本发明涉及核酸封装脂质纳米粒子的制造方法、将核酸导入至细胞内的方法以及药品组合物的制造方法。
背景技术：
1、为了将使用了sirna等寡核酸的核酸治疗、使用了mrna、pdna等的基因治疗实用化，需要有效且安全的核酸递送载体。病毒载体是一种表达效率良好的核酸递送载体，但能够更加安全地使用的非病毒核酸递送载体的开发正在进行中。
2、使用具有季胺部分的阳离子性脂质的阳离子性的脂质体，由于带正电，因此能够通过静电相互作用与带负电的核酸形成复合物(脂质体复合物)，能够向细胞内递送核酸(例如参照专利文献1和2)。
3、然而，通过这样的方法制作的脂质体复合物难以控制粒径，此外源自带正电的阳离子性脂质的细胞毒性成为问题。
4、因此，开发出一种使用了在分子内具有在酸性条件下带正电、在中性附近不带电荷的叔氨基的离子性脂质的脂质纳米粒子(lipid nanoparticle，或称之为lnp)，现在成为了最通用的非病毒核酸递送载体(例如参照非专利文献1)。
5、作为使用了在分子内具有叔氨基的离子性脂质的脂质纳米粒子，还存离子性脂质赋予分解性基团的例子(例如参照专利文献3)。
6、如此地开发有各种非病毒载体，但由于核酸通常为不稳定的化合物，因此在核酸封装脂质纳米粒子的保存稳定性上尚存在课题。
7、现有技术文献
8、专利文献
9、专利文献1：日本特开2008-5801号公报
10、专利文献2：日本特开2001-2565号公报
11、专利文献3：国际公开第2013/073480号
12、专利文献4：国际公开第2019/188867号
13、非专利文献
14、非专利文献1：gene therapy(1999)6.271-281
技术实现思路
1、发明要解决的问题
2、作为核酸封装脂质纳米粒子的制造方法，已知的有将分散有核酸的酸性缓冲液与溶解于醇的脂质溶液混合，将所得的悬浮液的分散介质与其他缓冲液更换的方法。例如，在专利文献4中虽然记载有使用ph3.0的苹果酸缓冲液作为酸性缓冲液，将所得的悬浮液的分散介质更换为ph7.4的pbs来配制核酸封装脂质纳米粒子的例子，但并未提及关于各缓冲液会对核酸封装脂质纳米粒子的性能造成影响。
3、话说回来，作为提升核酸封装脂质纳米粒子的稳定性的方法，进行了向核酸封装脂质纳米粒子添加冷冻保护剂冷冻保存，或将核酸封装脂质纳米粒子进行冷冻干燥，使用时添加水，重构核酸封装脂质纳米粒子的悬浮液这样的尝试。这些方法在提升核酸封装脂质纳米粒子的稳定性上是有用的，但在简便性方面存在改善的余地。
4、本发明鉴于上述课题，目的在于提供一种在现有技术中未能实现的、改善核酸封装脂质纳米粒子的悬浮液的保存稳定性的核酸封装脂质纳米粒子的制造方法。
5、解决问题的手段
6、本发明人鉴于上述课题而深入努力的结果发现：脂质纳米粒子配制工序中使用的缓冲液对脂质纳米粒子的核酸递送效率及其悬浮液的保存稳定性产生影响，特别是通过将使用柠檬酸缓冲液作为酸性缓冲液而制得的悬浮液的分散介质更换为tris缓冲液，由此核酸封装脂质纳米粒子的核酸递送效率及其悬浮液的保存稳定性提升，从而完成本发明。基于该发现的本发明为如下所述。
7、[1]一种核酸封装脂质纳米粒子的制造方法，其含有以下的工序(a)和(b)：
8、将含有具有叔氨基的离子性脂质、甾醇和peg脂质的醇溶液与分散有核酸的ph为3～6.5的柠檬酸缓冲液混合，配制核酸封装脂质纳米粒子的悬浮液的工序(a)；以及
9、通过对核酸封装脂质纳米粒子的悬浮液进行超滤浓缩以及用ph为5.2～9.0的tris缓冲液进行稀释，将所述悬浮液的分散介质更换为所述tris缓冲液的工序(b)。
10、[2]根据所述[1]中所述的方法，工序(a)所使用的柠檬酸缓冲液中的柠檬酸及其盐的合计浓度为10～100mm，且工序(b)中使用的tris缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷及其盐的合计浓度为10～200mm。
11、[3]根据所述[1]或[2]所述的方法，工序(a)中使用的醇溶液进一步含有磷脂。
12、[4]根据所述[1]～[3]中任一项所述的方法，离子性脂质为式(1)所表示的化合物，
13、式(1)：
14、[化1]
15、
16、(式(1)中，
17、r1a和r1b各自独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，
18、xa和xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基的数量为1的非环状烷基叔氨基、或碳原子数为2～5且叔氨基的数量为1～2的环状亚烷基叔氨基，
19、r2a和r2b各自独立地表示碳原子数为1～8的亚烷基或碳原子数为2～8的氧二亚烷基，
20、ya和yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
21、za和zb各自独立地表示由碳原子数为3～16、具有至少1个芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生出的2价基团，
22、na和nb各自独立地表示0或1，
23、r3a和r3b各自独立地表示源自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、源自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、碳原子数为1～40的脂肪族烃基、具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基或式(3c)所表示的基团，
24、式(3c)：
25、r3c-o-co-(ch2)a-*(3c)
26、(式(3c)中，
27、*表示键合位置，
28、r3c表示碳原子数为2～20的脂肪族烃基，以及
29、a表示2～10的整数。))。
30、[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的方法，工序(a)所使用的离子性脂质的总氨基与核酸的磷酸基的摩尔比(离子性脂质的总氨基/核酸的磷酸基)为7以上。
31、[6]一种将所述核酸导入至细胞内的方法，其包括在生物体外使通过所述[1]～[5]中任一项所述的方法制造的核酸封装脂质纳米粒子与所述细胞相接触的工序。
32、[7]一种将所述核酸导入至所述生物体的靶细胞内的方法，其包括将通过所述[1]～[5]中任一项所述的方法制造的核酸封装脂质纳米粒子给药至生物体的工序。
33、[8]一种药品组合物的制造方法，其包括所述[1]～[5]中任一项所述的方法。
34、发明的效果
35、在本发明的制造方法中，相较于现有技术，刚制造后的核酸递送效率更高，能够制造核酸封装脂质纳米粒子。进一步地，通过本发明的制造方法制得的核酸封装脂质纳米粒子的悬浮液的保存稳定性优异。相较于现有技术，采用本发明的制造方法制得的核酸封装脂质纳米粒子的核酸递送效率更高，因此有利于在细胞、生物体内的基因导入，由于其悬浮液的保存稳定性高，因此尤其作为药品组合物有用。