病毒疫苗的制作方法

专利名称：病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒疫苗，特别是涉及以遗传工程手段改造的用作疫苗的突变病毒、含有突变病毒的疫苗、重组体细胞，以及生产疫苗的方法。
病毒疫苗一般分为两类。第一类是“被杀死的”疫苗，其为已经过适当化学物质如β-丙醇酸内酯处理后杀死的病毒制剂。第二类是活的“减毒”疫苗，其为经过对病毒基因组的特异性遗传操作，或更常见的是在某种类型组织培养系统中传代而降低了对宿主之致病性的病毒。这两种类型的疫苗均有其各自的缺点。因为被杀死的病毒疫苗不能在宿主内复制，所以必须注射给药，并因此而可能产生不适当的免疫反应。例如被杀死的脊髓灰质炎病毒制剂(即沙克疫苗)可产生免疫球蛋白(Ig)G抗体反应，但不能在原发感染的天然部位即肠内刺激IgA的产生。因此，虽然该疫苗能够保护机体免于发生脊髓灰质炎的神经系统并发症，但并不能阻断原发感染，且不能赋予“群体免疫力”。另外，杀死的病毒即不能进入宿主细胞内，也不能在其中复制。因此不能产生针对复制期间所产生的非结构蛋白质的任何有益免疫学反应，它们也不能刺激针对病毒抗原之胞毒性T细胞的产生。“死”抗原不能被抗原呈现细胞检拾并提供给T细胞。然而，可由Ⅱ类MHC分子呈现并导致对T辅助细胞的刺激作用。T辅助细胞又可帮助B细胞产生针对抗原的特异性抗体。为了刺激细胞毒性T细胞的产生，必须通过被感染细胞内的特殊途径加工病毒抗原，并作为被中断的肽片段出现在Ⅰ类MHC分子上。一般认为该降解途径对于那些在被感染细胞内合成的蛋白质是最为有效的，所以只有进入宿主细胞内并表达免疫原性病毒蛋白质的病毒才能产生病毒特异性胞毒性T细胞。因此，死疫苗是诱导抗病毒感染之细胞免疫力的不良诱导剂。从这一观点看，活的病毒疫苗更为可取。
迄今，已通过删除非必要基因或部分地损伤一个或多个必要的基因(在此情况下，损伤是使基因仍保留功能活性，但不能很有效地发挥作用)制成了活性的减毒病毒。但活减毒病毒常常带有残留的致病性，而对宿主造成有害影响。另外，除非经特异性删除造成减毒，否则有可能逆转为更强毒力形式的病毒。但有一个事实是，在宿主中可产生某些病毒蛋白质，这意味着它们比那些不能产生病毒蛋白质的死疫苗更为有效。
活减毒病毒不仅其本身可用作疫苗，而且可作为其它基因的“疫苗载体”，换句话说即可携带来自须对抗之第二种病毒(或其他病原体)的基因。一般情况下。可使用痘病毒科的成员如牛痘病毒作为疫苗载体。当使用病毒作为疫苗载体时，重要的是它不能引起致病作用。换句话说，须以可使单纯病毒疫苗减毒的同样方法对其进行减毒。因此，在这种情况下应用时也会存在如上面所述的同样缺点。
已经发现，有可能从病毒基因组中删除某个基因，并提供一个所谓的“互补”细胞，进而由该细胞提供带有被删除基因之产物的病毒。这一方法已在某些病毒如腺病毒、疱疹病毒和反转录病毒中得以实现。对于腺病毒，是用5型腺病毒DNA的片段转化人细胞系(Graham，Smiley，Russell&Nairn，J.Gen，Virol，36，59-72，1977)。该细胞系表达某些病毒基因，并发现它能支持具有其已被删除或失活之基因的病毒突变体的生长(Harrison，Graham&Williams，Virology77，319-329，1977)。虽然病毒能在该细胞系(“互补细胞系”)上很好地生长并产生了标准的病毒颗粒，但完全不能在正常人细胞上生长。已显示表达SV40病毒基因组(乳多空病毒)之T抗原编码区的细胞能够支持被特异性删除的病毒在该区域的复制(Gluzman，Cell，23，182-195，1981)。对于单纯性疱疹病毒，已产生了表达gB糖蛋白(Caietal.J.Virol.62，714-721，1987)，gD糖蛋白(LigasangJohnson，J，Virol.62，1486，1988)和直接早期蛋白质ICP4(Delucaetal.J.Virol，56，558，1985)的细胞系，而且已表明这些细胞系能够支持带有相应基因特异性失活拷贝之病毒的复制。
本发明提供了用作疫苗的突变病毒，其中编码产生感染性病毒所必须之蛋白质的病毒基因已被删除或失活;且其中所说的病毒能在具有异源核苷酸序列的细胞中生长，所说的核苷酸序列可使所说的细胞表达由所说的被删除或失活之病毒基因编码的必要蛋白质。
本发明还提供了包含上述病毒，连同一种或多种赋形剂和/或佐剂的疫苗。病毒基因组本身可提供免疫原，或可含有表达该免疫原蛋白质的异源基因插入段。
本发明还提供了用如上所述的，用于制备疫苗的减毒病毒转染的互补细胞。
本发明还提供了使用上述病毒制备用于治疗或预防疾病之疫苗的方法。
本发明还提供了生产疫苗的方法，该方法包括培养用带有被删除或失活之病毒基因的病毒感染的细胞，其中所说病毒基因编码一种对于感染性病毒的产生不可缺少的蛋白质，且其中宿主细胞具有包括所说之病毒基因的异源核苷酸序列并能表达由所说之基因编码的必要蛋白质，然后收获如此产生的病毒，并将其用于疫苗中。
病毒可衍生于单纯性疱疹病毒(HSV)，其中例如编码糖蛋白H(gH)的基因已被失活或删除。突变病毒也可包含编码衍生于病原体之免疫原的异源序列，宿主细胞可以是含有编码HSV糖蛋白H之基因的重组真核细胞系。作为另一个例子，病毒可以是衍生于某真痘病毒如牛痘病毒，其也可包括编码衍生于病原体之免疫原的异源序列。
本发明显示了一种将死疫苗和由减毒疫苗在体内产生的病毒蛋白质所诱导之额外免疫反应的有效性及安全性相结合的独特方式。在优选的实施方案中，它包括两个特征。首先，通常是经过产生特异性缺失而在病毒基因组内使选择的基因失活。此基因将参与感染性病毒的产生，但最好不阻碍病毒基因组的复制。因此被感染细胞能由复制的遗传材料产生多种病毒蛋白质，而且在某些情况下可产生新的病毒颗粒，但这些病毒都是没有感染性的，这就意味着病毒感染不能从接种部位蔓延开来。
本发明的第二个特征涉及为病毒提供被删除基因之表达产物的细胞，从而使之能够在组织培养物中生长病毒。因此，虽然病毒缺少编码某必要蛋白质的基因，但如果它生长于适当的宿主细胞中，即可增殖并产生与原病毒看不出有什么区别的完整病毒颗粒。该突变病毒制品从其带有缺陷的基因组并且不能在正常宿主内产生感染性病毒的意义上看，它是无活性的，故可按足以在宿主体内直接产生体液免疫反应的量安全使用之。因此，突变病毒不一定是对被保护之宿主的细胞有感染性，而且只须按常规使用死疫苗或活减毒疫苗完全相同的方式使用即可发挥作用。但从免疫病毒能与细胞结合，进入细胞内，并发动病毒复制周期，从而能在被保护之宿主细胞内引起感染并在其中产生某些病毒抗原的意义上说，免疫病毒本身较好是仍然有感染性的。这样使得有另一个刺激宿主免疫系统之细胞免疫的机会。
缺失或失活的基因较好是尽可能晚地参与病毒生活周期的基因，这样便可在体内提供尽可能多的病毒蛋白质以产生免疫性反应。例如，基因可以是参与包装或某些其它复制后过程的基因，如HSV的gH糖蛋白。但选择的基因可以是参与病毒基因组复制的基因，并且在体内表达之蛋白质的范围将取决于正常情况下基因得以表达的阶段。对于人细胞肥大病毒(HCMV)，选择的基因可以是有效地阻止病毒基因组在体内复制的基因(除直接早期基因外)，因为在病毒基因组复制前产生的(而且确实对它是重要的)直接早期基因是高度免疫原性的。
本发明可应用于任何病毒，其中一个或多个必要基因能被鉴定并可从病毒基因组中删除或在病毒基因组中被失活。对于腺病毒、疱疹病毒、乳多空病毒、乳头状瘤病毒和细小病毒等DNA病毒，可通过(1)体外操作被选择之必要基因的已克隆DNA拷贝以产生特异性DNA改变，以及(2)通过常规重组和标志保留方法将已改变的变体重新引入病毒基因组中而直接实现上述目的。但本发明也可应用于RNA病毒。可用现有的标准基因工程技术在体外操作RNA病毒基因组的互补DNA拷贝，然后再于体外将其转录成RNA。可将所得到的RNA重新导入病毒基因组中。该技术已被用于在正链和负链RNA病毒如脊髓灰质炎病毒(RacanielloandBaltimore，Science，214，916-919，1981)和流感病毒(Lutyesetal，Cell，59，1107-1113，1989)的基因组中产生特异性改变。
在理论上，任何编码必要蛋白质的基因均应是按该方法产生减毒病毒的潜在靶基因。但在实践中，对基因的选择将决定于多方面的考虑。
1.基因较好是感染的后期所需要的。从而不会在早期中断减毒病毒的复制过程，这就意味着大部分甚至可能所有其他病毒抗原都将在被感染细胞中产生，并以与宿主细胞I类MHC分子结合的方式贡献于宿主免疫系统。如此呈现便导致通过胞毒性T细胞来发展抗病毒感染的细胞免疫。胞毒性T细胞可识别这些抗原，从而杀死感染细胞的病毒。缺失的基因可能代表了完全不是病毒组装所需的基因，但它对于组装好的病毒能够感染细胞来说是不可缺少的。HSVgH蛋白质即是这种蛋白质的一个例子。在没有这种蛋白质的情况下，仍可产生HSV病毒粒子，但它们是非感染性的。
2.选择之基因的表达产物本身对真核细胞确实是没有毒性的，这样便可以相对地容易地产生互补细胞。然而，由于基因在互补细胞内可能处于可诱导性启动子的控制下，这样其表达就只能在需要时才启动，所以上述条件不是绝对必要的。
靶基因产生之突变的性质也是一个选择因素。只要使逆转为野生型结构的危险减到最小，任何产生非功能性基因产生的改变都是令人满意的。这些改变包括打断带无关序列的靶基因并造成特异性缺失。但为将疫苗用作治疗和/或预防剂，最令人满意的战略是删除应包括将被导入互补细胞内的整个序列。可通过在互补细胞内病毒和细胞DNA间的重组使再生野生型病毒的危险减小到最低程度。
迄今为止，虽然已有几个将特异性失活的病毒与互补细胞相结合的例子(见上文所述)，但这些都是用于病毒的基础研究，或者是借以制备用于产生转基因动物的较安全的载体(使用反转录病毒)。迄今还没有用于制作疫苗之目的，而且就本申请人所知，也没有人提出这样的使用方法。
除使用这种失活病毒/互补细胞组合以生产抗野生型病毒的安全疫苗外，本发明还涉及使用同一系统生产用作抗外来病原体之疫苗的安全的病毒载体。
这种载体的一个例子是基于HSV制得的。HSV基因组之大足以容纳大量有价值的附加遗传信息，且已描述了几种携带并表达外来遗传材料的重组HSV病毒(如LigasandJohnson，J.Virol，1988，文献同上)。因此可使用上述被删除的必要病毒基因，并携带和表达特定外来基因的病毒作为进行疫苗接种的安全载体，用以产生抗外来蛋白质的免疫反应。
HSV的一个重要特征是它可进而潜伏于被感染个体的神经元中，并有时会再活化而导致局部损伤。为此可使用缺失某个必要病毒基因并表达外来基因的HSV，以在被处理的个体中有意造成神经细胞的潜在感染。重新激活这样一种潜在感染不会导致损害的产生，因为此时的病毒载体不能再充分复制，而可导致最初部分病毒复制周期的发动。在此期间可发生外来基因的表达，而引发免疫反应。如果编码某蛋白质的已缺失的HSV基因对于病毒组装不是必需的，而只与组装好的病毒粒子的感染性有关，便可将这样的外来抗原掺入组装的病毒颗粒中，以提高其免疫原性效应。当然，这种外来基因的表达和其蛋白质在病毒颗粒中的掺入也可发生在突变病毒在其互补宿主内最初产生的阶段，在此情况下，即当将突变病毒用作疫苗时，即可直接将外来蛋白质提供给被处理的个体。
在另一个例子中，牛痘病毒(一种痘病毒)可携带并表达来自各种不同病原体的基因，并已证明当用于动物实验系统时它们可成为有效的疫苗。用于人体的潜力是很大的，但由于与广泛使用牛痘病毒作为抗天花疫苗有关的已知副作用，所以一般不太同意在人身上大规模使用未修饰的牛痘疫苗。已经尝试了通过删除非必要基因如牛痘生长因子基因来使牛痘病毒减毒(Buller，Chakrabarti，Cooper，Twardzik&Moss，J.Virology62，866-874，1988)。但如此减毒的病毒仍可在体内复制，尽管其复制水平很低。也产生了缺失必要基因的非牛痘病毒，但这种缺失了上述必要基因的病毒，当与其互补细胞结合而生长时，可提供该病毒载体的较安全变体。
这种抗异源蛋白质免疫的一般性战略的另一个优点是，可用同一病毒载体以一种常规活病毒载体不可能达到的方式进行多次有效的疫苗接种。因为就其效力来说，一种标准的活病毒疫苗可能依赖于它通过许多次感染而形成的在宿主动物体内复制的能力，所以它在具有抗该病毒之免疫力的个体中的使用便将受到严重限制。用同种病毒作第二次攻击，无论是提供抗同一蛋白质的加强免疫，还是产生抗不同蛋白质的新的免疫反应，可能都是无效的。如使用缺失了某必要基因的病毒载体(并不期望或要求它进行多次复制)，也在免疫接种后很快就出现有效的免疫作用。突变病毒的剂量可以相当大(因为它应是完全安全的)，因此不大可能通过宿主免疫反应来阻断这些尚需一定时间才能充分动员的早期过程。
虽然我们在上面已得到突变病毒的必要基因是有缺陷的，并且可含有免疫原性病原体蛋白质的基因，但突变体也可缺少一个以上的必要基因，和/或含有多个免疫原性病原体蛋白质基因。因此，突变病毒可包括以上面提到的方式用作疫苗的HIVgp120基因，以及HIVgag蛋白质基因，它们可在接种疫苗的宿主内得以表达并以与MHC-I结合的方式呈现于宿主细胞表面上，从而刺激宿主的T细胞反应。
为了更清楚地了解本发明，下面将借助实施例并参考下列附图以非限制方式进一步描述本发明。


图1说明质粒pGH1的生产程序;
图2说明质粒pGH2的生产程序;
图3a显示用于产生质粒pSP64Ta之互补寡核苷酸的碱基对;
图3b说明质粒pSP64Ta的产生;
图4a显示用于产生质粒pCMVIEP的两个寡核苷酸序列;
图4b图解显示质粒pCMVIEP;
图5图解显示质粒pCMVlacZ;
图6图解显示质粒pGH3;
图7图解显示构建质粒pGH-120的战略。
缺失了糖蛋白H的单纯性疮疹病毒(gH-HSV)单纯性疱疹病毒(HSV)是一种大的DNA病毒，它可以在人体内引起多种病症，包括反复发作的面部和外阴部损伤，以及虽然罕见但常常是致命的脑炎。使用药物Acyclovir以化学治疗法可在一定程度上控制该病毒引起的感染，但还没有可用来预防原发感染的疫苗。抗HSV疫苗接种的困难是病毒在体内一般是通过直接在细胞间转移来传播的。在这种情况下，由于循环抗体只能中和细胞外病毒，所以体液免疫难以奏效。为控制病毒感染，最重要的还是细胞免疫，为此一种能产生体液免疫和细胞免疫力，而且又对机体安全的疫苗将是相当可取的。
在SHV基因组内进行失活的适当靶基因是糖蛋白H基因(gH)。gH蛋白质是一种存在于病毒外壳表面上的糖蛋白。一般认为该蛋白质在病毒进入被感染细胞期间参与了膜融合过程。这是因为在非允许温度下，那些该基因受到了损伤的温度敏感性病毒突变体将不能从病毒感染的细胞中分泌出来(Desaietal.J.Gen.Virol，69，1147-1156，1988)。该蛋白质是在感染的后期表达的，所以当其不存在时仍有大量的病毒蛋白质合成。
所有基因操作均按“MolecularCloning”，ALaboratoryManual，eds，Sambrook，FritschandManiatis，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989中所述的标准方法进行。
A.表达HSVgH基因之细胞系的产生gH基因存在于I型HSV基因组的唯一长区域(UnigueLongregion，UL)中，即核苷酸46382和43868之间(McGeochetal.，J.Gen.Virol.69，1531-1574，1988)。可在质粒pAF2中得到该基因之克隆的拷贝。该质粒是经切割得自质粒pTZgH的、包含完整pH编码序列的BglⅡ-XhoⅠ片段，并将此片段克隆到上述质粒pSP64T的BglⅡ位点中而产生的(GompelsandMinson，J.Virol，63，4744-4755，1989)。然后由质粒pSVD4(Everett，Nucl，AcidsRes.11，6647-6667，1983)中切掉包含糖蛋白D(gD)基因之启动子序列的HindⅢ片段(以gD基因的起始位置为准，从核苷酸-392延伸到+11)，并克隆到pAF2的唯一HindⅢ优点以产生pGH1(图1)，这样即可利用以正确方向连接的启动子序列驱动gH基因的表达。因此该质粒即含有处于1型HSVgD基因启动子控制下的完整的gH编码序列。然后纯化该质粒，并使用常规磷酸钙共沉淀技术(GrahamandVanderEb，Virology52，456-467，1973)与质粒pNEO(PharmaciaLKB，BiotechnologyInc.)一起共转染到Vero细胞中。然后使细胞在药物G418中传代来选择已获得了新霉素抗性的Vero细胞，并用有限稀释法克隆这些细胞的集落。在组织培养物中扩增这些新霉素抗性细胞，然后用2型HSV病毒感染所得样品。用2型HSV病毒感染具有诱导从存在于互补细胞基因组中之1型gD启动子开始的转录，从而刺激互补细胞中1型gH蛋白质的产生的作用。使用已知如特异地识别I型gH蛋白质的多克隆抗血清(Desai et al，1988，文献同上)，以Western印迹转移法，根据gH蛋白质的表达来筛选被感染细胞的溶胞产物。然后保留表达所需蛋白质的细胞并制备其冷冻贮存品。该材料代表了gH+互补细胞系。
B.产生带有已中断之gH基因的HSVI型病毒从质粒pUG102(GompelsandMinson，Virology153，230-247，1986)上切掉含有gH编码序列连同HSV侧翼序列的6432碱基对BglⅡ片段，并克隆到质粒pAT153(TwiggandSherrat，Nature，283，216，1980)中以产生pGH2(图2)。用只在gH编码序列内的两个位置(相当于Mcgeoch等人(1988，文献同上)之序列编号的核苷酸44955和46065)上切割该序列的PvuⅡ消化上述质粒，并从两片段中纯化较大的一个。然后按下述方法制备含有位于细胞肥大病毒(CMV)直接早期基因启动子下游，来自大肠杆菌之完整β半乳糖苷酶基因的DNA片段。首先将所有成对的互补寡核苷酸(如图3a所示)退火并与Bg1Ⅱ消化的、磷酸酶处理的pSP64T(KriegandMelton，Nucl.AcidsRes.12，7057-7071，1984)连接，产生如图3b中所示的质粒pSP64Ta。所加接头还包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的起始密码子和前三个密码子。然后使用图4a中所示的两个寡核苷酶，以聚合酶链反应技术(PCR-MolecularCloning，ed.Sambrooketal.，文献同上)由质粒pUG-H1(GompelsandMinson，1989，引文同上)扩增CMV直接早期基因启动子的“核心区”，其中所说的两个寡核苷酶分别相当于序列中核苷酶-302至-288和-13至-36[核苷酶序号与Akrigg等人(VirusResearch，2，107-121，1985)所述的CMV直接早期基因的起始点相关]。这些寡核苷酸还在其5′端含有限制性酶HindⅢ的酶切点，在寡核苷酸退火到启动子上游的情况下，还含有另一个SmaⅠ位点。然后用HindⅢ消化PCR扩增的产物DNA，并克隆到HindⅢ消化的pSP64Ta中，以产生质粒pCMVIEP(图4b)。最后，用BamHI消化质粒pSC8(Chakrabartietal.，Mol.Cell.Biol.5，3403-3409，1985)，分离含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因之完整拷贝、而只缺少编码序列之5′最末端的DNA片段，并克隆到pCMVIEP的唯一Bg1Ⅱ位点中以产生pCMVIlacZ(图5)。然后再用SmaI消化pCMVlacZ以分离含有处于CMVIE启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因的DNA片段，并与纯化的上述pGH2的PvuⅡ片段连接，以产生pGH3，该质粒包括了被功能性β-半乳糖苷酶基因隔断的gH基因的拷贝(图6)。下一步是用该中断的变体置换HSV基因组中的野生型gH基因，其方法是使HSVDNA和质粒pGH3之间发生重组，然后选择那些已获得了功能性β-半乳糖苷酶基因的病毒。因此可用标准的磷酸钙沉淀技术(Graham and Van der Eb，1973，引文同上)将质粒pGH3 DNA连同从纯化的HSV病毒粒子中分离的纯化的HSV DNA(Killington and Powell，“Techniques in VirologyA Practical Approach”(ed，B.W.J.Mahy)pp.207-236，IRL Press，Oxford(1985))一起共转染到表达gH基因的细胞(A部分中所述的gH+互补细胞系)中。然后在显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)(该底物在β-半乳糖苷酶作用下变成蓝色物质)存在下，使用琼脂覆盖层，按标准的噬斑检验法将由此转染实验得到的子代HSV病毒铺敷在gH+互补细胞单层上，由含有并表达β-半乳糖苷酶基因的病毒基因组感染后得到的噬斑即显现蓝色。因此这些病毒基因组应携带有被中断之gH基因的变体，从平皿的适当部分中挑取琼脂栓，以从这些噬斑中回收病毒，通过在gH+互补细胞系中培养病毒来制备病毒贮备样品。因为这些病毒携带gH基因的非功能性变体，所以它们应能在不含有并表达gH基因之内源功能性拷贝的细胞上形成噬斑，这样即可根据检测病毒样品在野生型Vero细胞单层上形成噬斑的能力并与gH互补细胞相比较来进一步证实之。最后，从这些贮备病毒中制取病毒DNA，并用Southern印迹检测法检查gH基因周围的预期之DNA结构。在进一步证实了正确的遗传结构后，将病毒样品接种到gH+互补细胞系的大批量培养物(感染复数＝0.01)中，3天后收获感染的细胞，以从中大量制备gH基因缺陷性病毒。用超声波破碎被感染的细胞以释放出细胞相关病毒，将超声处理的总混合物储存于-70℃下作为病毒总贮备品。在gH+互补细胞系上进行噬斑检测，以确定病毒贮备品的滴度。然后用该病毒贮备物的样品按前述方法制备工作原液，再按下述方法用这些工作原液感染实验室动物。
C.对gH-HSV和加热杀死的病毒之保护作用的比较研究为了估计宿主对该病毒的免疫学反应，按照下述实验方案对小鼠进行攻击实验。
按下述方法比较活gH+病毒制剂和失活之野生物(WT)病毒(SC16病毒株)制剂的保护效应。
用于疫苗接种之失活野生型病毒的制备用低感染复数(0.01pfu/细胞)的Vero细胞培养1型HSV(SC16病毒株)。3天后收获病毒，并用Dounce匀浆法回收胞浆内病毒。以500×g离心15分钟除去细胞核，并使用BeckmanSW27转子，在40%蔗糖缓冲物(12K)上离心60分钟，以从上清液中回收病毒。稀释堆积成带的病毒，经蔗糖梯度离心(Killington and Powell，1985，引文同上)沉淀并纯化。从梯度中收获病毒带，并离心回收病毒。将病毒重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在幼小仓鼠(BHK)细胞上以噬斑滴定检测传染力，并用电子显微镜进行颗粒计数。制剂的颗粒传染力比例为110颗粒/pfu。在PBS中将病毒稀释到2.5×1010pfu/ml，于20℃用β-丙内酯处理60分钟使病毒失活。然后分成若干等份置-70℃下保存。
用于疫苗接种之活gH-病毒的制备基本上按上述制备野生型病毒的方法制备，不同的是病毒生长在含有并表达1型HSVgH基因的gH+互补细胞系中，并且不经β-丙内酯处理灭活。该制剂的颗粒传染力比例为150∶1。将其浓度调到2.5×1010gfu/ml，分成若干等份加在PBS中于-70℃下保存。
疫苗接种程序通过微滴施用并在动物右耳上划痕，用加于2ul磷酸盐缓冲盐水中的各种不同剂量的失活WT病毒或活gH-病毒接种下列各组4周龄雌性balb/c小鼠(购自Tucks U.K.Ltd)A组对照-无病毒B组 5×104pfu病毒疫苗C组 5×105pfu病毒疫苗D组 5×106pfu病毒疫苗E组 5×107pfu病毒疫苗14天后，用2×106pfuHSV-1病毒株SC16(野生型病毒)在左耳上作相似接种以攻击所有小鼠。5天后杀死小鼠并检验在左耳和右颈神经节CⅡ、CⅢ、和CⅣ(结合的)中的病毒传染力。为进行潜伏期研究，于1个月后杀死其他接种疫苗的和受攻击的动物，并切除CⅡ、CⅢ和CⅣ神经节进行潜伏感染检验。将标本置于培养基中保温5天，制成匀浆并用标准的噬斑检验法检查传染性病毒的存在。下列结果均以pfu/器官数表示。
表1接种活gH-病毒后在感染的急性期内所存在之攻击病毒的滴度
＊合并的颈神经节cⅡ、cⅢ和cⅣ
表2接种灭活的WTHSV-1后在感染的急性期内存在之攻击病毒的滴度
＊合并的颈神经节cⅡ、cⅢ和cⅣ
表3接种活gH-HSV-1后作为存在于颈神经节中之潜伏病毒的攻击病毒滴度
＊合并的颈神经节cⅡ、cⅢ和cⅣ
表4接种灭活的WTHSV-1后颈神经节中潜伏攻击病毒的滴度
＊合并的颈神经节cⅡ、cⅢ和cⅣ
(p.f.u＝噬斑形成单位;gH-是有gH基因缺陷的病毒)。
这些结果显示了急性感染期内耳部和颈神经节中存在的攻击病毒wtSC16的滴度。因此其中低滴度表明用gH-病毒接种的效果好，而高滴度表明效果差。从这些结果中可明显看出，用活gH+HSV病毒进行疫苗接种要比用等量灭活WT病毒的效果好得多。为防止攻击病毒在耳部复制，所需要的灭活病毒制剂的剂量为5×107pfu，而所需活gH-病毒的剂量要少100-1000倍。用5×105pfu或更多的活gH-病毒作疫苗接种，也能阻断急性感染期攻击病毒在颈神经节中的复制，同时还显示对颈神经节中潜伏感染的形成有明显的保护作用。
缺少gH基因的HSV作为抗外来抗原免疫的载体将SIVmac142病毒株的gp120基因导入gH-HSV病毒的基因组中可用上述缺失必要基因的病毒作为将外来抗原传递给免疫系统的安全载体，且上述的gH-HSV病毒即是一个这样的适用载体。可用该病毒表达任何所需外来抗原，但特别引人关注的还是表达人类免疫缺陷病毒(HIV)即爱滋病病毒的主要抗原性蛋白质。为此可以一种在重组病毒感染正常细胞(即非互补细胞)期间确保其表达的方式将这些序列插入gH-HSV病毒基因组中。用这样的病毒感染个体，可在其重新活化后逐步造成潜伏感染，导致突然产生外来抗原，进而刺激针对该蛋白质的免疫反应。
因为目前还不能直接在人体内对此方法进行实验研究，所以作为初始阶段的工作，可使用猴爱滋病病毒SIVmac(从猕猴体内分离的猴免疫缺陷病毒)在猴体内进行试验。为此目的所使用的适当SIV基因是编码作为该病毒主要抗原性靶蛋白质之一的gp120蛋白质的基因。因此将该基因导入gH-HSV基因组中，并估测以该病毒作为疫苗保护猴对抗SIV攻击的效力。
首先将SIVgp120基因克隆到细胞肥大病毒IE核心启动子(Gompels and Minson，1989，文献同上)的后面，然后再将含有gp120基因和上游CMV启动子的DNA暗盒克隆到质粒pGH2中(图2)。将所得质粒与从gH-HSV中纯化的DNA一起共转染到gH+互补细胞系中，经筛选破坏了β-半乳糖苷酶基因的克隆分离重组病毒，该重组病毒已获得了gp120基因，并以其取代了存在于gH-HSV病毒中的β-半乳糖苷酶基因。
A.构建将SIVgp120编码序列重组到HSV基因组中的质粒整个程序如图7中所示，从已克隆SIV基因组的DNA拷贝(Chakrabartietal.Nature328，543(1987)))切掉ScaI限制性酶切片段(相当于碱基5240-8721)并克隆到质粒pUC118(VieraandMessing，MethodsinEnzymology，153，3，1987)的SacI位点中，以产生质粒pSIV1，然后用定点诱变法将其转变成便于操作的单股DNA。使用合成的寡核苷酸5′GAAGAAGGCTATAGCTAATACAT
经定点诱变(Brierleyetal，Cell57，537，1989)改变包含SIVenv基因(位于6090-8298间)的该DNA区域，以在位置6053-6058处引入EcoRV酶的限制性酶切位点。
然后使用合成的寡核苷酸5'CAAGAAATAAACTATAGGTCTTTGTGC在相当于env基因序列gp120和gp40区域间之裂解位点的SIVenv基因内的位置7671-7676处导入第二个EcoRV位点，产生质粒pSIV2。再用EcoRV消化SIV2，制得相当于SIVenv基因之gp120部分的DNA片段(1617碱基对)。
使用下列两个合成的寡核苷酸，以PCR技术由质粒pUG-H1(GompelsandMinson，1989，文献同上)制得GMV直接早期基因启动子的核心区。
上游引物5' ATC GAATTC CTATAG CCTGGCATTATGCCCAGTACATGEcoRI EcoRV下游引物5'TCAAAGCTT CTATAG CCCGGGGAGCTCTGATTATATAGACCTCCCHindIII EcoRV SmaI
然后用EcoRⅠ和HindⅢ酶切割该反应的产物，产生一DNA片段，再将其克隆到用EcoRⅠ和HindⅢ消化的质粒pUC118中，得到质粒pCMVIE2，该质粒在CMV启动子序列的下游处有一个唯一的SmaI位点。按上述方法制备含有SIVmacgp120编码序列的EcoRV片段。然后将其克隆到该SmaI位点中，并选择具有以正确方向插入的SIV编码区，从而得以从启动子开始表达该编码序列的质粒pSIV3。然后用EcoRV消化该质粒以产生包含SIV序列和CMV启动子的平头DNA片段，将该片段克隆到PuvⅡ消化的pGH2中(图2)，得到pGH-120。
B.构建携带重组gH-HSV和SIVgp120由按上面所述方法构建的gH-HSV病毒中纯化DNA，并与纯化的pGH-120DNA一起共转染到gH+互补细胞中。然后在X-gal存在下，使用琼脂覆盖层按前述的标准噬斑检验法将分离自该转染混合物的子代病毒铺敷在gH+互补细胞的单层上。由于亲代gH-病毒携带了位于残留之gH编码序列内的功能性β-半乳糖苷酶基因，所以当存在X-gal时将形成蓝色的噬斑。然而，由于重组病毒已获得了SIVgp120编码序列并以其取代了β-半乳糖苷酶基因，故将产生白色噬斑。经挑取琼脂栓，从这些白色噬斑回收病毒，并通过在gH+互补细胞系中繁殖这些病毒来制备病毒贮备品。从这些贮备品中制取病毒DNA，并使用衍生于SIV编码序列的适当探针，以Southern印迹法检查gH基因周围之正确DNA结构的存在。最后按前述方法制备用于在动物体内进行疫苗接种的病毒原液。
可按本领域中已知的标准技术制备并使用含有减毒病毒的疫苗。例如，疫苗也可含有一种或多种赋形剂和/或佐剂，可按本领域中已知的技术确定由疫苗提供的减毒病毒的有效剂量。
权利要求
1.突变病毒，就产生传染性病毒所必需的基因来说其基因组是有缺陷的，而且其能够保护以其免疫的敏感物种免受相应野生型病毒的感染。
2.根据权利要求1的突变病毒，其对于以其免疫之敏感物种的细胞是有传染性的。
3.突变病毒，就产生传染性病毒所必需的基因来说其基因组是有缺陷的，而且其基因组包括来源于该病毒以外之外源病原体的免疫原性蛋白质的遗传材料。
4.根据权利要求3的突变病毒，其对于敏感物种的细胞是有感染性的，从而在被此突变病毒感染的所说的物种之细胞中表达了外源免疫原性蛋白质。
5.根据权利要求3或4的突变病毒，其中免疫原性蛋白质在正常情况下对所说的病原体敏感的感染物种内，赋予了对抗所说病原体的免疫力。
6.根据权利要求5的突变病毒，其中病毒能够随着定期再活化而在被感染物种中产生潜伏性感染。
7.根据权利要求3至6中任一项的突变病毒，其中外源蛋白质来源于免疫缺陷病毒。
8.根据权利要求7的突变病毒，其中外源蛋白质是免疫缺陷病毒蛋白。
9.根据前述权利要求中任一项的突变病毒，其衍生于单纯性疱疹病毒(HSV)。
10.根据权利要求9的突变病毒，其中所说的缺陷基因是HSV糖蛋白gH基因。
11.根据前述权利要求中之任一项的突变病毒在制备疫苗中的应用。
12.包含根据权利要求1至10中任一项之突变病毒的疫苗。
13.制备根据权利要求1-10中任一项之突变病毒的方法，该方法包括在重组宿主细胞中表达就所说基因来说为有缺陷的病毒基因组，宿主细胞也表达补充该病毒基因的基因，从而得以产生所说的突变病毒。
全文摘要
一种用作疫苗的突变病毒，其中病毒的基因组就产生传染性病毒的必要基因来说是有缺陷的。一方面该突变病毒能保护由其免疫的敏感物种免于遭受相应野生型病毒的感染；另一方面，该突变病毒可用作免疫原性蛋白质的载体，该免疫原性蛋白质衍生于病原体并且是由掺入突变病毒中的外来DNA编码的。可在表达某补偿缺陷之基因的重组宿主细胞中产生突变病毒。突变病毒较好是对被保护的宿主有感染性的，但缺陷基因允许在被感染的宿主中至少表达某些病毒基因，借以引发细胞介导的免疫反应。
文档编号A61K39/245GK1076728SQ9210203
公开日1993年9月29日 申请日期1992年3月24日 优先权日1992年3月24日
发明者S·C·英格理斯, M·E·G·布尔斯尼尔, A·C·闵森 申请人:免疫有限公司