞基质优异生物相容性与聚合物材料良好力学性能的有效整合。该生物型人工血管在一些动物血管移植实验中展现了良好的通畅性和再生性，但是反映出如下2个需要改进的方面：1.血管材料的抗凝血性需要提高，例如该血管作为小口径人工血管进行猪心脏搭桥时，出现了一定概率的血栓；2.血管内皮和平滑肌的再生速度需要提高，以便实现长期通畅。

4、因此，在本发明中，发明人将抗凝和促进组织再生的基因修饰到聚合物骨架上，利用基因局部递送和转染技术，实现了对聚合物纤维骨架对体外培养细胞或皮下埋置过程中浸润细胞分泌细胞外基质成分的调控，提升血管的抗凝血和促再生特性，对满足包括心脏搭桥等复杂条件下人工血管应用需求具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管及其制备方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管及制备方法，包括如下步骤：

4、(1)制备聚合物纤维骨架；

5、(2)将所述聚合物纤维骨架负载功能化的基因载体，得到功能化的聚合物纤维骨架；

6、(3)将所述功能化的聚合物纤维骨架植入动物皮下培育或者在体外接种细胞，得到细胞化的聚合物纤维骨架；

7、(4)对细胞化的聚合物纤维骨架进行脱细胞处理，得到具有优异抗凝血特性和促再生特性的生物型人工血管。

8、优选的，所述聚合物纤维骨架是采用熔融近场直写技术、静电纺丝技术、编织或3d打印技术制备的能够满足血管力学强度的多孔纤维骨架。

9、优选的，所述用于制备聚合物纤维骨架的材料为聚己内酯(pcl)，聚对二氧六环己酮(pds)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(plga)、聚乙醇酸(pga)、聚氨基甲酸酯(pu)、聚癸二酸甘油酯(pgs)与聚乙二醇(peo)中的一种或者多种。

10、优选的，所述聚合物纤维骨架表面经过涂层处理后，再进一步负载功能化的基因载体。

11、优选的，所述涂层处理的方法为，使用多聚赖氨酸溶液在所述聚合物纤维骨架表面进行聚合反应，所述多聚赖氨酸溶液的质量浓度为0.8-500μg/ml，优选为4-100μg/ml，以在聚合物纤维骨架表面形成呈正电性的涂层。

12、优选的，所述涂层处理后负载功能化的基因载体的方法为，使用携带有抗凝和促内皮化功能基因的慢病毒基因载体与聚合物纤维骨架进行孵育，所述基因载体通过静电亲和作用结合在聚合物纤维骨架表面。

13、优选的，所述抗凝和促内皮化功能基因为透明质酸合成酶2(has2)或弹性蛋白原(te)；所述慢病毒基因载体的溶液浓度为5×104-5×108滴度/ml，优选为5×105-5×107滴度/ml。

14、本发明还提供了一种按照所述的制备方法得到的具有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管。

15、本发明通过聚合物纤维骨架负载功能化基因，提升血管的抗凝血和促再生特性。该高表达透明质酸或弹性蛋白的生物型人工血管相比于普通生物型人工血管具有更加优异的促进再生和抗凝血特性，同时在大鼠腹主动脉移植14天、兔子颈动脉移植14天、猪心脏搭桥30天时实现了血管通畅和血管内皮与平滑肌的再生，再生的血管平滑肌细胞(smcs)呈现出类似于天然动脉的绕轴排列取向，使用兔动静脉分流模型(av-shunt)研究表明，高表达透明质酸或弹性蛋白的生物型人工血管相比于普通生物型人工血管形成了更少的血栓，具有更好的抗凝性能。这表明本发明提供的生物型人工血管具有抗凝和加快血管内皮与平滑肌再生的作用，促进血管再生和重塑。

技术特征：

1.一种有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管及制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物纤维骨架是采用熔融近场直写技术、静电纺丝技术、编织或3d打印技术制备的多孔纤维骨架。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述用于制备聚合物纤维骨架的材料为聚己内酯、聚对二氧六环己酮、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物、聚乙醇酸、聚氨基甲酸酯、聚癸二酸甘油酯与聚乙二醇中的一种或者多种。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物纤维骨架表面经过涂层处理后，再进一步负载功能化的基因载体。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述涂层处理的方法为，使用多聚赖氨酸溶液在所述聚合物纤维骨架表面进行聚合反应，所述多聚赖氨酸溶液的质量浓度为0.8-500μg/ml，以在纤维骨架表面形成呈正电性的涂层。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述涂层处理后负载功能化的基因载体的方法为，使用携带有抗凝和促内皮化功能基因的慢病毒基因载体与聚合物纤维骨架进行孵育，所述基因载体通过静电亲和作用结合在聚合物纤维骨架表面。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述抗凝和促内皮化功能基因为透明质酸合成酶2或弹性蛋白原。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒基因载体的浓度为5×104～5×108滴度/ml。

9.一种按照权利要求1～8任一项所述的制备方法得到的有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管。

技术总结
本发明属于人工血管技术领域，本发明提供了一种有优异抗凝血和促再生特性的生物型人工血管及制备方法。包括如下步骤：(1)纺织聚合物纤维骨架；(2)将所述聚合物纤维骨架负载功能化的基因载体，得到功能化的聚合物纤维骨架；(3)将所述功能化的聚合物纤维骨架植入动物皮下培育或在纤维骨架上接种细胞，得到细胞化的聚合物纤维骨架；(4)对细胞化的聚合物纤维骨架进行脱细胞处理，得到具有优异抗凝血特性和促再生特性的生物型人工血管。本发明的聚合物纤维骨架负载了功能化的基因载体，促进植入骨架中透明质酸或弹性蛋白的合成，富含透明质酸或弹性蛋白的生物型人工血管具有更加优异的抗凝血作用和促进血管再生和重塑的效果。

技术研发人员：孔德领,程曲汉,王恺,周广东
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4