专利名称:FeLV疫苗的无针施用的制作方法
参考引用本申请要求2004年6月4日提交的美国临时专利申请系列号60/576,771的权益。
前述的申请和在其中或其审查期间引用的所有文件(“申请引用文件”)及所有在“申请引用文件”中引用或参考的文件和所有在这里引用或参考的文件(“此处引用的文件”)及所有在“此处引用的文件”中引用或参考的文件以及对这里或者在这里引作参考的任何文件所提到的任何产品的任何厂商的用法说明书、描述、产品规格和产品小册子，均在此引入作为参考，并可能在本发明的实施中使用。
发明领域本发明提供为猫科动物接种疫苗对抗猫白血病的方法。
背景技术：
FeLV是全世界常见的家猫感染，导致显著的发病率和死亡率。抗原血症的患病率可从在健康猫中的1-5％到在病猫中的15-30％而变化(Hosie M.J.等人，Veterinary Records，1989，128，293-297；Braley J.，Feline Practice，1994，22，25-29；Malik R.等人，Australian Veterinary Journal，1997，75，323-327；Arjona A.等人，Journal of Clinical Microbiology，2000，38，3448-3449)。这种病毒可建立以持续性病毒血症和致死性后果为特征的终身感染。大多数FeLV相关的疾病出现在持续感染的动物中，这些疾病通常是严重的而且大多数是致命的。最常诊断出的病症有淋巴瘤、髓细胞性白血病、免疫缺陷以及非再生障碍性贫血。这种感染可通过识别和隔离为感染源的持续病毒血症的猫来加以控制，疫苗也已帮助阻止病毒的传播。目前有几种FeLV疫苗可以用，它们大多含有灭活病毒或重组亚单位。其效用尚存在争议(Sparkes A.H.，Journal of Small AnimalPractice，1997，38，187-194)。已经观察到疫苗失效(breakdown)，需要改进功效，特别是需要在现场状况中更多的保护证据。替代方法是使用重组病毒载体。已测试了金丝雀痘病毒载体，特别是ALVAC载体的FeLV基因表达(Tartaglia J.等人，Journal of Virology，1993，67，2370-2375；Poulet H.等人，Veterinary Record，2003，153，141-145)。商业化的重组FeLV疫苗也可获得(EURIFELFeLV，Merial)。
因此普遍需要改进FeLV疫苗的功效和安全性。
一般来说，提高疫苗的功效可通过给予较高剂量免疫原，或使用佐剂配制疫苗，或这二者的组合。
给予较高剂量免疫原显著增加了疫苗的成本，这样一来，消费者会觉得疫苗太昂贵。
另一方面，使用佐剂配制疫苗使疫苗更有效，有时可以减少免疫原的量。然而，佐剂化疫苗比非佐剂化疫苗诱发较高比率的局部不良反应(Gobar等人，JAVMA，2002，220(10)，1477-1482)，从而增大注射部位疫苗相关的纤维肉瘤的风险(Baker R.J.，Feline Practice，1998，26(5)，18-20)。
还已提议在兽医领域中使用无针注射器(WO-A-98/03659；WO-A-92/15330；WO-A-98/03658；van Rooij等人，Vet.Immunol.Immunopathol.，1998，66(2)，113-126；US-A-6,451,770；Schrijver等人，Vaccine，1998，16(2-3)，130-134)。但在现有技术中却有相互矛盾的结果(McKercher P.D.等人，Can.J.Comp.Med.，1976，40，67-74；Epstein，Hum.Gene Ther.，2002，13(13)，275-280；Haensler，Vaccine，1999，17(7-8)，628-638)。
此申请中对任何文件的引用或确认并不承认这些文件可以作为本发明的现有技术获得。
发明概述本发明的目的在于提供新的接种猫科动物的方法，该方法有效、使用更容易且成本较低，并增加安全性。
此目的通过借助喷液(liquid jet)无针注射器施用基于病毒载体的FeLV重组疫苗来满足，确保疫苗基本上分布于动物的真皮和皮下。
本发明的第一个目的是针对FeLV的疫苗接种方法，其可包括使用喷液无针注射器将有效量的基于病毒载体的FeLV重组疫苗基本上施用于猫科动物的真皮和皮下的步骤，该施用引发针对FeLV的安全的和保护性的免疫应答。
本发明的另一个目的是疫苗接种试剂盒或套盒，其可包括这种喷液无针注射器和至少一个含有基于病毒载体的FeLV重组疫苗的疫苗小瓶，其有效装配以实施将疫苗基本上施用于猫科动物的真皮和皮下以引发针对FeLV的安全的和保护性的免疫应答。
本发明的另一个目的是可编码并表达至少一种FeLV免疫原的重组病毒载体和可接受的赋形剂或稀释剂的应用，用于制备被设计成用喷液无针注射器基本上施用于猫科动物的真皮和皮下，从而引发针对FeLV的安全的和保护性的免疫应答的液体疫苗。
需要注意的是，在本文公开内容特别是在权利要求
和/或段落中，如“包含”等类似的术语可具有在美国专利法中归于其的含义，例如它们可能意味着“包括等类似含义；如“基本上由……组成”的术语具有在美国专利法中赋予其的含义，例如它们可允许未明确引述的成分，但排除在现有技术中发现的成分或影响本发明的基本特征或新特征的成分。
这些和其它实施方案被公开或由下面的详细描述显而易见且包括在内。
附图的简要描述下面以实例给出的详细描述，并非有意将本发明局限于所描述的特定实施方案，可以结合附图加以理解，将其引入作为参考，其中图1例示了使用无针注射器注射到猫的稀释的中国墨汁的分布情况。黑色箭头指示墨汁在真皮和皮下分布的区域。
图2例示了使用无针注射器注射到猫的稀释的中国墨汁的分布情况。黑色箭头指示墨汁在真皮内分布的区域。
详细描述本发明涉及针对FeLV的疫苗接种方法，包括使用喷液无针注射器将有效量的基于病毒载体的FeLV重组疫苗基本上施用于猫科动物的真皮和皮下的步骤，该施用引发针对FeLV的安全的和保护性的免疫应答。
“基本上”意思是指有些疫苗也可能在表皮或肌肉中被发现。
保护性免疫应答的特征为在攻击后抗原血症显著减轻或显著的中和抗体滴度。安全的免疫应答的特征是与疫苗施用相关的负作用的局限，尤其是局部注射部位反应的显著减轻或缺乏，以及疫苗施用后厌食和抑郁等症状的显著减轻或缺乏。
猫科动物包括猫，这包括新生、幼崽、雄性、雌性、怀孕雌性。
疫苗包含重组病毒载体和可接受的赋形剂或稀释剂。重组病毒载体特别包括疱疹病毒、腺病毒和诸如禽痘(US-A-5,174,993；US-A-5,505,941和US-A-5,766,599)或金丝雀痘等的痘病毒(US-A-5,756,103)。赋形剂或稀释剂包括但并不局限于无菌水、生理盐水、葡萄糖、缓冲液等类似液体。赋形剂或稀释剂还可包括多元醇、糖族或pH缓冲剂。赋形剂或稀释剂还可包括例如氨基酸、肽、抗氧化剂、杀菌剂、抑菌化合物。
重组病毒载体编码并表达至少一种FeLV免疫原，尤其是FeLV env基因或FeLV env和gag/pro基因。FeLV基因组的完整序列可以在Chen等人，J Virol.1998 Sep；72(9)7048-56中找到，结合常规实验方法，可使本领域技术人员确定任何FeLV免疫原的序列。
在这一实施方案的优选方面，本发明的方法是利用表达FeLV env或FeLV env和gag/pro基因的重组金丝雀痘病毒(如vCP97构建体，见US-A-5.756.103中的实施例53)来实施的。
作为本发明的可选方面，本发明的方法利用表达FeLV env或FeLVenv和gag/pro基因的重组禽痘病毒来实施。
本发明进一步包括至少一种FeLV免疫原，其包含于载体分子或表达载体中，与启动子元件及可选地与增强子可操作性连接。
在一有利实施方案中，启动子为巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因的启动子。在另一有利实施方案中，启动子和/或增强子为氧诱导型。可用于本发明方法的氧诱导型启动子和/或增强子的实例包括但不限于早期生长反应-1(Egr1)启动子(见例如Park等人，J Clin Invest.2002 Aug；110(3)403-1)，缺氧诱导因子(HIF)诱导型增强子(见例如Cuevas等人，Cancer Res.2003 Oct 15；63(20)6877-84)和Mn-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)启动子(见例如Gao等人，Gene.1996Oct 17；176(1-2)269-70)。
在另一实施方案中，启动子和/或增强子包括多种细胞或组织特异性启动子(如肌肉、内皮细胞、肝、体细胞或干细胞)，多种病毒启动子和增强子，以及对各种动物物种等基因特异性的多种FeLV免疫原序列。已描述的肌肉特异性启动子和增强子的例子是本领域技术人员已知的(见例如Li等人，Gene Ther.1999 Dec；6(12)2005-11；Li等人，Nat Biotechnol.1999 Mar；17(3)241-5和Loirat等人，Virology.1999 Jul 20；260(1)74-83；其公开内容整体引作参考)。
本发明中可使用的启动子和增强子包括但不限于劳斯肉瘤病毒的LTR、HSV-1的TK、SV40的早期或晚期启动子、腺病毒主要晚期(MLP)，磷酸甘油酸酯激酶、金属硫蛋白、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、胶原酶、弹性蛋白酶I、β-肌动蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、α-胎蛋白、肌肉肌酸激酶。
“载体”是指重组DNA或RNA质粒或病毒，其含有有待在体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可以包含以治疗为目的的感兴趣基因序列，并可任选地为表达盒形式。正如在此处所用的，载体并不需要能够在最终的靶细胞或对象中复制。该术语包括克隆载体，病毒载体也包括在内。
术语“重组”意为半合成或合成来源的多核苷酸，其不存在于自然界中或以自然界未发现的排列与另一多核苷酸连接。
“异源”是指源自遗传上独特的实体，其不同于与之相比较的实体的其余部分。例如，多核苷酸可以通过基因工程技术置入得自另一不同来源的质粒或载体中，并称为异源多核苷酸。从它的天然编码序列中移出并有效连接到非天然序列的编码序列的启动子为异源启动子。
本发明的多核苷酸可以包含额外序列，例如在同一转录单元中的附加编码序列，控制元件如启动子，核糖体结合位点，多聚腺苷酸位点，处于同一或不同启动子控制的其他转录单元，允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，以及可能对于提供本发明实施方案理想的任何这类构建体。
本发明包括表达FeLV免疫原或其变体或同源物或片段的载体。表达FeLV免疫原的元件有利地存在于本发明的载体中。最低限度地，这包含、基本上组成或组成为起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地对某些载体如质粒和特定病毒载体如不是痘病毒的病毒载体还有多聚腺苷酸序列。当多核苷酸编码多蛋白片段如FeLV免疫原时，有利的是在载体中，ATG置于阅读框的5’端，终止密码子置于3’端。其他控制表达的元件也可存在，如增强子序列、稳定序列如内含子和使蛋白分泌的信号序列。
制备和/或施用载体或重组体或质粒以在体内或体外表达本发明基因的基因产物的方法可以是任何期望的方法，例如可通过以下文件中公开的方法或以下文件中引述的文件中公开的方法或类似方法美国专利4,603,112；4,769,330；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；4,945,050；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；5,591,639；5,589,466；5,677,178；5,591,439；5,552,143；5,580,859；6,130,066；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,348,450和6；312,683；美国专利申请系列号920,197，申请日为1986年10月16日；WO 90/01543；WO 91/11525；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 98/33510；EP 265785；EP 0 370 573；Andreansky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311313-11318；Ballay等人，EMBO J.1993；43861-65；Felgner等人，J.Biol.Chem.1994；2692550-2561；Frolov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；9311371-11377；Graham，Tibtech1990；885-87；Grunhaus等人，Sem.Virol.1992；3237-52；Ju等人，Diabetologia 1998；41736-739；Kitson等人，J.Virol.1991；653068-3075；McClements等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311414-11420；Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311341-11348；Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311349-11353；Pennock等人，Mol.Cell.Biol.1984；4399-406；Richardson(Ed)，Methods in Molecular Biology1995；39，“Baculovirus Expression Protocols，”Humana PressInc.；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.1983；32156-2165；Robertson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；9311334-11340；Robinson等人，Sem.Imm unol.1997；9271；和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；9311307-11312。由此，本发明中的载体可以是任意合适的重组病毒或病毒载体，例如痘病毒(如痘苗病毒、鸟痘病毒、金丝雀痘病毒、禽痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)，腺病毒(如人腺病毒、犬腺病毒)，疱疹病毒(如犬疱疹病毒)，杆状病毒，逆转录病毒等(如本文引作参考的文件中)；或载体可为质粒。这里引用或引入作为参考的文件，除了提供在本发明实施中有用的载体实例外，还可以提供诸如非-FeLV免疫原、非-FeLV抗原肽或其片段和细胞因子等的非-FeLV免疫原的来源，这些非-FeLV免疫原有待通过在本发明组合物中或其所包括在内的载体表达。
本发明还涉及包含载体如表达载体的制剂，如治疗组合物。这种制剂可以包含、基本上组成或组成为一种或多种载体，如表达载体，例如体内表达载体，所述载体包含、基本上组成或组成为(并有利地表达)一种或多种FeLV免疫原。有利的是，这种载体包含并表达多核苷酸，该多核苷酸包括、基本上组成或组成为编码一种或多种FeLV免疫原的编码区；和药学或兽医学上可以接受的载体、赋形剂或介质。这样，根据本发明的一个实施方案，制剂中的另一载体或多种载体包含、基本上组成或组成为，编码FeLV免疫原或其片段的一种或多种其它蛋白的多核苷酸，并在适宜的情况下所述载体表达所述蛋白。
根据本发明的另一实施方案，制剂中的一种或多种载体包含、基本上组成或组成为，编码FeLV免疫原的一种或多种蛋白或其片段的多核苷酸，所述载体具有所述多核苷酸的表达。本发明的制剂有利地包含、基本上组成或组成为至少两种载体，其包含、基本上组成或组成为，来自不同FeLV分离株的编码相同蛋白和/或不同蛋白(但有利地编码相同的蛋白)的多核苷酸，并且有利的是所述载体还表达所述多核苷酸，有利地在体内在适宜条件下或合适状况下或在合适的宿主细胞中。制剂含有一种或多种载体，所述载体含有、基本上组成或组成为，编码(并有利地表达，有利地在体内)FeLV肽、融合蛋白或其表位的多核苷酸。
根据本发明的一个实施方案，表达载体是病毒载体，特别是体内表达载体。在有利的实施方案中，表达载体是腺病毒载体。有利的是，腺病毒载体是人Ad5载体，E1-缺失和/或E3-缺失的腺病毒。
在一个特定实施方案中，病毒载体是痘病毒，如痘苗病毒或减毒痘苗病毒(例如MVA，Ankara疫苗株在鸡胚成纤维细胞上传代超过570次后获得的经修饰的Ankara株，见Stickl & Hochstein-Mintzel，Munch.Med.Wschr.，1971，113，1149-1153；Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992，89，10847-10851；可作为ATCCVR-1508得到；或NYVAC，见美国专利5,494,807，例如实施例1到6，以及下列等等，美国专利5,494,807，其中讨论了NYVAC的构建以及带有从哥本哈根株痘苗病毒基因组中删除的额外ORF的NYVAC变异以及将异源编码核酸分子插入该重组体的位点，以及匹配启动子的应用；也参见WO96/40241)，鸟痘病毒或减毒鸟痘病毒(如金丝雀痘，禽痘，斑鸠痘，鸽痘，鹌鹑痘，ALVAC或TROVAC；见例如美国专利号5,505,941，5,494,807)，猪痘病毒，浣熊痘病毒，骆驼痘病毒或粘液瘤病病毒。
根据本发明的另一个实施方案，痘病毒载体是金丝雀痘病毒或禽痘病毒载体，有利的是减毒的金丝雀痘病毒或禽痘病毒。在这方面，金丝雀疸可获自ATCC登录号VR-111。减毒的金丝雀痘病毒描述于美国专利No.5,756,103(ALVAC)和WO01/05934。众多禽痘病毒疫苗接种株也可得到，例如由MERIAL上市的DIFTOSEC CT株和由INTERVET上市的NOBILIS VARIOLE疫苗；并可参考美国专利No.5,766,599，其涉及减毒的禽痘株TROVAC。
有关生成其重组体的方法和如何施用其重组体的信息，技术人员可参考本文引用的文件和WO90/12882，例如，有关痘苗病毒，可提及美国专利No.4,769,330，4,722,848，4,603,112，5,110,587，5,494,807和5,762,938等等；有关禽痘，可提及美国专利No.5,174,993，5,505,941和US-5,766,599等；有关金丝雀痘，可提及美国专利No.5,756,103等；有关猪痘，可提及美国专利No.5,382,425等；以及有关浣熊痘，可提及WO00/03030等。
当表达载体是痘苗病毒时，有待表达的多核苷酸的插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点，血细胞凝集素(HA)基因或插入位点，编码A型包含体(ATI)的区域；还参见本文引用的文件，特别是涉及痘苗病毒的那些。在金丝雀痘的情况下，有利的是插入位点是ORF C3、C5和/或C6；还参见本文引用的文件，特别是涉及金丝雀痘病毒的那些。在禽痘的情况下，有利的是插入位点是ORF F7和/或F8；还参见本文引用的文件，特别是涉及禽痘病毒的那些。MVA病毒的插入位点有利地是如同在多种出版物中，包括Carroll M.W.等人，Vaccine，1997，15(4)，387-394；Stittelaar K.J.等人，J.Virol.，2000，74(9)，4236-4243；Sutter G.等人，1994，Vaccine，12(11)，1032-1040；并且在这方面，还注意到完整的MVA基因组描述于AntoineG.，Virology，1998，244，365-396，其使得技术人员能够使用其它插入位点或其它启动子。
有利的是，有待表达的多核苷酸插入特定痘病毒启动子控制之下，如痘苗启动子7.5 kDa(Cochran等人，J.Virology，1985，54，30-35)，痘苗启动子I3L(Riviere等人，J.Virology，1992，66，3424-3434)，痘苗启动子HA(Shida，Virology，1986，150，451-457)，牛痘启动子ATI(Funahashi等人，J.Gen.Virol.，1988，69，35-47)，痘苗启动子H6(Taylor J.等人，Vaccine，1988，6，504-508；Guo P.等人J.Virol.，1989，63，4189-4198；Perkus M.等人，J.Virol.，1989，63，3829-3836)等等。
在特定实施方案中，病毒载体是腺病毒，如人腺病毒(HAV)或犬腺病毒(CAV)。
在一个实施方案中，病毒载体是人腺病毒，特别是血清型5腺病毒，通过病毒基因组的E1区域中的缺失(特别是从大约核苷酸459到大约核苷酸3510，参考hAd5的序列，公开于GenBank登录号M73260和参考文献出版物J.Chroboczek等人，Virol.1992，186，280-285中)而使得不能复制。缺失的腺病毒在表达E1的293(F.Graham等人，J.Gen.Virol.1977，36，59-72)或PER细胞特别是PER.C6(F.Falloux等人，Human Gene Therapy 1998，9，1909-1917)中繁殖。人腺病毒可以在E3区域中缺失，特别是从大约核苷酸28592到大约核苷酸30470。E1区域中的缺失可以和E3区域中的缺失结合进行(见J.Shriver等人Nature，2002，415，331-335，F.Graham等人，Methods in Molecular Biology Vol.7Gene Transfer andExpression Protocols Edited by E.Murray，The Human Press Inc，1991，p 109-128；Y.Ilan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592；US6,133,028；US6,692,956；S.Tripathy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561；B.Tapnell Adv.DrugDeliv.Rev.1993，12，185-199；X.Danthinne等人，Gene Thrapy2000，7，1707-1714；K.Berkner Bio Techniques 1988，6，616-629；K.Berkner等人，Nucl.Acid Res.1983，11，6003-6020；C.Chavier等人，J.Virol.1996，70，4805-4810)。最终在E1和/或E3区域部分或完全缺失后，插入位点可以为E1和/或E3基因座(区域)。有利的是，当表达载体是腺病毒时，有待表达的多核苷酸插入到在真核细胞中有功能的启动子的控制之下，如强启动子，优选巨细胞病毒即刻早期基因启动子(CMV-IE启动子)，特别是在M.Boshart等人，Cell 1985，41，521-530中从大约核苷酸-734到大约核苷酸+7的增强子/启动子区域，或者是来自Promega公司的pCI载体的增强子/启动子区域。CMV-IE启动子有利地是鼠或人来源的。也可使用延伸因子1α的启动子。在一个特定实施方案中，可以使用受缺氧调控的启动子如在K.Boast等人，Human Gene Therapy1999，13，2197-2208中所述的启动子HRE。还可以使用肌肉特异性启动子(X.Li等人，Nat.Biotechnol.1999，17，241-245)。本文还关于质粒载体讨论了强启动子。在一个实施方案中，剪接序列可位于增强子/启动子区域下游。例如，从CMV-IE基因中分离的内含子1(R.Stenberg等人，J.Virol.1984，49，190)，从兔或人的β-珠蛋白基因中分离的内含子，特别是b-珠蛋白的内含子2，从免疫球蛋白中分离的内含子，来自SV40早期基因的剪接序列，或者是从包含与小鼠免疫球蛋白受体序列融合的人β-珠蛋白供体序列的Promega公司的pCI载体中分离的嵌合内含子序列(Genbank中登录号为CVU47120中从大约890到大约核苷酸1022)。poly(A)序列和终止子序列可插入有待表达的多核苷酸的下游，如牛生长激素基因，特别是Genbank中登录号为BOVGHRH中从大约核苷酸2339到大约核苷酸2550，兔β-珠蛋白基因或SV40晚期基因多聚腺苷酸化信号。
在另一个实施方案中，病毒载体为犬腺病毒，特别是CAV-2(见例如L.Fischer等人Vaccine，2002，20，3485-3497；美国专利5,529,780；美国专利5,688,920；PCT申请号WO95/14102)。对于CAV，插入位点可以是在E3区域中和/或在位于E4区域和右ITR区域之间的区域中(参见美国专利6,090,393；美国专利6,156,567)。在一个实施方案中，插入序列处于启动子控制之下，如巨细胞病毒即刻早期基因启动子(CMV-IE启动子)或已对人腺病毒载体描述的启动子。poly(A)序列和终止子序列可以插入有待表达的多核苷酸的下游，如牛生长激素基因或兔β-珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。
在另一个特定实施方案中，病毒载体为疱疹病毒，如犬疱疹病毒(CHV)或猫疱疹病毒(FHV)。对于CHV，插入位点可以特别在胸苷激酶基因中、在ORF3中或在UL43ORF中(参见美国专利号6,159,477)。在一个实施方案中，有待表达的多核苷酸插入到在真核细胞中有功能的启动子控制之下，有利地是CMV-IE启动子(鼠或人)。在一个特定实施方案中，可以使用受缺氧调控的启动子，如在K.Boast等人，HumanGene Therapy1999，13，2197-2208中描述的启动子HRE。poly(A)序列和终止子序列可以插入到有待表达的多核苷酸的下游，如牛生长激素或兔β-珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。
根据本发明又一个实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在一个具体非限定性的实例中，可以将pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke C.等人，Journal ofInfectious Diseases，1997，175，91-97；Hartikka J.等人，HumanGene Therapy，1996，7，1205-1217，见例如美国专利号5,846,946和6,451,769)用作载体以插入多核苷酸序列。pVR1020质粒源于pVR1012，包含人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号包含Genbank中登录号HUMTPA14从氨基酸M(1)到氨基酸S(23)。在另一个具体非限定性实例中，用作插入多核苷酸序列的载体的质粒可以包含马IGF1的信号肽序列，Genbank中登录号U28070从氨基酸M(24)到氨基酸A(48)。关于可在实践中考虑或采用的DNA质粒的其它信息可在例如以下美国专利中找到6,852,705、6,818,628、6,586,412、6,576,243、6,558,674、6,464,984、6,451,770、6,376,473和6,221,362。
术语质粒涵盖任何DNA转录单元，其包含根据本发明的多核苷酸和其在所需宿主或靶标的细胞中体内表达所必需的元件；在这方面，应注意到，超螺旋的或非超螺旋的、环状质粒，以及线性形式，都意图落在本发明的范围内。
每一质粒包含或含有或基本上组成为，除了编码FeLV免疫原或其变体、类似物和片段的多核苷酸，与启动子可操作性连接或处于启动子控制下或依赖于启动子。总的来说，有利地是采用在真核细胞中有功能的强启动子。优选的强启动子是人或鼠来源的即刻早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选地具有另一来源如大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可包含实际的启动子部分，该部分可以与或不与增强子部分相连。可参考EP-A-260 148，EP-A-323 597，美国专利5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及PCT申请号WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(Boshart M.等人，Cell.，1985，41，521-530)和鼠CMV-IE。
更广义地，启动子具有病毒或细胞来源。可在本发明实施中有效采用的除CMV-IE以外的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可在本发明的实施中有效采用的强细胞启动子是细胞骨架的基因的启动子，如结蛋白启动子(Kwissa M.等人，Vaccine，2000，18，2337-2344)，或肌动蛋白启动子(MiyazakiJ.等人，Gene，1989，79，269-277)。
这些启动子的功能性亚片段，即这些启动子维持适当启动活性的部分，包括在本发明内，例如根据PCT申请号WO98/00166或美国专利6,156,567的截短的CMV-IE启动子可用于实施本发明。在本发明实施中的启动子因而包括全长启动的衍生物和亚片段，其维持适当的启动活性因此发挥启动子作用，优选启动活性基本上类似于所述衍生物或亚片段来源的实际或全长的启动子，例如美国专利6,156,567的截短的CMV-IE启动子的活性类似于全长CMV-IE启动子的活性。因此，本发明实施中的CMV-IE启动子可包含或基本上组成或组成为，全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及衍生物和亚片段。
优选地，质粒包含或基本上组成为其它表达控制元件。特别有利的是引入稳定序列，例如内含子序列，优选hCMV-IE的第一个内含子(PCT申请号WO89/01036)，兔b-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人，Science，1979，206，337-344)。
至于对于质粒和除痘病毒以外的病毒载体的多聚腺苷酸化信号(polyA)，更多的可以使用牛生长激素(bGH)基因的poly(A)信号(见美国专利5,122,458)、或兔b-珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。
根据本发明的另一实施方案，表达载体是用于在合适的细胞体系中体外表达蛋白的表达载体。表达的蛋白可以在培养物上清液中或从中收获，在分泌之后或不在分泌之后(如果没有分泌，通常发生或进行细胞裂解)，任选地通过浓缩方法如超滤法进行浓缩和/或通过纯化手段如亲和、离子交换、凝胶过滤-型色谱法进行纯化。
可用于本发明中的宿主细胞包括但不限于肌肉细胞、角质形成细胞、成肌细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、vero细胞、BHK21、sf9细胞等类似细胞。本领域技术人员理解，根据特定基因，培养宿主细胞的条件不同，并且有时候需要进行常规实验来确定取决于宿主细胞培养FeLV的最优化条件。例如，编码FeLV免疫原的载体可以转化到成肌细胞(该细胞可从来自需要治疗的动物的肌肉组织获得)中，且可将经转化的成肌细胞移植到动物。另一个实例中，角质形成细胞也可以用编码FeLV免疫原的载体转化并移植到动物体内，导致FeLV免疫原分泌到循环中。
“宿主细胞”是指已经遗传改变或能够被遗传改变(通过施用外源多核苷酸(如重组质粒或载体))的原核或真核细胞。当谈到经遗传改变的细胞时，该术语既指原始改变的细胞，也指其后代。
包含目的序列的多核苷酸可以插入合适的克隆或表达载体中，该载体接下来可以导入合适的宿主细胞以进行复制和扩增。多核苷酸可以通过本领域已知的各种方法导入宿主细胞。含目的多核苷酸的载体可以通过多种适宜方法中的任何方法导入宿主细胞，包括直接摄取、胞吞作用、转染、f-交配、电穿孔，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂质转染；和感染(当载体是感染性的，例如逆转录病毒载体)。导入载体或多核苷酸的选择常取决于宿主细胞的特征。
在有利的实施方案中，本发明提供施用治疗有效量的制剂以在靶细胞中递送和表达FeLV免疫原。治疗有效量的确定对本领域技术人员而言是常规试验。一个实施方案中，制剂包含包括表达FeLV免疫原的多核苷酸的表达载体，以及药学或兽医学上可以接受的载体、介质或赋形剂。在有利的实施方案中，药学或兽医学上可以接受的载体、介质或赋形剂有利于转染和/或改善载体或蛋白的保存。
本领域技术人员熟知药学或兽医学上可以接受的载体或介质或赋形剂。例如药学或兽医学上可以接受的载体或介质或赋形剂可以是0.9％NaCl(如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液，可用于本发明方法的其它药学或兽医学上可以接受的载体或介质或赋形剂包括但不限于多聚-(L-谷氨酸)和聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学上可以接受的载体或介质或赋形剂可以是任何化合物或化合物的组合，其有利于载体的(或本发明载体在体外表达的蛋白)的施用；有利的是，所述载体、介质或赋形剂可有利于转染和/或改善载体(或蛋白)的保存。剂量和剂量体积在此只以一般描述讨论，其也可由本领域技术人员通过阅读本文公开内容并结合本领域知识来确定，无需任何过度实验。
有利地但不排外地适合于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质有利地是具有以下结构式的那些 其中，R1为具有12-18个碳原子的饱和或不饱和的直链脂族基团；R2是含有2或3个碳原子的另一脂族基团而X是胺或羟基基团，如DMRIE。在另一实施方案中，阳离子脂质可以和中性脂质如DOPE相结合。
在这些阳离子脂质中，优选DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质相结合，其中中性脂质有利地是DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389)，以形成DMRIE-DOPE。
有利的是，临时形成质粒与佐剂的混合物，并且有利地是与制备物的施用同时进行或在制备物的施用前不久进行；例如，在施用之间不久，形成质粒-佐剂混合物，有利地是在施用之前给出足够的时间，以使混合物形成复合物，例如在施用之前约10-约60分钟，如在施用之前约30分钟。
当DOPE存在时，DMRIE∶DOPE的摩尔比有利地时大约95∶大约5到大约5∶大约95，更有利地是大约1∶大约1，例如1∶1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂∶质粒的重量比可以是大约50∶大约1到大约1∶大约10，如大约10∶大约1到大约1∶大约5，有利地是大约1∶大约1到大约1∶大约2，例如1∶1-1∶2。
丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物优选是交联的，特别是与糖的聚烯基醚类或多元醇类。这些化合物已知称为卡波姆(Pharmeuropa vol.8，No.2，June 1996)。本领域技术人员也可以参考US-A-2,909,462，其中描述了这类与多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团替代。优选的基团是含有2-4个碳原子的那些，如乙烯基、烯丙基和其它乙烯型不饱和基团。所述不饱和基团可以本身含有其它取代基，如甲基。以商品名Carbopol出售的产品(BF Goodrich，Ohio，USA)特别适宜。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中可以提及Carbopol974P、934P和971P。
在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中，优选EMA共聚物(Monsanto)，其是马来酸酐和乙烯的共聚物，为线性或交联的，例如与二乙烯醚交联。可参考J.Fields等人，Nature，186778-780，Jun.4，1960。
有用的佐剂的比例是本领域技术人员熟知的和容易得到的。举例而言，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或马来酸酐和烯基共聚物在最终疫苗组合物中的浓度将从0.01％到1.5％W/V，更特别是从0.05到1％W/V，优选从0.1到0.4％W/V。
任选地，根据本发明方法使用的疫苗可含有细胞因子。细胞因子可作为蛋白或作为插入重组病毒载体的编码该细胞因子的基因存在。细胞因子可选自猫细胞因子，如猫白细胞介素18(fIL-18)(Taylor S.等人，DNA Seq.，2000，10(6)，387-394)，fIL-16(Leutenegger C.M.等人，DNA Seq.，1998，9(1)，59-63)，fIL-12(Fehr D.等人，DNASeq.，1997，8(1-2)，77-82；Imamura T.等人，J.Vet.Med.Sci.，2000，62(10)，1079-1087)和猫GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)(GenBank AF053007)。
在特定实施方案中，药物组合物在体内直接给药，且编码的产物由载体在宿主中表达。在体内递送编码FeLV免疫原的载体的方法(见例如美国专利6,423,693；专利公开EP 1052286，EP 1205551，美国专利公开20040057941，WO 9905300和Draghia-Akli等人，Mol Ther.2002 Dec；6(6)830-6；其公开内容整体引作参考)可经修改来将本发明的FeLV免疫原递送给猫。本文描述的对编码FeLV免疫原的载体的体内递送可由本领域技术人员在上述参考文献的教导下完成。
有利的是，根据本发明的药物和/或治疗组合物和/或制剂包含或基本上组成或组成为，引发治疗反应有效量的一种或多种本文讨论的表达载体和/或多肽；并且有效量可由本文公开内容包括此处引入的文件和本领域的知识来确定，无需过度实验。
在基于质粒载体的治疗和/或药物组合物的情况下，通常而言，一剂可包含、基本上组成或组成为，大约1mg到大约2000mg，有利地是大约50mg到大约1000mg，更有利地是大约100μg到大约800μg表达FeLV免疫原的质粒。当基于质粒载体的治疗和/或药物组合物以电穿孔法施用时，质粒剂量通常为大约0.1μg到1mg，有利地是大约1μg到100μg，有利地是大约2μg到50μg。剂量体积可以是大约0.1到大约2ml，有利地是大约0.2到大约1ml。这些剂量和剂量体积适于治疗猫和其他哺乳动物目标物种，如马和犬。
治疗和/或药物组合物每剂包含大约104到大约1011，有利地大约105到1010，更有利地大约106到大约109的表达FeLV免疫原的重组腺病毒的病毒颗粒。在基于痘病毒的治疗和/或药物组合物的情况下，一剂可以为大约102pfu到大约109pfu。药物组合物每剂含有大约105到109，有利地大约106到108pfu的表达FeLV免疫原的痘病毒或疱疹病毒重组体。
用于哺乳动物目标物种的组合物的剂量体积，如猫组合物的剂量体积，基于病毒载体，例如基于非-痘病毒-病毒载体的组合物，通常为大约0.1到大约2.0ml，优选大约0.1到大约1.0ml，更优选大约0.5ml到大约1.0ml。
本领域技术人员应该明白的是，本文公开内容是以举例方式提供的，且本发明不受其所限。根据本文公开内容和本领域的知识，技术人员可以确定施用的次数，施用途径和有待用于每一注射方案的剂量，而无需任何过度实验。
本发明考虑到将有效量的根据本发明制备的治疗组合物对动物进行至少一次施用。动物可以是雄性、雌性、怀孕雌性和新生动物。这种施用可经由多种途径，包括但不限于肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射，或经由鼻内或口服施用。根据本发明的治疗组合物还可以通过无针装置施用(如用Pigjet、Biojector或Vitajet装置(Bioject，Oregon，USA))。另一施用质粒组合物的方法是使用电穿孔(见例如S.Tollefsen等人Vaccine，2002，20，3370-3378；S.Tollefsen等人Scand.J.Immunol.，2003，57，229-238；S.Babiuk等人，Vaccine，2002，20，3399-3408；PCT申请WO99/01158)。在另一实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将质粒递送给动物。在有利的实施方案中，动物是脊椎动物。在更有利的实施方案中，脊椎动物是猫。
喷液无针注射器是实施通过一微孔在高压下注射特定量液体的装置。注射器的机械规格可调节或选择以控制穿透入组织的深度。使用注射器(syringe)或无针注射器(injecto )施用液体最终导致液体在组织中的不同分布。使用注射器导致局部化的团块或池。使用(无针)注射器导致弥散分布在靶向组织的层中，如WO-A-01/13975中例示的。
穿透的深度主要通过液体压力控制。该液体压力取决于注射器的机械规格，如弹簧或任何其它推进手段的强度和活塞和喷口的直径。这是本领域技术人员容易得到的。
注射深度可容易地通过在施用优选具有与预期疫苗相同粘度的有色液体后对注射部位的组织解剖来确定(优选相应于将施用疫苗的位置，并且有利地在与待接种疫苗的种群相同物种和年龄的动物上进行测试)。这种测试可直接用另外含有染料的预期疫苗来进行。这种测试可使本领域技术人员调节注射器的机械规格。
无针注射器可以配备有包括一个或多个喷嘴的头部。使用几个喷嘴可增加疫苗在较大区域内的分散模式。可以有1到10个喷嘴，优选1到6个。
几种注射器可以商购得到。VitajetTM3(Bioject Inc.)特别适于本发明的方法。
有利的是使用配备有允许标准小瓶或安瓿直接与注射器相配的手段的注射器。此外，疫苗小瓶可包含几个疫苗剂量，允许使用注射器和同一小瓶几次注射疫苗和/或接种几个动物。这样，注射器优选能够从同一疫苗小瓶进行连续注射。
本发明还涉及刺激脊椎动物免疫应答的方法。在一个实施方案中，脊椎动物是鸟、猫、牛、狗、鱼、山羊、马、人、小鼠、猴、猪、兔或绵羊。在更有利的实施方案中，脊椎动物是猫。
在本发明的一方面，针对FeLV的疫苗接种可与对抗另一种猫疾病的疫苗接种相结合。疫苗包含根据本发明的病毒载体和能够保护对抗这些其它疾病(尤其是猫疱疹病毒疾病、猫杯状病毒疾病、猫传染性粒细胞缺乏症、副流感病毒2型疾病、猫免疫缺陷病和衣原体病)的疫苗成分。
注射的剂量体积可为大约0.1ml到大约1.0ml，优选大约0.1ml到大约0.8ml，更优选大约0.2ml到大约0.5ml，在优选的应用中，注射的剂量体积可以为0.25ml。一剂的体积定义为是指一次施用于一个动物的疫苗的总体积。
疫苗可含大约104.5到大约108.0TCID50/剂(50％组织培养感染剂量/剂疫苗)，优选大约105.5到大约106.5TCID50/剂。
任选地，施用可以重复，作为加强施用，以合适的间隔，如果必需或期望，例如在第一次施用后大约2到大约8周，优选在第一次施用后大约3-大约5周。加强施用也可以每年重复进行。
本发明的另一个目的是有效量的如上所述的编码并表达至少一种FeLV免疫原的重组病毒载体和可接受的赋形剂或稀释剂的应用，用于制备液体重组病毒疫苗，该疫苗被设计成用如上所述的喷液无针注射器基本上施用于猫科动物的真皮和皮下，并导致引发FeLV的安全的和保护性的免疫应答。
另一目的是疫苗接种试剂盒或套盒(set)，其包括这样的喷液无针注射器和至少一个含有如上所述的基于病毒载体的FeLV重组疫苗的疫苗小瓶，二者有效装配以实施将疫苗施用于猫科动物。疫苗的分布基本上在真皮和皮下完成。
这种疫苗接种试剂盒或套盒能够引发对抗FeLV的安全的和保护性的免疫应答。
现将通过以下非限定性实施例来进一步描述本发明。
实施例1小猫中的无针注射器分布将0.3或0.5ml经稀释的中国墨汁溶液施用于10-14周大小的8只小猫。
注射使用VitajetTM3无针注射器(Bioject Inc.)完成，采用0.006和0.007英寸直径的喷嘴和100#弹簧。注射施用于小猫的腰部区域中或四头肌中，不事先剃毛。
为了观察墨汁的分布，将动物剃毛。
在真皮、皮下区域中发现墨汁，有时在肌肉中发现少量墨汁。使用0.006喷嘴完成的注射和使用0.007喷嘴完成的注射之间没有肉眼可检测到的差异。不同体积(0.3和0.5ml)的分布是相似的。在腰部区域中和在四头肌中的分布是类似的。
图1和2显示了这些注射和墨汁分布的照片。
实施例2用带针头的注射器在小猫中施用疫苗40只8-9周大小的猫随机分为两组，每组20只小猫。
组1小猫在第0天和23天接种在无菌水中的包含表达FeLV env和gag/pro基因的重组金丝雀痘病毒载体(vCP97，见US-A-5.756.103中的实施例53)的疫苗。以1.0ml/剂的体积和以106.6TCID50/剂(50％组织培养感染剂量/剂疫苗)，采用注射器和针头进行皮下注射。
对组2的小猫在第0天和23天用注射器和针头皮下给予安慰剂(1ml无菌水)以用作为对照。
在第49天，以104.96FAID50/ml(50％荧光抗体感染剂量/毫升)，对所有的小猫均用1ml FeLV强毒株(61E病毒株，从NationalInstitutes of Health(NIH)，USA获得)进行攻击(0.5ml经口和0.25ml每只鼻孔)。
在接种和攻击当天，以及攻击后20天和以后4-8周每周一次，采集血样。对血样用商品试剂盒(Virachek，Synbiotics Corp.)检测游离可溶性p27蛋白来测试FeLV抗原血症。当小猫连续3周或不连续5周测试为阳性时，认为抗原血症持续。
FeLV抗原血症组1中，7只小猫具有持续性抗原血症(65％的保护)。组2中17只小猫具有持续性抗原血症，占小猫的85％。
实施例3小猫的无针疫苗注射40只平均年龄为9周的小猫随机分为2组，每组20只小猫。
组1的小猫在第0天和22天接种在无菌水中的包含表达FeLV env和gag/pro基因的金丝雀痘载体(vCP97，见US-A-5.756.103中的实施例53)的重组病毒疫苗。
组2在第0天给予安慰剂(0.25ml无菌水)，作为对照。
所有注射均经由VitajetTM3无针注射器(Bioject Inc.)以每剂0.25ml的体积施用于外侧大腿区域中。以0.007英寸直径的喷嘴和100#弹簧使用无针注射器。
组1中，第一次接种(V1)以106.3TCID50/剂施用疫苗，第二次接种(V2)以105.8TCID50/剂施用疫苗。
在第43天，以105.0TCID50/ml，对所有的小猫均用1ml FeLV强毒株(61E病毒株，从National Institutes of Health(NIH)，USA获得)进行攻击(0.5ml经口和0.25ml每只鼻孔)。
在第一系列接种前一天，第二系列接种前一天，就在攻击之前，在攻击后3周和此后连续8周每周一次，采集血样。对血样用商品试剂盒(Virachek，Synbiotics Corp.)检测游离可溶性p27蛋白来测试FeLV抗原血症。当小猫连续3周或不连续5周测试为阳性时，认为抗原血症持续。
FeLV抗原血症组1中，5只小猫具有持续性抗原血症(75％的保护)。组2中18只小猫具有持续性抗原血症，占小猫的90％。
这些结果的统计学分析显示组1和组2之间的显著性差异(p＝6.861E-05)。
临床体征任何组中没有一只小猫在观察期间厌食。
除对照组中的一只小猫外，没有一只小猫显示出抑郁征象。
没有一只小猫显示出注射部位反应。
结论基于不存在厌食和抑郁和实际上无局部反应，用无针注射器注射的重组病毒疫苗在小猫中是安全的。
当与未接种的对照组相比时，重组病毒疫苗保护小猫对抗FeLV攻击。
无针接种后获得的保护作用高于用注射器和针头接种后获得的保护作用(见实施例2)，分别是大约75％的保护比65％，即使包含表达FeLV env和gag/pro基因的金丝雀痘载体的重组病毒疫苗的注射量对于首次施用低2倍且对于加强施用低6倍。
本发明现将通过以下标号的段落作进一步描述。
1.有效量的编码并表达至少一种FeLV免疫原的重组病毒载体和可接受的赋形剂或稀释剂的应用，用于制备液体重组病毒疫苗，该疫苗被设计成用喷液无针注射器施用于猫科动物，并引发安全的和保护性的对抗FeLV的免疫应答。
2.根据段落1的应用，其中所述疫苗包含选自由疱疹病毒、腺病毒、痘病毒组成的组的成员的病毒载体。
3.根据段落2的应用，使用所述病毒载体为金丝雀痘病毒或禽痘病毒。
4.根据段落2的应用，其中所述病毒载体为vCP97。
5.根据段落1的应用，其中所述疫苗包含大约104.5到大约107.0TCID50/剂(50％组织培养感染剂量/剂疫苗)。
6.根据段落1的应用，其中所述喷液无针注射器为VitajetTM装置。
7.疫苗接种试剂盒或套盒，包括喷液无针注射器和至少一个含有基于病毒载体的FeLV重组疫苗的疫苗小瓶，二者有效装配以实施将疫苗施用于猫科动物，并引发针对FeLV的安全的和保护性的免疫应答。
* * *已这样详细描述了本发明的优选实施方案，要理解的是，以上段落限定的发明并不限于以上说明书中所述的特定细节，其许多明显的变异是可能而不偏离本发明的精神或范围的。
权利要求
1.引发对抗FeLV的安全的和保护性的免疫应答的方法，包括将含有有效量的编码和表达至少一种FeLV免疫原的重组病毒载体和可接受的赋形剂或稀释剂的疫苗用喷液无针注射器给猫科动物施用。
2.权利要求
1的方法，其中所述病毒载体是疱疹病毒载体、腺病毒载体或痘病毒载体。
3.权利要求
2的方法，其中所述病毒载体是金丝雀痘病毒或禽痘病毒。
4.权利要求
2的方法，其中所述病毒载体是vCP97。
5.权利要求
2的方法，其中所述疫苗含约104.5-约107.0TCID50/剂(50％组织培养感染剂量/剂疫苗)。
6.权利要求
1的方法，其中所述喷液无针注射器是VitajetTM装置。
7.疫苗接种试剂盒或套盒，其包含喷液无针注射器和至少一个装有基于病毒载体的FeLV重组疫苗的疫苗小瓶，其有效地装配以实施将疫苗施用于猫科动物，并引发针对FeLV的安全的和保护性的免疫应答。
专利摘要
本发明提供了接种猫科动物以对抗猫白血病的新方法。基于病毒载体的FeLV重组疫苗借助于喷液无针注射器能使疫苗基本上分布于动物的真皮和皮下。
文档编号A61K39/00GK1997389SQ200580024190
公开日2007年7月11日 申请日期2005年6月6日
发明者T·采盖, M·C·帕多, A·T·利尔德 申请人:梅瑞尔有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan