背景技术：
1、多药耐药(mdr)革兰氏阴性菌对发病率和死亡率具有显著的影响[1-4]。粘菌素(多粘菌素e)是一种近60年前首次发现的抗生素，对大多数多药耐药革兰氏阴性菌有效[5,6]。除了患有囊性纤维化的患者之外[7-10]，自从20世纪80年代早期以来，由于其肾毒性，其尚未被广泛使用。然而，其已被重新引入临床实践中作为治疗由多药耐药革兰氏阴性菌引起的严重医院感染的最后一线药物[11]。
2、许多研究已显示，肠杆菌科(enterobacteriaceae)中粘菌素耐药性的流行率快速增加[12-14]。这些细菌的一些临床分离物，包括铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)、大肠杆菌(escherichia coli)、沙门氏菌属物种(salmonella spp.)和克雷伯氏菌属物种(klebsiella spp.)，已获得了对粘菌素的耐药性[15-20]。因此，由于缺乏替代治疗选择，粘菌素耐药性被认为是严重的公共卫生问题。
3、受关注的是，其他假单胞菌门(pseudomonadota)(变形菌门(proteobacteria))，如沙雷氏菌属物种(serratia spp.)、变形菌属物种(proteus spp.)和伯克霍尔德氏菌属物种(burkholderia spp.)对粘菌素表现出天然耐药性[21]。耐粘菌素革兰氏阴性菌也通常对其他抗细菌剂具有交叉耐药性[22,23]。例如，美罗培南，一种超广谱碳青霉烯，在低浓度(0.03-6.25g/ml)下对药物敏感的肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)和鲍氏不动杆菌(a.baumannii)有效，而铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌和肺炎克雷伯氏菌的耐粘菌素菌株降低了它们对美罗培南和其他抗生素的敏感性[24,25]。
4、耐粘菌素肺炎克雷伯氏菌菌株难以用目前可用的药物库治疗[26,27]。尽管许多研究致力于优化目前可用的药剂的使用或确定其任何组合，但是没有管线药物(pipelinedrug)针对解决与粘菌素耐药性相关的耐药细菌[28-33]。因此，需要有效对抗耐粘菌素菌株的药物或预防在治疗期间获得粘菌素耐药性的方法。
5、singer等人的美国专利第8,530,675号、第9,273,022号和第9,422,260号描述并且要求保护高度纯化的玫瑰红(rose bengal)以及含有不同卤素取代基和不同数量的那些卤素取代基的类似纯化的化合物以及它们的内酯形式的合成。上述专利中使用的高度纯化的玫瑰红是临床阶段配制的玫瑰红(hb-rbf)组合物，其含有溶于0.9％氯化钠(nacl)水溶液的10％玫瑰红w/v，由knoxville,tn的provectus biopharmaceuticals,inc.以名称提供用于研究。玫瑰红化合物在本文中共同称为“卤化呫吨”，并且更具体地称为“卤化荧光素”。
6、rb染料已被临床研究用于治疗黑素瘤和其他实体癌([36]；和pct/us22/05407)，特别是当直接注射到癌性病变中时。已零星报道了rb的光动力抗细菌性质([37]和pct/us22/054076)。
7、dees等人的美国专利第8,974,363号教导了使用10-100μm(即，10μg/ml至100μg/ml)的rb局部制剂与在500-600nm波段下的绿光辐照组合来对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性抗生素耐药细菌，而没有关于所使用的细菌菌株、光源、其强度或辐照持续时间的细节。
8、我们已针对两种伯克霍尔德氏菌属物种、一种变形菌属物种、一种沙雷氏菌属物种、耐粘菌素铜绿假单胞菌和野生型铜绿假单胞菌(参考细菌菌株)筛选了内部库分子，包括fda批准和未批准的抗细菌剂。我们确定了玫瑰红(rb；4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘-荧光素)在荧光下对耐粘菌素革兰氏阴性菌株显示出强的杀细菌活性(0.05-6.25g/ml)(参见下文表1和[35])。然而，rb对所检查的其他革兰氏阴性菌(大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌)的野生型没有显示出明显的抗细菌活性(mic<12.5g/ml)。
9、以上讨论的rb的抗细菌特性引导我们研究rb对获得粘菌素耐药性的革兰氏阴性菌的功效。为了验证rb对耐粘菌素菌株的杀细菌效应，我们制备了大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属物种、鼠伤寒肠沙门氏菌(s.enterica typhimurium)和沙雷氏菌属物种的中等至高粘菌素耐药菌株[34]。在本文中，我们报告了药物级rb[高纯度rb制剂(hp-rbf)]对这些耐粘菌素革兰氏阴性菌的敏感性。
10、发明简述
11、本发明考虑玫瑰红衍生物与用波长约500nm至约600nm的光辐照革兰氏阴性菌约1至约10分钟的时间段组合的组合使用，以处理和杀灭经辐照的细菌，所述革兰氏阴性菌也对抗细菌化合物粘菌素表现出耐药性(mic≥50mg/ml)。
12、在一个实施方案中，本发明考虑玫瑰红衍生物与用波长约500nm至约600nm的光辐照除了伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、变形菌属(proteus)和沙雷氏菌属(serratia)之外的革兰氏阴性菌约1至约10分钟的时间段组合的组合使用，以处理和杀灭经辐照的细菌，所述革兰氏阴性菌也对抗细菌化合物粘菌素表现出耐药性(mic≥50mg/ml)。
13、在一个方面，在包括以下步骤的方法中处理革兰氏阴性耐粘菌素菌以及在一个实施方案中除了伯克霍尔德氏菌属、变形菌属和沙雷氏菌属之外的革兰氏阴性耐粘菌素菌：使所述细菌与含有以约0.01至约15mg/ml的浓度溶解或分散在其中的以下式i的玫瑰红(rb)化合物的水性药物组合物接触；和用波长约500nm至约600nm的光辐照那些接触的细菌约1至约10分钟的时间段，以提供约16至约160j/cm2的光剂量。式i的rb化合物在下面示出：
14、
15、其中x为氧或氮，“n”为0或1，使得当x为氧时，n为0并且r2不存在，而当x为氮时，n为1并且r2存在。当x为氧时，r1选自由氢(h)、作为药学上可接受的阳离子的m+、c1-c4烷基和如下文所定义的含有芳环的取代基组成的组。当x为氮时，r1和r2相同或不同，并且选自由氢、c1-c4烷基或与酰胺基氮原子一起形成5元或6元环、和芳环取代基组成的组。所述芳环取代基是含有5元或6元的单环，或5,6-或6,6-稠合芳环体系，并且所述芳环或环体系取代基可以含有0、1或2个独立地为氮、氧或硫的杂环原子。
16、示例性的芳环取代基的结构式在下面描述：
17、
18、其中为分别提供酯或单取代的胺。
19、在一个优选的实施方案中，所述方法在其中进行手术以抑制革兰氏阴性耐粘菌素菌的手术后感染的区域中进行。所考虑的含有式i的rb化合物的水性药物组合物可以通过喷雾或擦拭或任何其它常规方法施用至手术区域的表面，如可以施用至手术患者身体的体内和体外区域，以及手术器械、外科医生的手、参与手术的其他人的手和手术区域中存在的各种器械。根据需要，可以使用发射前述量的波长为约500nm至约600nm的光的一个或多个灯来照射整个手术区域或更小的区域。
20、附图简述
21、在构成本公开内容的一部分的附图中
22、分如图1a、1b、1c、1d、1e和1f的六个图的图1是说明在荧光灯(17w，63.8cm2，0-40j/cm2)下，hp-rbf(10％rb的盐水溶液)对耐粘菌素[粘菌素r]革兰氏阴性菌的时间-杀灭动力学的图。施用mic浓度的5倍：大肠杆菌atcc35218粘菌素r：mic 400mg/ml(粘菌素)；铜绿假单胞菌atcc27853粘菌素r：mic>400mg/ml(粘菌素)；肺炎克雷伯氏菌atcc 19606粘菌素r：mic 100mg/ml(粘菌素)；和鲍氏不动杆菌atcc baa-1800粘菌素r：mic 400mg/ml(粘菌素)。
23、优选的实施方案的详述
24、本发明考虑处理革兰氏阴性菌的方法，所述革兰氏阴性菌也对抗细菌化合物粘菌素(mic≥50mg/ml)表现出耐药性，以及在一个实施方案中，除了伯克霍尔德氏菌属、变形菌属和沙雷氏菌属之外的所述革兰氏阴性菌也对抗细菌化合物粘菌素表现出耐药性，所述方法包括用含有以约0.01至约15mg/ml的浓度溶解或分散在其中的以下式i的玫瑰红(rb)化合物的水性药物组合物接触所述细菌，和用波长约500nm至约600nm的光辐照那些接触的细菌约1至约10分钟的时间段，以提供约16至约160j/cm2的光剂量，以处理和杀灭经辐照的细菌。
25、所考虑的rb化合物具有以下结构式(式i)，其中x为o(氧)或n(氮)，并且“n”为0或1。
26、
27、当x为氧时，n为0并且不存在，因此rb化合物为：a)玫瑰红，其中-x-r1为-o-h，b)rb的药学上可接受的盐，其中-x-r1为-o-m+，其中m+为药学上可接受的阳离子，c)c1-c4烷基酯，或d)如下定义的芳族酯。
28、供选择地，当x为氮原子时，n为1并且r2与r1一起存在。因此，r1和r2可以相同或不同，并且c(o)nr1r2为酰胺，其氮原子为a)未被取代的[-x-(r1r2)，并且r1和r2两者均为氢(h)]，为b)被一个或两个c1-c4烷基基团取代或与酰胺基氮原子一起形成5元或6元环，或者为c)芳族酰胺，其优选地为单取代的，其中r1为氢，并且r2为下面讨论的芳族取代基。
29、为了便于描述，芳族酯或芳族酰胺共同称为芳族衍生物。因此，这些衍生物由醇或胺(优选单取代)形成，具有单一5元或6元芳环或含有0、1或2个独立地为氮、氧或硫的杂环原子的5,6-或6,6-稠合芳环体系。
30、这样的芳族醇酯部分的说明性实例在下面示出并且命名，其中o为氧原子，并且线-o指示环-氧可以来自环的任何可用碳，并且被波浪线穿过的o-线指示所描绘的烷氧基基团是另一个分子(酯化的rb分子)的部分。
31、
32、
33、其中为分别提供酯或单取代的胺。
34、玫瑰红(rb)是优选的rb化合物，并且其二钠盐玫瑰红二钠(rbd)是最优选的rb化合物。这些化合物在本文中说明性地用于rb化合物组。
35、玫瑰红的化学名称是4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘-荧光素。优选的形式玫瑰红二钠(rbd)具有以下结构式：
36、
37、所考虑的组合物的该优选的实施方案的某些细节描述在美国专利第5,998,597号、第6,331,286号、第6,493,570号和第8,974,363号中，其公开内容以其整体通过引用并入本文。上述专利描述了rbd杀灭癌细胞的用途。
38、在一个方面，被革兰氏阴性耐粘菌素菌感染的哺乳动物细胞(如人的细胞)和细菌通过被感染细胞摄取的rb化合物接触。在另一方面，革兰氏阴性耐粘菌素菌存在于待消毒的表面上。
39、光可以与所考虑的含有rb的药物组合物(其中存在所考虑的rb化合物)一起施用，所述药物组合物以溶解或分散在药学上可接受的稀释剂中的约0.01至约15mg/ml、并且优选约0.2至约3.1mg/ml的浓度接触感染区域。也可以在施用药物组合物以接触细菌或含有细菌的哺乳动物细胞之后不久施用光，优选在约2至约5分钟内。可以在感染的哺乳动物细胞内或当存在于诸如检查台或手术台的表面上时处理细菌。
40、尽管似乎与先前的处理类似，但是据信rb化合物的浓度小于先前使用的浓度，并且光量为先前方法的光量的约十分之一或更少。此外，该处理针对除了伯克霍尔德氏菌属、变形菌属和沙雷氏菌属之外的革兰氏阴性菌，所述革兰氏阴性菌也对粘菌素处理具有耐药性。
41、粘菌素耐药性(以其各种语法形式)在本文中用于指mic约等于或大于(≥)约50mg/ml的粘菌素浓度。在大多数情况下，mic≥约100mg/ml，并且通常≥约400mg/ml。因此，可以使用较少的抗细菌rb化合物，并且可以使用较低价格的光照，从而使该方法更可行。
42、将用rb处理的感染区域辐照约1至约10分钟，更优选约2至约5分钟的时间段。这种辐照提供约16至约160j/cm2的光剂量，并且更优选地，提供约32至约80j/cm2的光剂量。
43、药物卤化呫吨组合物
44、所考虑的液体组合物可以配制用于口服施用、胃肠外施用或局部施用。说明性的卤化呫吨(荧光素)组合物通过参考使用优选的卤化呫吨化合物玫瑰红二钠来说明。
45、首先，讨论胃肠外或局部治疗组合物，前面提到的组合物说明了含有特别优选的rb化合物玫瑰红二钠的可胃肠外施用的药物组合物。当组合物具有接近生理ph(即，大约ph 7)的ph值时，并且尤其是当ph值大于约4时，递送所考虑的组合物的卤化荧光素组分是最有利的，因此确保卤化荧光素在组合物中保持呈二元形式。
46、因此，在优选的实施方案中，组合物的ph值为约5至约9，并且更优选约6至约7.5，并且最优选约ph 6.5至约ph 7.4。在这些ph值下，卤化荧光素通常保持呈二元形式，而不是在低ph值下形成的内酯。
47、rb化合物如玫瑰红是二元的，具有2.52和1.81的pka值。几种考虑的卤化荧光素的pka值确定可以在batsitela等人,spectrochim acta part a 79(5):889-897(2011年9月)中找到。
48、亲水性载体是药物的一种优选的介质，以使卤化荧光素组分分配到组织中的偏好最大化，特别是对于呈酸和/或盐形式的rb化合物。因此，在优选的实施方案中，媒介物含有最少的可能干扰这样的分配的非亲水性组分。因此，优选的组合物制剂含有rb或rb二钠，其特别优选地在亲水性媒介物中，优选在含有水的媒介物中。
49、当胃肠外施用时，除了在栓剂中之外，含有rb化合物的药物组合物优选包含水溶性电解质，该电解质包含至少一种选自由钠、钾、钙和镁组成的组的阳离子和至少一种选自由氯离子、磷酸根和硝酸根组成的组的阴离子。所述电解质的浓度优选为约0.1％(w/v)和约2％(w/v)。
50、供选择地，电解质以足以提供大于约100mosm/kg(毫渗摩尔/千克水)直至约600mosm/kg的同渗质量摩尔浓度的水平存在。更优选地，药物组合物的同渗质量摩尔浓度大于250mosm/kg，并且最优选大约300-500mosm/kg。
51、电解质优选为氯化钠。电解质优选以约0.5％至约1.5％的浓度存在，并且甚至更优选以约0.8％至约1.2％的浓度存在，并且最优选以大约0.9％的浓度存在，如存在于生理盐水中那样。
52、组合物的水性介质(稀释剂)优选仅为满足用于注射的标准的水。最高达约20体积％的稀释剂可以是一种或多种c1-c6一元醇或多元醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、甘油、乙二醇、丙二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、赤藓糖醇、苏糖醇、三羟甲基丙烷、山梨糖醇等。更优选地，醇在所考虑的组合物中以小于稀释剂的约10体积％、并且更优选小于约5体积％存在。
53、呈其各种语法形式的术语“生理学上可接受的盐”和“药学上可接受的盐”指任何无毒阳离子，如制药工业中通常使用的碱金属、碱土金属和铵盐，包括钠、钾、锂、钙、镁、钡和鱼精蛋白锌盐，其可以通过本领域已知的方法制备。所考虑的阳离子提供水溶性rb盐。优选地，盐为呈一元盐或二元盐形式的钠、钾和钙。关于与药物化合物形成生理学上/药学上可接受的盐的通常使用的生理学上(或药学上)可接受的酸和碱的清单，读者请参考berge,j.pharm.sci.1977 68(1):1-19。
54、含有rb的药物组合物的ph值可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方式调节或调整。组合物可以进行缓冲，或者可以通过添加酸、碱等来调节ph值。由于rb或其生理学上可接受的盐是弱酸，根据它们的浓度和/或电解质浓度，组合物的ph值可以不需要缓冲液和/或ph值调节剂。然而，尤其优选组合物不含缓冲液，允许其一旦施用就符合生物环境。
55、还优选药物组合物不包含任何防腐剂，其中许多防腐剂可能有害地干扰药物组合物或其制剂，或者可能与含有rb化合物的组合物活性组分复合或以其他方式相互作用或干扰其递送。就使用防腐剂而言，咪唑烷基脲(imidurea)是优选的防腐剂，因为其在药物组合物中或在施用时不与rb化合物相互作用。
56、所考虑的液体药物组合物也可以适用于向待治疗的哺乳动物受试者口服施用。在优选的方面，当向哺乳动物受试者施用时，如之前所讨论的rb化合物溶解或分散在水性稀释剂中。更优选地，除了作为调味剂存在的那些糖和/或缓冲剂之外，水性稀释剂不含张力调节剂(tonicity agent)。
57、最多达约20体积％的稀释剂可以是一种或多种如之前所讨论的c1-c6一元醇或多元醇。更优选地，醇在所考虑的组合物中以小于稀释剂的约10体积％、并且更优选小于约5体积％存在。
58、还考虑了局部施用的液体组合物。正在进行用于治疗银屑病的临床试验的一种这样的液体组合物是knoxville,tn的provectus biopharamceuticals,inc.的称为的开发药物。该药物含有以溶解或分散在水性稀释剂中的0.001至0.01％w/v的浓度存在的rbd、以及至少一种结构剂(builder)(其以足以向药物提供10-1000cps的粘度的水平存在)、作为电解质的氯化钠(其以0.9％w/v的浓度存在，其水平足以向药物提供100mosm/kg至500mosm/kg的同渗质量摩尔浓度)。该药物在例如美国专利第8,974,363号中描述和要求保护。
59、处理方法
60、所考虑的处理方法包括接触对抗细菌化合物粘菌素表现出耐药性(mic≥50mg/ml)的革兰氏阴性菌。在一个实施方案中，除了伯克霍尔德氏菌属、变形菌属和沙雷氏菌属之外，用含有抗革兰氏阴性菌量的rb化合物的组合物，同时用具有约500nm至约600nm的波长的光辐照这些细菌细胞约1至约10分钟的时间段以处理和杀灭经辐照的细菌。用于该辐照的优选的波长为约500至约575nm，更优选约510至约550nm。如本文所讨论的，如果确定的mic为约10mg/ml或更低，则认为所考虑的含有rb化合物的组合物提供有效的处理。
61、在一个实施方案中，革兰氏阴性菌细胞存在于受试哺乳动物之上或之中(例如，感染)。说明性地，受试哺乳动物可以具有皮肤病学革兰氏阴性菌感染，如克雷伯氏菌属(klebsiella)、埃希氏菌属(escherichia)或假单胞菌属(pseudomonas)的感染，或者特别是在局部处理开放或手术伤口的情况下，作为用于当前感染的治疗和作为其中感染细菌也是耐粘菌素的后续革兰氏阴性菌的预防。
62、在另一实施方案中，手术场所的表面如检查台、地板和/或墙壁和/或设备可以用如上所考虑的组合物洗涤并且辐照，以消毒或防止如上所讨论的一种或多种革兰氏阴性菌的生长。洗涤和辐照可以与哺乳动物受试者的手术或其他治疗同时进行，以帮助消毒或改善哺乳动物受试者和治疗区域的整体清洁度。
63、治疗的受试哺乳动物可以是灵长类动物如人，猿如黑猩猩或大猩猩，猴如食蟹猴或猕猴，实验室动物如大鼠、小鼠或兔，伴侣动物如狗、猫、马，或食用动物如母牛或阉牛(steer)、绵羊、羔羊、猪、山羊、美洲驼等。
64、通常重复施用每种所考虑的组合物，直到治疗的细菌疾病(感染)减少至期望程度，如不可检测。因此，按照治疗医师的指导，向有需要的哺乳动物受试者的施用可以在一天内、每天、每周、每月或在数月至数年的时间段内发生多次。
65、向有需要的哺乳动物受试者施用革兰氏阴性杀细菌有效量的rb，并且其可以使用通常的液体、凝胶、乳膏或其他形式配制。在大多数情况下，rb与辐照一起施用，所述辐照优选使用包括约500至约600nm、并且更优选约510至约550nm的发射波长的光源。在下文中讨论用于光源的说明性源、其强度及其持续时间。
66、结果
67、药物级的玫瑰红制剂(hp-rbf)有效抑制耐粘菌素革兰氏阴性菌的生长
68、已报道了玫瑰红(rb)的抗细菌活性，其具有商业级玫瑰红(80-95％染料含量)，所述商业级玫瑰红含有由历史制备方法产生的已知杂质(例如，卤素转移的物质(transhalogenated substance))[36]。因此，商业级rb缺乏药物相关性。
69、在本研究中应用的rb具有>99.5％的纯度，并且是在当前良好制备实践下合成和纯化的。高纯度rb最初在盐水中配制(10％rb的盐水溶液；hp-rbf)，并且用盐水进一步稀释以形成期望的浓度。
70、通过肉汤稀释法，在荧光(约23.0kj/cm2)和led灯(约29.0kj/cm2)辐照条件下，在24小时的时间段内获得最低抑菌浓度(mic,μg/ml)。说明性地，这计算出在60分钟(min)内约0.96(约1)kj/cm2或在一分钟内约16.0j/cm2。对于使用0至30分钟的辐照时间、使用17w、63.8cm2荧光灯进行的研究，光量将相应地为约0-480j/cm2。在[35]中讨论的约1至约10分钟的辐照将达到约16至约160j/cm2。
71、hp-rbf有效抑制耐粘菌素革兰氏阴性菌的生长，mic水平为0.05-12.5μg/ml。在下表1中观察到的hp-rbf对耐粘菌素菌株的杀细菌活性根据光源没有显著差异；对于荧光和led光，mic值相等或非常接近[35]。
72、表1
73、针对耐粘菌素细菌菌株的杀细菌分子的发现。a
74、
75、
76、a所有研究均重复三次。mic值是通过od和比色测定使用刃天青(risazurin)或孔雀绿确定的。
77、b细菌购自atcc或从beiresources获得。
78、c根据下文所述的程序在kurosu实验室中制备耐粘菌素菌株。
79、d使用的光源为17w、63.8cm2荧光灯或9.5w、28.3cm2 led灯。在处理24小时(对于荧光灯为23.0kj/cm2，或对于led灯为29.0kj/cm2)后确定mic。
80、hp-rbf对耐粘菌素大肠杆菌(atcc 35218，对粘菌素>400g/ml)表现出杀细菌活性，mic值为0.05g/ml(下表2条目2)。当大肠杆菌获得粘菌素耐药性时，美罗培南对大肠杆菌的敏感性低得多(条目1对比条目2)。大肠杆菌血清型o157(野生型)是一种主要的食源性病原体，其对粘菌素、美罗培南和阿米卡星显示出敏感性(条目3)。我们可以分离具有100μg/ml的mic水平的其耐粘菌素突变体(条目4)。
81、表2hp-rbf对耐粘菌素革兰氏阴性细菌菌株的敏感性a
82、
83、
84、
85、a所有研究均重复三次。mic值是通过od和比色测定使用刃天青(risazurin)或孔雀绿确定的。
86、b细菌购自atcc或从bei resources获得。
87、c根据下文所述的程序在kurosu实验室中制备耐粘菌素菌株。
88、d使用的光源为17w、63.8cm2荧光灯或9.5w、28.3cm2 led灯。在处理24小时(对于荧光灯为23.0kj/cm2，或对于led灯为29.0kj/cm2)后确定mic。在荧光和led灯下获得的mic值相同。
89、野生型大肠杆菌血清型o157菌株对hp-rbf显示出非常低的敏感性(条目3)，但是hp-rbf有效地杀灭其耐粘菌素突变体(mic：3.13g/ml)(条目3对比条目4)。鲍氏不动杆菌(atcc19606，条目5)和鲍氏不动杆菌(atcc baa1800，条目7)的药物敏感和多药耐药突变体显示出对hp-rbf的耐药性。在另一方面，它们的耐粘菌素突变体对hp-rbf敏感；hp-rbf对这两种菌株(条目6和8)的mic值为0.05μg/ml。两种野生型肺炎克雷伯氏菌菌株(atcc 19606和nr48569)对hp-rbf具有耐药性(mic>100μg/ml)(条目9和11)，而它们的耐粘菌素突变体增加了对hp-rbf的敏感性；mic值分别为6.3和12.5μg/ml(条目10和12)。
90、此外，我们已用铜绿假单胞菌(atcc 27853)生成了粘菌素中等(mic 50μg/ml)和高(mic>400μg/ml)耐药性铜绿假单胞菌突变体(条目14和15)。铜绿假单胞菌菌株的hp-rbf敏感性取决于其粘菌素耐药性的程度；对较高耐粘菌素菌株和中等耐粘菌素菌株的mic值分别为0.05和6.3μg/ml。与表1中研究的铜绿假单胞菌(atcc 27853)类似，铜绿假单胞菌mrsn 1356(nr51521)和铜绿假单胞菌mrsn 1380(nr51522)菌株在照射条件下显示出对hp-rbf的低水平的固有敏感性(条目16和18)[37]。其耐粘菌素菌株增加了hp-rbf敏感性(条目17和19)。
91、据报道，一些革兰氏阴性菌，如伯克霍尔德氏菌属物种对粘菌素具有固有耐药性，mic值通常＞200mg/ml(参见上文)。认识到野生型多噬伯克霍尔德氏菌cgd1具有粘菌素耐药性，mic水平为200mg/ml(表1，表2中的条目20)[21]。
92、多噬伯克霍尔德氏菌cgd1的耐粘菌素突变菌株对hp-rbf高度敏感(条目21)。类似地，检查了两种其他伯克霍尔德氏菌属物种(泰国伯克霍尔德氏菌e264和洋葱伯克霍尔德氏菌基因组型iii，lmg 16656)；这些野生型也显示出高的粘菌素耐药性(条目22和24)[38]。它们的获得性耐粘菌素突变体对hp-rbf的敏感性增加8倍和16倍(条目23和25)。粘菌素有效地杀灭大多数沙门氏菌物种，mic值为0.8-1.6mg/ml(条目26和28)。
93、hp-rbf可以抑制野生型肠沙门氏菌亚种鼠伤寒肠杆菌的生长，mic值为12.5mg/ml(条目26)。肠沙门氏菌亚种鼠伤寒肠杆菌的15倍高的耐粘菌素突变体提高了其hp-rbf敏感性(条目27)。另一种沙门氏菌物种(宾夕法尼亚肠沙门氏菌，鼠伤寒血清型)的获得性粘菌素突变体也提高了其hp-rbf敏感性(条目29)。变形菌属和沙雷氏菌属物种是显示出对粘菌素的耐药性的其它细菌(条目30和32)。hp-rbf在低浓度下有效杀灭这些野生型菌株(条目30和32)。如表2中所有其它条目中所观察到的，它们的获得性粘菌素突变体提高了hp-rbf敏感性(条目31和32)。
94、hp-rbf对耐粘菌素革兰氏阴性菌具有快速杀灭特征
95、我们已报道了hp-rbf对革兰氏阳性菌的光动力学生长抑制；在革兰氏阳性菌(包括耐药菌株)的细菌培养物(1.3至约4.6×108cfu/ml)中添加hp-rbf可以在小于2分钟(min)内引起细菌细胞减少大于6个对数[35]。类似地，对选择的耐粘菌素(粘菌素r)突变菌株(大肠杆菌atcc35218粘菌素r、铜绿假单胞菌atcc27853粘菌素r、肺炎克雷伯氏菌atcc19606粘菌素r和鲍氏不动杆菌atcc baa-1800粘菌素r)的时间过程研究在5倍mic(hp-rbf)的浓度下在荧光灯下进行24分钟(40j/cm2)。那些结果的图形说明显示在图1中。
96、使用的参照分子是阿米卡星(10mg/ml)和美罗培南(10mg/ml)。hp-rbf在2分钟内将1.3×108至约1.9×108(菌落形成单位：cfu)的所有耐粘菌素菌株减少了6个对数减少；对于用hp-rbf(0.025或31.5mg/ml)浓度处理的培养基(1×103稀释)，没有计数cfu(图1a-1d)。在相同的研究中，阿米卡星和美罗培南分别减少大肠杆菌atcc35218粘菌素r菌株约3.5％(30分钟)和0％(30分钟)(图1e和1d)。这些结果证明hp-rbf在照射条件下对耐粘菌素革兰氏阴性菌具有快速杀灭性质[35]。
97、讨论
98、我们评价了药物级rb配制产品(hp-rbf)在照射条件下的抗细菌活性。我们最近报道了hp-rbf对革兰氏阳性菌和分枝杆菌属物种(mycobacterium spp)的综合评估；检测了超过45种细菌菌株，并且hp-rbf对革兰氏阳性菌显示出快速的杀细菌活性(mic 0.3-3.1mg/ml，小于2分钟)[35]。hp-rbf对革兰氏阳性肽聚糖层具有强亲和力，并且诱导光动力活化，产生活性氧物质。hp-rbf对分枝杆菌属物种显示出中等的杀细菌活性，在照射条件下mic值为12.5-25.0mg/ml(12小时)。
99、由于对分枝杆菌属物种的mic值高于对革兰氏阳性菌的mic值，我们认为含有分枝菌酸的厚细胞壁减少了hp-rbf的细胞摄取。在先前的研究中，我们得出结论，常见的医院革兰氏阴性菌对hp-rbf不敏感；它们的mic值为25mg/ml或超过＞50mg/ml[35]。
100、我们已扩展了对革兰氏阴性菌的抗细菌筛选，并且认识到hp-rbf显示出对一些变形菌门(假单胞菌门)如伯克霍尔德氏菌属、一些沙门氏菌属、变形菌属和沙雷氏菌属物种的敏感性[21]。hp-rbf对它们的野生型的mic值为0.8-12.5mg/ml。它们的药物敏感性的特征之一是它们对粘菌素的作用具有固有的高度耐药性。
101、hp-rbf在低浓度下杀灭革兰氏阴性菌(大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌)的耐粘菌素(colostin)突变体。伯克霍尔德氏菌属、沙门氏菌属、变形菌属和沙雷氏菌属物种的增强的耐粘菌素菌株也增加hp-rbf敏感性。这些数据明确地表示，革兰氏阴性菌中粘菌素耐药性的获得改变了外膜的结构，增加了hp-rbf的亲和力。
102、确定的事实是，所确定的粘菌素耐药性革兰氏阴性菌涉及脂多糖(lps)结构的变化，其中粘菌素与lps的带负电荷的脂质a相互作用[39-41]。因此，耐粘菌素菌株中带正电荷的lps组分(例如，阳离子形式的4-氨基-l-阿拉伯糖、磷酸乙醇胺和半乳糖胺)增加可以增强带负电荷的hp-rbf的亲和力。
103、我们正在进一步确定hp-rbf对抗耐粘菌素革兰氏阴性菌的作用方式。hp-rbf的快速抗细菌光动力活性具有几个优点，包括：1)降低耐药菌株的产生频率，和2)增加消毒和灭菌应用的安全性特性。
104、总之，我们在此报道的研究表明hp-rbf是用于治疗内源性和获得性耐粘菌素革兰氏阴性菌感染的药物候选物。耐粘菌素革兰氏阴性菌涉及膜结构改变，其导致用于革兰氏阴性菌感染的其他重要抗细菌剂的耐药性[40,41]。受关注的是，这些结构变化使得hp-rbf对耐粘菌素革兰氏阴性菌更敏感。
105、我们以前报道了hp-rbf在200mm(203.4mg/ml)浓度下在荧光灯下1小时(h)不会改变人皮肤组织的完整性[35]。因此，用于局部施用的hp-rbf的选择性指数和治疗指数非常高。我们的毒理学研究显示，hp-rbf在治疗浓度下不具有全身毒理学作用、诱变潜力和雌性生殖和发育影响[42,43]。
106、总之，hp-rbf是一种有吸引力的作为快速杀细菌剂的药物候选物，其可以应用于皮肤、口腔和手术伤口感染。hp-rbf与抗革兰氏阴性药物组合具有充当用于革兰氏阳性菌(先前的研究)和革兰氏阴性菌(本研究)的广谱抗细菌剂的潜力。
107、材料和方法
108、一般/化学品和试剂
109、除非另有说明，否则所有化学品和抗生素均购自商业来源，包括sigma-aldrich，并且未经进一步纯化使用。高纯度玫瑰红由provectus biopharmaceuticals,inc.(美国)的团队合成。用于生长抑制活性测试的所有细菌培养基均购自fisher scientific。荧光灯[17w，63.8cm2，sunblaster holdings，ulc(langly b.c.，ca)]和led(9.5w，28.3cm2，philips)购自amazon.com。刃天青(阿尔玛蓝(alamar blue))购自sigma-aldrich。
110、细菌菌株
111、本项目中研究的所有细菌均购自或获自美国典型培养物保藏中心(atcc)或beiresources(niaid)，包括大肠杆菌(atcc 35218)、大肠杆菌血清型o157(tw07793)、鲍氏不动杆菌(atcc19606)、鲍氏不动杆菌(atcc baa1800)、肺炎克雷伯氏菌(atcc 19606)、肺炎克雷伯氏菌(cre)chs67(nr48569)、肺炎克雷伯氏菌va360(nr48977)、铜绿假单胞菌(atcc27853)、铜绿假单胞菌mrsn 1356(nr51521)、铜绿假单胞菌mrsn 1380(nr51522)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)(atcc baa 2721)、肠沙门氏菌鼠伤寒血清型(s.entericaserovar typhimurium)(nr4333)、洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderia cepacian)(ucb717)和肺炎链球菌(s.pneumoniae)(atcc 6301)。通过下述方法生成耐粘菌素菌株。
112、药物级玫瑰红(hp-rbf)的配制。
113、玫瑰红二钠盐制剂(10％)的盐水溶液(hp-rbf)由provectusbiopharmaceuticals，inc.(knoxville，tn，美国)提供。hp-rbf(＞99.5％)根据provectus的合成和利用作为用于商业用途的可行药物物质的rb分子的专有方法合成。详细步骤先前描述在[35]和先前提到的singer等人的美国专利第8,530,675号、第9,273,022号和第9,422,260号的美国专利中。
114、对数期细菌培养
115、所有液体细菌培养均在带有空气过滤器的锥形瓶中进行。单一细菌菌株菌落在atcc建议的推荐条件下生长。将培养瓶在振摇培养箱中在37℃下以200rpm的振摇速度培养24小时(h)，并且培养至对数中期(光密度-0.5)。使用96孔微孔板读数器在600nm下监测光密度。
116、最低抑菌浓度(mic)的确定
117、所有测定均通过按照临床和实验室标准协会(clsi；wayne,pa,美国)设定的指南进行。通过肉汤稀释微孔板阿尔玛蓝测定或通过od测量来确定最低抑菌浓度(mic)。将所有商业化合物储存在dmso或盐水中(1mg/100μl浓度)。用盐水稀释10％玫瑰红二钠盐制剂的盐水溶液(hp-rbf)以形成1mg/100l储备溶液。在实验的持续时间内，将储备溶液等分试样储存在4℃下。
118、将来自储备溶液的每种化合物置于无菌96孔板的第一个孔中，并且用培养肉汤(总体积为10μl)进行连续稀释。将对数期的细菌悬浮液(190μl)置于每个孔(总体积为200μl)中，在有氧条件下用抗细菌剂的连续稀释液处理，并且在37℃下培养24小时。
119、在荧光灯(17w，63.8cm2，sunblaster holdings)和led(9.5w，28.3cm2，philips)下进行hr-rbf的mic研究。通过uv-vis分光光度计测量od。将刃天青(20μl)在振摇培养箱上在37℃下孵育2小时。参见美国国家临床实验室标准委员会[(nccls)；方法(粉红色＝生长，蓝色＝无可见生长)]。在进行比色测定之前，对所有研究进行od测量。使用biotek synergyxt，96孔板读数器在570nm和600nm下进行吸光度测量。
120、耐药革兰氏阴性细菌菌株的生成
121、按照相同的程序生成测试细菌菌株的耐粘菌素突变体。将细菌培养物(100μl，1×107cfu/ml)铺板在含有粘菌素[最低杀菌浓度(mbc)]的琼脂平板(55cm2)上。收集在含有粘菌素的琼脂平板上生长的菌落，并且悬浮在pbs缓冲液(约1×107cfu/ml)中，并且将100l细菌悬浮液铺板在含有抗生素(1.5×mbc)的琼脂平板上。重复该过程直至细胞获得比野生型高＞10倍的mic水平；抗生素浓度逐递增加(2.0x、2.5x、3.0x、3.5x、4.0x、5.0x、7.0x、8.0x、9.0x、10.0x、20x和50x mbc)。分离的耐药细胞用生成的耐药菌株通过mic测定确认。
122、时间-杀灭动力学测定
123、基于clsi指南(带有略微修改)进行抗微生物剂的时间-杀灭动力学测定。进行hp-rbf和参考分子的时间-杀灭动力学测定中的多个时间点。将在肉汤中生长的细菌培养物用hp-rbf的储备稀释液稀释至1×108至5.0×109cfu/ml的浓度，该稀释液以mic值的5倍制备。
124、将测试化合物用等体积的置于96孔板中的指定细菌接种。将微量滴定板在荧光灯下在37℃下和以持续时间(1-30分钟)孵育(条件概述在上表图例中)。从每个孔中取出培养基的等分试样，并且进行连续稀释。将稀释的培养物在37℃下培养，并且计数cfu/ml。杀细菌活性定义为菌落形成单位减少大于3个对数倍。
125、引用文献
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技术实现思路