一种载药囊泡及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种载药囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞主要由细胞膜及其包裹的内容物构成，细胞内的骨架结构维持着细胞的形状，当细胞发生凋亡或受到刺激时，骨架结构发生改变导致细胞内外力的平衡被打破，进而引发细胞膜的重构和起泡，最终将细胞内容物包裹以小泡的形式释放到细胞外，即囊泡。研究表明，来源肿瘤细胞的囊泡包裹化疗药物可以直接杀伤肿瘤细胞，还可以诱导一系列免疫应答来调控肿瘤免疫微环境，解除其机制性，提高抗肿瘤效果。肿瘤相关巨噬细胞是众多肿瘤中含量最丰富的浸润白细胞之一，是产生免疫抑制性肿瘤微环境的关键所在。载药囊泡被巨噬细胞摄取进入溶酶体，激活溶酶体内p450单加氧酶系统，导致溶酶体ph升高(酸变碱)，升高的ph触发溶酶体内ca2+释放，促进转录因子tfeb入核，上调m1型相关炎性基因的表达，诱导m2型巨噬细胞向m1型转化，获得肿瘤杀伤能力。肿瘤微环境中的另一重要的天然免疫细胞是中性粒细胞，作为血液中含量最丰富的免疫细胞，占循环白细胞的50-70％，且中性粒细胞具有强大的清除细菌和抗肿瘤的功能。载药囊泡通过其包含的生物活性物质udpg和补体c5可以高效的募集中性粒细胞到达肿瘤部位，对肿瘤细胞周围的基质进行破坏，裸露出肿瘤细胞，增加载药囊泡与肿瘤细胞的接触机会，诱发肿瘤细胞焦亡。载药囊泡进一步诱导中性粒细胞向n1型分化，产生大量ros，发挥抗肿瘤作用。尽管载药囊泡具有重要的免疫调控作用，但以往的研究发现载药囊泡发挥抗肿瘤免疫调控功能时需要较大的剂量，这给载药囊泡的生产制备和临床使用的安全性都造成较大障碍。基于载药囊泡对肿瘤免疫微环境的调控机制，强化载药囊泡趋化天然免疫细胞浸润的能力至关重要。因此，对于囊泡的工程化改造，目的性的增强其功能具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的问题是目前载药囊泡招募中性粒细胞和巨噬细胞的方式需要较多的载药囊泡才能发挥作用，趋化天然免疫细胞的能力有待加强。

2、为解决上述问题，本发明提供一种载药囊泡，包括囊泡以及包裹在所述囊泡中的治疗药，所述囊泡来源于基因改造后的肿瘤细胞，所述基因改造后的肿瘤细胞中转染有沙门菌鞭毛蛋白，所述囊泡携带有所述沙门菌鞭毛蛋白。

3、较佳地，所述治疗药包括作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药。

4、本发明的载药囊泡相较于现有技术的优势在于：

5、本发明的囊泡来源于基因改造后转染有沙门菌鞭毛蛋白的肿瘤细胞，由此囊泡中也携带有沙门菌鞭毛蛋白，而沙门菌鞭毛蛋白可以激活tlr4和tlr5信号通路，产生大量的趋化因子，趋化因子可以特异性吸引巨噬细胞和中性粒细胞，并诱导这些免疫细胞的表型和功能向抗肿瘤类型极化。因此，来源于改造后的肿瘤细胞的载药囊泡，由于携带有鞭毛蛋白，使其趋化中性粒细胞和巨噬细胞能力大幅增强，强化了载药囊泡的免疫调控功能。当将该载药囊泡用于肿瘤疾病的治疗时，能够募集更大量的中性粒细胞和巨噬细胞到肿瘤周围杀伤肿瘤细胞，从而获得更好的治疗效果。

6、本发明还提供一种载药囊泡的制备方法，用于制备所述的载药囊泡，包括：

7、通过慢病毒转染方式对原始肿瘤细胞进行基因改造，获得稳定表达沙门菌鞭毛蛋白的肿瘤细胞；

8、根据所述稳定表达沙门菌鞭毛蛋白的肿瘤细胞制备载药囊泡，所述载药囊泡中携带有所述沙门菌鞭毛蛋白。

9、较佳地，所述通过慢病毒转染方式对原始肿瘤细胞进行基因改造包括：

10、将所述沙门菌鞭毛蛋白采用慢病毒进行载体包装，得到包装有沙门菌鞭毛蛋白基因的慢病毒；

11、将悬浮的原始肿瘤细胞接种6孔板，加入所述包装有沙门菌鞭毛蛋白基因的慢病毒后进行培养；

12、收集各孔细胞悬液，离心处理，用平衡盐溶液重悬清洗细胞，再次离心处理，弃去上清，使用rpmi1640完全培养基重悬细胞后，继续培养；

13、用含hygro b的rpmi1640完全培养基进行加压筛选，筛选出转染细胞，所述转染细胞为稳定表达沙门菌鞭毛蛋白的肿瘤细胞。

14、较佳地，所述慢病毒的加入量为120μl。

15、较佳地，加入所述慢病毒后进行培养的时间为16-20h。

16、较佳地，所述离心处理的参数包括：在1600-1800rpm下离心处理6-10min。

17、较佳地，使用所述rpmi1640完全培养基重悬细胞后继续培养的时间为24-48h。

18、较佳地，所述通过慢病毒转染方式对原始肿瘤细胞进行基因改造还包括：

19、在用所述含hygro b的rpmi1640完全培养基进行加压筛选10-15d后，筛选所用的抗生素浓度减半，培养2-3代后，收集细胞，并采用10倍倍比稀释的方法，将细胞浓度稀释至10个/ml，接种96孔板，每孔100μl，筛选单克隆转染细胞。

20、本发明的载药囊泡的制备方法相较于现有技术的优势在于：

21、本发明通过慢病毒转染细胞的方法，构建稳定表达鞭毛蛋白的肿瘤细胞，合成的沙门菌鞭毛蛋白在细胞质内富集，由该基因改造的肿瘤细胞制备载药囊泡，则载药囊泡能携带大量沙门菌鞭毛蛋白，由这些肿瘤细胞制备的载药囊泡募集中性粒细胞和巨噬细胞的能力加强，载药囊泡获得了更加稳定高效的杀肿瘤效果，能更好的用于肿瘤疾病的治疗。

22、本发明还提供一种载药囊泡的应用，包括在制备用于治疗肿瘤药中的应用。

23、本发明的载药囊泡的应用相较于现有技术的优势与载药囊泡相较于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

技术特征：

1.一种载药囊泡，其特征在于，包括囊泡以及包裹在所述囊泡中的治疗药，所述囊泡来源于基因改造后的肿瘤细胞，所述基因改造后的肿瘤细胞中转染有沙门菌鞭毛蛋白，所述囊泡携带有所述沙门菌鞭毛蛋白。

2.根据权利要求1所述的载药囊泡，其特征在于，所述治疗药包括作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药。

3.一种载药囊泡的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1或2所述的载药囊泡，包括：

4.根据权利要求3所述的载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述通过慢病毒转染方式对原始肿瘤细胞进行基因改造包括：

5.根据权利要求4所述的载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述慢病毒的加入量为120μl。

6.根据权利要求4所述的载药囊泡的制备方法，其特征在于，加入所述慢病毒后进行培养的时间为16-20h。

7.根据权利要求4所述的载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述离心处理的参数包括：在1600-1800rpm下离心处理6-10min。

8.根据权利要求4所述的载药囊泡的制备方法，其特征在于，使用所述rpmi1640完全培养基重悬细胞后继续培养的时间为24-48h。

9.根据权利要求4所述的载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述通过慢病毒转染方式对原始肿瘤细胞进行基因改造还包括：

10.一种载药囊泡的应用，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的载药囊泡在制备用于治疗肿瘤药中的应用。

技术总结
本发明提供了一种载药囊泡及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。本发明的囊泡过表达沙门菌鞭毛蛋白(flagellin B，FlaB)，可以通过激活TLR4诱导机体的抗肿瘤活性，同时通过激活TLR5加强这一肿瘤杀伤效果。携带FlaB的载药囊泡通过TLR4和TLR5的活化信号产生趋化因子，特异性趋化大量免疫细胞浸润在肿瘤部位，如中性粒细胞和单核/巨噬细胞。FlaB和载药囊泡的结合进一步强化了中性粒细胞和巨噬细胞表型和功能的变化，使这些天然免疫细胞获得更强的肿瘤杀伤能力，同时还可以有效增强CD8+CTL免疫应答，达到更好的抗肿瘤效果。

技术研发人员：唐科,李凯,张一
受保护的技术使用者：湖北盛齐安生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29