专利名称：巨噬细胞炎性蛋白-3，-4和-1r的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴别的多核苷酸，这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途、以及这些多核苷酸和多肽的生产。更具体地说，本发明的多肽是人巨噬细胞炎性蛋白-3(MIP-3)、巨噬细胞炎性蛋白-4(MIP-4)和巨噬细胞炎性蛋白-1γ。本发明还涉及抑制这些多肽的活性。
巨噬细胞炎性蛋白(MIP)是由某些哺乳动物细胞如巨噬细胞和淋巴细胞，对刺激物如革兰氏阴性菌、脂多糖和伴刀豆球蛋白A反应生成的蛋白质。因此，MIP分子具有检测和治疗感染、癌症、发炎、骨髓组织生成异常、和自身免疫疾病的诊断和治疗用途。鼠MIP-1是一种来自脂多糖刺激的RAW264.7(一种鼠巨噬细胞肿瘤细胞系)的主要分泌蛋白。该蛋白质已被纯化，并发现它是由两种蛋白质组成的，MIP-1α和MIP-1β。
几个研究组已经克隆了似为MIP-1α和MIP-1β类似物的东西。在所有情况下，都是从活化的T细胞RNA制备的基因文库中分离出cDNA。
巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α和MIP-1β)已显示出促炎的性质。MIP-1α可诱导人嗜酸性细胞和单核细胞的移行和活化并诱导巨噬细胞的趋化性。另外，鼠MIP-1α对人造血干细胞增殖有抑制作用，而鼠MIP-1β可消除MIP-1α的抑制作用。最后，MIP-1蛋白可在早期创伤炎性细胞中检测出来，并已显示出诱导创伤成纤细胞产生IL-1和IL-6的作用。
MIP-1是具有与炎症或创口愈合、免疫调节有关的多种功能的趋化因子系统的一部分，并在许多疾病状态中起积极作用。另外，已发现MIP-1具有加强造血功能的作用。Broxmeyer，H.E.等，J.Exp.Med.，1701583-94(1989)和Broxmeyer，H.E.等，Blood，761110-6(1990)。
已广泛研究了MIP-1的生物活性的定义，并使用了天然MIP-1和最新的重组MIP-1α和MIP-1β。当皮下注射到小鼠足垫或脑池内注射到兔脑脊髓液时，纯化的天然MIP-1(包括MIP-1、MIP-1α和MIP-1β多肽)引起了急性炎症(Wolpe和Cerami，1989，FASEB J.32565-73)。除了MIP-1的这些直接或间接的促炎症性质外，在使用无菌创伤腔的实验室小鼠模型中，在伤口愈合的炎性早期发现了MIP-1(Fahey等人，1990，Cytokine，292)。例如由Chiron公司递交的PCT申请U.S.91/06489公开了一种DNA分子，它作为在酵母中生产哺乳动物巨噬细胞炎性蛋白(MIP)的模板。
鼠MIP-1α和MIP-1β是不同但又紧密相关的细胞因子。这两种蛋白的部分纯化的混合物可影响中性白细胞的功能并引起局部炎症和发热。已鉴别出MIP-1α的特定性质与造血干细胞生长抑制剂是一致的。MIP-1α已在酵母细胞中得以表达并纯化为纯品。结构分析证实了MIP-1α具有与血小板因子4和白细胞介素8极为近似的二级和三级结构，而MIP-1α与血小板因子4和白细胞介素8有有限的序列同源性。已发现MIP-1α具有体外干细胞抑制性质。另外还表明了MIP-1α在体内具有保护鼠干细胞免受随后氚标记的胸腺嘧啶核苷体外杀伤的活性。MIP-1α在对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的应答中还显示了促进更多的定型祖细胞粒细胞巨噬细胞集落形成细胞的增殖的作用。Clemens，J.M.等人，Cy-tokine，476-82(1992)。
MIP-1α是一种6-8千道尔顿的可由脂多糖诱导的单核细胞、中性白细胞和嗜酸细胞的趋化性蛋白质。MIP-1α还可诱导人嗜酸性粒细胞的移行和活化。在急性或慢性炎症中MIP-1α可能是重要的。已经测定了在肺肉芽肿形成过程中鼠MIP-1α在同步曼森氏裂体吸虫中的连续产生、来源及体内作用。Lukacs，N.W.等人，J.Exp.Med.，1771551-9(1993)。
本发明一方面提供了新的成熟的多肽，它们是MIP-3、MIP-4和MIP-1γ，以及它们的类似物和衍生物。本发明的MIP-3、MIP-4和MIP-1γ是人源的。
本发明另一方面提供了编码这些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
本发明还进一步提供了一种通过重组技术生产这些多肽的方法。
本发明又进一步提供了一种将这些多肽、或编码这些多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法，例如，包括炎性活性的免疫调节、血细胞生成和淋巴细胞运输，对骨髓干细胞集落形成的抑制，对牛皮癣、实体肿瘤的治疗，以及促进宿主对抗性慢性感染的防御。
本发明又进一步提供了抗这些多肽的抗体。
本发明又进一步提供了这些多肽的拮抗剂/抑制剂，其可用于抑制这些多肽的活性，例如，用于治疗动脉硬化、自身免疫和慢性炎症及感染性疾病、组胺介导的过敏反应、嗜酸性细胞过多综合症、硅肺、肉样瘤病、肺的炎性疾病、IL-1及TNF的抑制、再生障碍性贫血、以及脊髓发育不良综合症。
根据下面的描述，本发明的这些方面或其它方面对本领域熟练技术人员来说应是显而易见的。
下列附图是对本发明的实施方案的描述，但并不意味着限制如权利要求书所包括的本发明的范围。
图1表示编码MIP-3的cDNA序列以及相应推导的氨基酸序列。开始的45个氨基酸代表推导的前导序列。
图2表示编码MIP-4的cDNA序列以及相应推导的氨基酸序列。初始的19个氨基酸代表推导的前导序列。
图3推导的MIP-3氨基酸序列的一部分与MIP-1α的一部分线性排列后的对应关系。上面的序列为人MIP-3氨基酸序列，下面的序列为人MIP-1α(人扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白前体)。
图4表示两种氨基酸序列，其中上面的序列为人MIP-4氨基酸序列，下面的序列为人MIP-1α(人扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白前体)。
图5表示在大肠杆菌细菌表达系统中进行表达并纯化后的相应于MIP-4蛋白质的蛋白带。
图6为MIP-4的northern印迹分析，它表明在哪种细胞中该蛋白质最常见。
图7为pQE-9载体的图解说明。
图8表示编码MIP-1γ的DMA序列以及相应推导的氨基酸序列。初始的24个氨基酸代表推导的前导序列。
图9表示两种人MIP-1蛋白的部分氨基酸序列。上面的序列为人MIP-γ，下面的序列为人MIP-α(人扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白前体)。
图10表示第5泳道的蛋白带是相应于在细菌表达系统中进行表达并纯化后的MIP-1γ蛋白。
图11表示相应于MIP-1γ的COS表达的蛋白带。
图12为MIP-1γ的northern印迹分析，它表明在哪种组织中该蛋白质最常见。
本发明一方面提供了已分离的核酸(多核苷酸)，它们编码具有图1、2和8中推导的氨基酸序列的成熟多肽，或者编码由在1994年2月9日以ATCC保藏号75676进行保藏的克隆的cDNA编码的成熟MIP-3多肽，编码由在1994年2月9日以ATCC保藏号75675进行保藏的克隆的cDNA编码的成熟MIP-4多肽，及编码由在1993年10月13日以ATCC保藏号75572进行保藏的克隆的cDNA编码的MIP-1γ多肽。
编码本发明的多肽的多核苷酸在结构上与促炎超基因“inter-crine”相关，“intercrine”属细胞因子或趋化因子家族。MIP-3和MIP-4均为MIP-1的相似物，并且与MIP-1α比与MIP-1β更接近。编码MIP-3的多核苷酸是从主动脉内皮cDNA文库产生的，并含有编码121个氨基酸残基多肽的开放读码框架，该多肽表现了与许多趋化因子的显著同源性。最大匹配是与人巨噬细胞炎性蛋白1α，表现出36％的一致性和66％的相似性(图3)。
编码MIP-4的多核苷酸是从成人肺cDNA文库产生的，它含有编码89个氨基酸残基多肽的开放读码框架，该多肽表现了与许多趋化因子的显著同源性。最大匹配是与人扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白，表现出60％的一致性和89％的相似性(图4)。此外，出现于所有趋化因子特征基序中的4个半胱氨酸残基均保留在这两种克隆中。实际上在这些基因中前两个半胱氨酸残基是处于相邻位置上的，将之分类为趋化因子“C-C”或β亚族。在另一个亚族，CXC”或α亚族中，前两个半胱氨酸残基是被一个氨基酸分开的。
编码MIP-1γ的多核苷酸含有编码93个氨基酸多肽的开放性编码框架，该多肽表现了与巨噬细胞炎性蛋白-α的显著同源性，对于伸展的80个氨基酸链有48％的一致性和72％的相似性；对于鼠MIP-β在82个氨基酸的区域上有46％的一致性和67％的相似性。此外，保留了特征基序中的4个半胱氨酸残基。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或者是DNA形式，其DNA包括cDNA、基因组DNA、和合成DNA。该DNA可以是双链的或单链的，如果是单链则可以是编码链或非编码链(反义链)。编码成熟多肽的编码序列可以与图1和2所示的或保藏的克隆的编码序列相同，或者可以是不同的编码序列，这是由于遗传密码的冗余现象或简并现象，该编码序列如图1和图2的DNA或保藏的cDNA一样编码同样的、成熟多肽。
编码图1、2和8的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列以及其它编码序列如前导或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(任选还有其它编码序列)以及非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5′和/或3′非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有多肽编码序列的多核苷酸，以及含有其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明进一步涉及上述多核苷酸的变异体，其编码具有图1、2和8中推导的氨基酸序列的多肽的或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸变异体可以是天然产生的多核苷酸等位变异体或者是非天然产生的多核苷酸变异体。
因此，本发明包括编码如图1、2和8所示的同样的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的同样的成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，这些变异体编码图1、2和8的多肽的或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片断、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、替换变异体和添加或插入变异体。
如上所述，本发明多核苷酸可含有一编码序列，该编码序列是天然产生的如图1、2和8所示的编码序列的或保藏的克隆的编码序列的等位变异体。如本领域中已知的，等位变异体是一种多核苷酸序列的变型，其可以替换、缺失或添加一个或多个核苷酸，其基本上不改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括一些多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列与一多核苷酸序列可被融合于同样的读码框架中，该多核苷酸序列帮助从宿主细胞中表达和分泌多肽，例如，有分泌序列功能的前导序列以控制多肽从细胞的转运。具有前导序列的多肽是一种蛋白前体(pre-protein)，宿主细胞可裂解前导序列而形成成熟型的多肽。多核苷酸也可编码蛋白原(proprotein)，蛋白原是成熟蛋白加上附加的5′氨基酸残基。含有原序列(prosequence)的成熟蛋白质是蛋白原，是蛋白质的非活性形式。一旦原序列被裂解便得到有活性的成熟蛋白。
因此，例如，本发明的多核苷酸可编码成熟蛋白质，或编码具有原序列的蛋白质或编码具有原序列和前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸还可含有与标记序列融合于框架中的编码序列，标记序列有利于本发明多肽的纯化。在细菌宿主的情况下，标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，利于将与标记物相融合的成熟多肽进行纯化；或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。HA标记对应于从流感血细胞凝集素蛋白衍生的表位(Wilson，I.等人，Cell，37767(1984))。
本发明进一步涉及当序列间至少有50％及优选70％一致性的情况下能与上述序列进行杂交的多核苷酸。本发明特别涉及与上述多核苷酸在严紧条件下进行杂交的多核苷酸。此处所用术语“严紧条件”是指只有当两序列间有至少95％及优选至少97％一致性的情况下才发生杂交。在优选实施方案中能与上述多核苷酸进行杂交的多核苷酸编码的多肽，可以同图1中的cDNA或保藏的cDNA所编码的成熟多肽保持基本相同的生物功能或活性。
这里指的保藏物保持符合国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定。提供这些保藏物仅为了对本领域技术人员方便而不是按35 U.S.C§112.要求保藏的承认。保藏物质中含有的多核苷酸序列及其编码的多肽氨基酸序列并入本文作为参照，并且如果这里对序列的描述有任何矛盾之处时用于对照。可以提出制造、使用或销售保藏物质的许可请求，但这里并未授予这样的许可。
本发明进一步涉及具有图1、2和8推导的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的多肽MIP-3、MIP-4和MIP-1γ，以及这些多肽的片段、类似物和衍生物。
当指图1、2和8的或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”的意思是基本保持了该多肽的同样的生物功能或活性的多肽。因此，类似物包括可通过蛋白原部分的裂解进行活化生成有活性的成熟多肽的蛋白原。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。优选重组多肽。
图1、2和8的或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(I)其中的一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代，并且该被取代的氨基酸残基可以是或者不是被遗传密码编码的，或者(II)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或者(III)其中的成熟多肽与其它化合物融合，如延长多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)，或者(IV)其中有其它氨基酸融合于成熟多肽，如前导或分泌序列、或用于成熟多肽纯化的序列、或蛋白原序列。这样的片段、衍生物和类似物被视为本领域技术人员可从本发明的教导获得的内容范围之内。
本发明的多肽优选是以分离后的形式提供的，优选纯化为纯品。
术语“分离后的”是指将物质从其原始环境中(例如，如果它是天然产生的则指自然环境)分离出来。例如，天然生成的多核苷酸或存在于活体动物中的多肽是未被分离的，但从天然系统的某些或所有共生物质中分离出来的同样的多核苷酸或DNA或多肽则是被分离后的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍是被分离后的，其中这样的载体或组合物不是其自然环境中的一部分。
本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体、用本发明的载体进行基因工程处理的宿主细胞以及用重组技术生产本发明的多肽。
用于基因工程处理(转导或转化或转染)的本发明的载体可以是，例如，克隆载体或表达载体，载体可以是，例如，质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。可将基因工程处理后的宿主细胞在适当时修饰的常规营养培养基中进行培养，修饰是为了活化启动子、筛选转化子或扩增MIP-3、MIP-4和MIP-1γ基因。培养条件如温度、pH等是所选来用于表达的宿主细胞原来所用的培养条件，对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
可用本发明的多核苷酸通过重组技术生产多肽。例如，多核苷酸序列可被包括在各种表达载体的任一种之中，特别是表达多肽的载体或质粒中。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母菌质粒；由质粒和噬菌体DNA结合产生的载体，病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、鸟痘病毒、和伪狂犬病毒。但是也可使用任何其它质粒或载体，只要它们在宿主中可复制和存活。
可用不同方法将适当的DNA序列插入到载体中。通常，用本领域中已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性内切酶位点上。这种或其它方法被视为在本领域技术人员已知的范围内。
表达载体中的DNA序列通常与适当的表达控制序列(启动子)有效地连接来指导mRNA合成。作为这些启动子的代表性实例，可以提及的是LIR或SV40启动子、大肠杆菌Lac或trp启动子。噬菌体λPL启动子以及其它已知的在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的启动子。表达载体还包括翻译启始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括适宜的扩增表达的适宜序列。
另外，优选表达载体含有为了选择转化的宿主细胞提供表型性状的基因，如真核细胞培养物中的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
含有如上面所述的适宜DNA序列、以及适宜启动子或控制序列的载体可被用于转化适宜的宿主，使宿主表达蛋白质。
作为适宜的宿主的代表性实例，可以提及的是细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤害沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。适宜宿主的选择被视为在本领域技术人员从本发明教导可以得知的范围内。
更具体地说，象上面的概括性描述的那样，本发明还包括含有一个或多个序列的重组结构。结构中含有一个载体，如质粒或病毒载体，其中以正向或反向方向插入了本发明的序列。在这一实施方案中，优选结构中进一步含有与本序列有效地连接的调节序列，包括例如启动子。有许多适宜的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并有市售。提供下列载体作为实例。细菌的pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8a、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。但是也可使用任何其它质粒或载体，只要它们在宿主中可复制和存活。
启动区可选自任何使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带选择性标记载体的目的基因。两种适宜的载体是PKK232-8和PCM7。具体提及的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和延迟启动子SV40、来自反转录病毒的LRT、以及鼠金属硫蛋白-I。适宜载体和启动子的选择在本领域普通技术人员水平之内。
在进一步的实施方案中，本发明涉及含有上述结构的宿主细胞。宿主细胞可为高等真核细胞如哺乳动物细胞、或低等真核细胞如酵母细胞，或者宿主细胞可为原核细胞如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导的转染、或电穿孔法将结构引种到宿主细胞中。(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in MolecularBiology(1986))。
可以常规方法用宿主细胞中的结构生产由重组序列编码的基因产物。另外，可用常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在适宜的启动子的控制下，成熟蛋白质可在哺乳动物细胞、酵母菌、细菌、或其它细胞中得以表达。也可通过无细胞翻译系统，使用从本发明的DNA结构产生的RNA生产这些蛋白质。对用于原核或真核宿主的适宜的克隆和表达载体已有描述，见Sambrook等人，Melecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Gold Spring Har-bor，N.Y.(1989)，其公开内容在此引为参考。
将增强子序列插入载体可以提高编码本发明多肽的DNA在真核细胞中进行的转录。增强子是DNA的顺式作用元件。通常为约10至300bp，其作用于启动子以增强它的转录。实例包括位于复制起点后部bp100-270的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后部的多形瘤增强子、以及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞进行转化的适宜的选择标记物，如大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，以及指导下游结构序列转录的来自高度表达基因的启动子。这些启动子可以是由编码糖酵解酶的操纵子衍生的，这些糖酵解酶如3-磷酸苷油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白等等。异源结构序列与翻译起始和终止序列、以及优选的、能引导翻译后蛋白分泌进入壁膜间隙或细胞外介质中的前导序列组装在一个适当的框架中。任选地，异源序列可编码含有产生所需特征的N-末端鉴别肽的融合蛋白，所需特征是指例如所表达的重组蛋白质的稳定化或简化纯化过程。
用于细菌的有用的表达载体是通过在具有功能性启动子的可操纵读码框中插入编码目的蛋白的结构DNA序列以及适宜翻译起始和终止信号而构建的。载体还包括一个或多个表型选择性标记物和一个复制起点，以保证载体的维持，并且如需要，提供宿主中的扩增。用于转化的适宜的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单孢菌属、链霉菌属、和葡萄球菌属中的各个种，也可以选择其它菌种。
作为代表性的但非限制性的实例，用于细菌的有用表达载体可含有选择性标记物和细菌复制起点，由含熟知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件的市售质粒衍生得到。这些市售载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”区与适宜的启动子和要表达的结构序列相组合。在适合的宿主菌株转化以及宿主菌株生长到适当的细胞密度后，用适当方法诱导所选择的启动子(如温度变换或化学诱导)，并将细胞再培养一段时间。
通过离心收集细胞，用物理或化学方法破碎，并将所得粗提取物进一步纯化。可用任何常规方法破碎表达蛋白质所用的微生物细胞，包括冷冻—融化循环、超声、机械碎碎、或用细胞溶解剂，这些方法是本领域技术人员熟知的。
也可用各种哺乳动物细胞培养体系表达重组蛋白质。哺乳动物细胞表达体系的例子包括猴肾成纤维细胞系COS-7，Gluzman在Cell，23175(1981)中进行了阐述，以及其它能表达匹配载体的细胞系，例如，C127、3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。哺乳动物细胞表达载体含有复制起点、适合的启动子和增强子，以及任何必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、以及5′侧翼非转录序列。从SV40剪接位点衍生的DNA序列和聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。
MIP-3、MIP-4和MIP-1γ用以下方法从重组细胞的培养物中回收和纯化，所用方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。优选在纯化过程中存在低浓度的(约0.15-5毫摩尔)钙离子。(Price等人，J.Biol.Chem.，244917(1969))。在完成成熟蛋白的构型过程中，如需要，可使用蛋白质重折叠步骤。最后，可在最后的纯化步骤中使用高效液相色谱(HPLC)。
本发明的多肽可为天然纯化产物、或化学合成的产物、或用重组技术从原核或真核宿主(例如，用细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的培养)生产。根据重组生产过程中使用的宿主，本发明的多肽可用哺乳动物或其它真核糖糖基化或不糖基化。本发明的多肽还可包括一个起始甲硫氨酸残基。
本发明的多肽可用于各种免疫调节和炎性功能中，并可用于许多疾病状况。MIP-3、MIP-4和MIP-1γ属于趋化因子家族，因此它们是白细胞(如单核细胞、中性白细胞、T淋巴细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞等)的化学吸引物。因此，MIP-3、MIP-4和MIP-1γ可通过控制靶免疫细胞向创伤区侵润来促进伤口愈口。与此类似，本发明的多肽可通过吸引和活化杀微生物白细胞来促进宿主对慢性感染如分枝杆菌的防御。
另外，本发明的多肽可用于抗肿瘤治疗，因为有证据表明向肿瘤中注入趋化因子表达细胞可引起肿瘤的退化，例如，对卡波济氏肉瘤的治疗。MIP-3、MIP-4和MIP-1γ还可刺激宿主防御(杀肿瘤)细胞如胞毒T-细胞和巨噬细胞的侵入和活化，从而可用于治疗实体肿瘤。
这些多肽还可用于白血病中抑制骨髓干细胞集落的形成，并可在癌症化疗期作为造血干细胞的辅助保护治疗。
本发明多肽的另一个用途是通过抑制IL-2的生物合成来抑制T-细胞的增殖，例如，用于自身免疫疾病和淋巴细胞白血病。
MIP-3、MIP-4和MIP-1γ还可用于抑制表皮角质细胞增殖，其可用于牛皮癣(角质细胞过度增殖)，因为已发现皮肤中的朗格罕氏细胞产生MIP-1α。
MIP-3、MIP-4和MIP-1γ可通过清除碎屑炎性细胞和促结缔组织炎性细胞的募集，以及其对过多TGFβ-介导的纤维化的可能性控制来阻止伤口愈合时的瘢痕形成。另外这些多肽可用于治疗中风、血小板增多、肺栓塞和骨髓增生症，因为MIP-3、MIP-4和MIP-1γ增加血管通透性。
还可根据本发明通过体内表达这些多肽来使用这些多肽，通常将之称作“基因治疗”。
因此，例如，可将来自病人的细胞与编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在体外经基因工程处理，然后经基因工程处理的细胞向要治疗的病人提供多肽。该方法是本领域中已知的。例如，可用本领域已知的方法通过使用含有编码本发明多肽的RNA的反转录病毒颗粒对细胞进行基因工程处理。
与此类似，可将细胞在体内进行基因工程处理，通过例如本领域已知的步骤在体内进行多肽的表达。如本领域已知的，可将生成含有编码本发明多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产细胞给予患者，细胞在体内受基因工程处理，并在体内表达多肽。通过本发明的阐述，这些或其它给予本发明多肽的方法对本领域技术人员来说应是显而易见的。例如，工程细胞的表达载体可以是反转录病毒之外的载体，例如，可将腺病毒与适宜传递载体组合后用于体内处理细胞。
本发明的多肽可与适宜的药用载体结合使用。这些组合物含有治疗有效量的蛋白质，以及药学上可接受的载体或赋形剂。该载体包括但不局限于盐、缓冲性盐、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其混合物。制剂应适于给药形式。
本发明还提供了一种含有一个或多个容器的药品包或药盒，容器内填充有一种或多种本发明药物组合物的成份。该容器中同时有一份说明，以管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式，该通知反映了该机构同意人用药品的生产、使用或销售。此外，本发明的多肽可与其它治疗性化合物联合使用。
这些药物组合物可以常规方式给药，如通过口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻腔或真皮内的途径。MIP-3、MIP-4和MIP-1γ对于某对象的给药剂量和给药次数决定于许多因素，如给药方式、所治疗的情况特征、以及开处方的医生的判断。一般来说，给予的有效治疗剂量为至少约10μg/Kg体重，在大部分情况下，考虑到给药途径、症状等，给药量不超过药mg/Kg体重/每天，优选剂量从约10μg/Kg体重/每天。
本发明的序列还可用于染色体的鉴别。该序列特异性地定向于并与人染色体特定位置相杂交。另外，现今特别需要鉴别染色体上的特定位点。目前很少有基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记试剂来标记染色体位置。在将序列与和疾病相关的基因关联的过程中，根据本发明的染色体DNA基因制图是重要的第一步。
简单地说，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)来绘制染色体序列图谱。用cDNA计算机分析快速选择不跨越一个以上的基因组DNA外显子的引物，从而用于扩增过程。然后用这些引物进行含个体人染色体的体细胞杂种的PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人体基因的杂交体才会产生扩增片段。
体细胞杂种的PCR绘图是一种快速将特定DNA分配给特定染色体的方法。用本发明同样的寡聚核苷酸引物以类似的方法，可以从特异染色体的系列片段或大基因组克隆库进行再定位。其它可同样用于绘制其染色体图谱的绘图方法包括原位杂交、用标记的流动分拣的染色体的预筛选以及通过与构建的染色体特异性cDNA文库杂交来预选。
可用cDNA克隆与中期染色体展开体的荧光原位杂交(FISH)一步提供精确的染色体定位。这一技术可用于短至500或600个碱基的cDNA；但是，长于200bp的克隆更可能与单一染色体位置结合，并用简单检测方法可得到足够的信号强度。FISH需要使用从中产生EST的克隆，并且越长越好。例如，2000bp为好，4000更好，而大于4000对于以合理比例的时间获得好结果来说则是没有必要的。对这一技术的综述，参见Verma等人Human ChromosomesaManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦将序列绘制成了精密染色体位置的图谱，则可使染色体上序列的物理位置与遗传图谱数据相关。这样的数据见于例如V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可从Johns Hopkins Univer-sity Welch Medical Library获得)。然后通过连锁分析(物理相邻基因共遗传)鉴别基因与已绘制成同样的染色体区域的疾病之间的关系。
然后，需要测定受感染的与未受感染的个体之间cDNA或基因组序列的区别。如果在某些或所有受感染的个体中发现了突变，而在任何正常个体中没有发现，则该突变可能是疾病的致病因素。
根据目前物理绘图和遗传绘图技术的分辨率，精密定位于与疾病相关的染色体区域的cDNA可以是一个在50和500之间的潜在致病基因之一(这是假设1兆碱基的绘图分辨率和每20kb一个基因)。
受感染的和未受感染的个体的比较通常包括首先寻找染色体的结构变化，如可从染色体展开体中观察到的或用基于该cDNA序列的PCR可检测到的缺失或易位。最后，需要完全测定来自几个个体的基因的序列，以确认突变的存在，并将突变与多态性区分开。
本发明进一步涉及通过使用反义技术在体内抑制MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的方法。反义技术可通过三股螺旋的形成或者反义DNA或RNA用于控制基因的表达，这两种方法都是基于多核苷酸与DNA和RNA的结合。例如，用编码本发明多肽的多核苷酸序列的5′编码部分设计长度为从约10到40个碱基对的反义RNA寡聚核苷酸。将DNA寡核苷酸设计成与从事转录的基因区域互补的DNA(三股螺旋——参见Lee等人，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney等人，Science，241456(1988)；和Dervan等人，Sci-ence，2511360(1991))，从而防止MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的转录和生成。反义RNA寡核苷酸与体内mRNA杂交并阻抑mR-NA分子翻译成MIP-3、MIP-4和MIP-1γ(反义——Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense In-hibitors of Gene Express，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。
或者，可用本领域中的方法将上述寡核苷酸输入细胞，从而反义RNA或DNA可以在体内得以表达，以上述方式抑制MIP-3、MIP-4和MIP-1的生成。
因此，MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的反义结构可用于治疗MIP-诱导的或增强的疾病，例如，动脉粥样硬化、自身免疫如多发性硬化和胰岛素依赖型糖尿病，以及慢性炎症和感染性疾病、组氨酸介导的变态反应、类风湿性关节炎、硅肺、肉样瘤病、特发的肺纤维化以及其它肺慢性炎症、特发的嗜酸性细胞过多症、内毒素休克、组氨介导的变态反应、前列腺素非依赖性发热、以及再生障碍性贫血和其它骨髓衰竭情况。
多肽、它们的片段或其它衍生物或其类似物、或表达它们的细胞可用作生成其抗体的抗原。这些抗体可以是，例如，多克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的、单链的和人源化的抗体、以及Fab片段、或者Fab表达文库的产物。可用各种本领域中已知的方法生产这些抗体和片段。
可通过直接向动物注射多肽或给动物服用多肽，优选非人体，来获得针对相应于本发明序列的多肽或其体内受体生成的抗体。如此获得的抗体将与多肽本身结合。用这种方法，即使仅编码多肽片段的序列也可用于生成与整个天然多肽结合的抗体。然后可将该抗体用于从表达该多肽的组织中分离多肽。
为了制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生成的抗体的技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，Nature，256495-497)、trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，Immunology Today 472)，以及生成人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss Inc.，pp.77-96)。
为生产单链抗体所描述的技术(U.S.专利4,946,778)可适用于生产本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。
本发明还涉及本发明多肽的拮抗剂/抑制剂，其抑制或消除多肽的功能。
这样，例如，拮抗剂与本发明的多肽相结合并抑制或消除其功能。拮抗剂，例如，可以是针对多肽的抗体，其与多肽结合或者，在某些情况下，与寡聚核苷酸结合。一个抑制剂的例子是与多肽催化位点结合并占据催化位点从而使催化位点不可与底物接近的小分子，这样便阻碍了正常的生物活性。小分子的例子包括但不局限于小肽或类肽分子。
或者，可以使用本发明多肽的拮抗剂，与跟本发明多肽正常结合的受体相结合。这种拮抗剂可以是紧密相关的蛋白质，这样它们识别并与天然蛋白质的受体位点结合，但它们是多肽的非活性形式，从而由于受体位点被占据便阻碍了MIP-3、MIP-4和MIP-1γ的作用。
这样，拮抗剂/抑制剂可用作抗炎药，阻碍白细胞的吸引和活化。它们还可在自身免疫和慢性炎症和感染性疾病中用于抑制巨噬细胞及其前体、中性白细胞、嗜碱性白细胞、B淋巴细胞和某些T-细胞亚型的趋化性和活化；抑制MIP-诱导的肥大细胞和嗜碱性细胞脱粒，并且进而降低组氨酸介导的变态反应；抑制主要由IL-1和TNF引起的有害的级联反应，IL-1和TNF的生物合成是由MIP刺激的；风湿性关节炎；阻止MIP-驱动的从中性白细胞主导的炎症到巨噬细胞主导的病理状态的转变，这一转变是从急性可恢复的炎性防御而转至慢性最终破坏性机理的关键，如自身免疫疾病。
这些拮抗剂/抑制剂还可用于治疗硅肺、肉样瘤病、特发的肺纤维化和其它慢性肺炎症；特发的嗜酸性细胞过多症(由于提高了MIP的生成而加剧了嗜酸性细胞的生成和迁移)；由于MIP对内毒素的反应水平升高引起的内毒素休克；通过抑制MIP诱导的肥大细胞和嗜碱性细胞脱粒而抑制组氨酸介导的变态反应；抑制由MIP-1γ诱导的前列腺素非依赖性发热；并防止过多的MIP-1γ在再生障碍性贫血和其它骨髓衰竭情况下的抑制作用。
这些抗体还可用于对跟踪疾病发展过程和治疗干予的效果的预后应用和临床筛选。固有巨噬细胞产生少量或不产生MIP mRNA，能检测此项的诊断性抗体可用作自身免疫疾病和慢性炎症以及感染状态的指示剂。
这些拮抗剂/抑制剂可与药用载体一起用于组合物中，如上面所述。
本发明将参照下列实施例作进一步说明；但应理解本发明并不局限于这些实施例。所有份或量，除另有说明外，均以重量计。
为了便于理解下列实施例，对某些经常出现的方法和/或术语解释如下。
“质粒”用其前和/或后有大写字母和/或数的小写p表示。这文中的起始质粒是市售的、公众不受限制可得到的，或者从可得到的质粒按公开方法可以构建的。另外，同那些所描述的质粒相等同的质粒是本领域已知的，并且对于普通技术人员来说是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用在DNA某序列的限制性内切酶催化裂解DNA。此处所用的各种限制性内切酶是市售的，并且它们的反应条件、辅助因子和所用的其它要求对于普通技术人员是已知的。为了分析目的，通常于约20μl缓冲液中1μg质粒或DNA片段使用约2单位酶。为了分离用于构建质粒的DNA片段，通常用20至250单位的酶在较大体积中消化5至50μg的DNA。用于特定限制性内切酶的适宜缓冲液和底物量已由制造商标明。通常使用的孵育时间为37℃约1小时，但可根据供货商的指导而改变。消化反应后，直接将反应液在聚丙烯酰胺凝胶电泳上电泳来分离目的片段。
用8％聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离，如Goeddel，D.等人，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述。
“寡核苷酸”是指可被化学合成的单链多聚脱氧核苷酸或两个互补的多聚脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸没有5′磷酸，因此没有在激酶存在下加入磷酸和ATP，就不能与另一寡聚核苷酸连接。合成寡核苷酸将与未脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯链的过程(Maniatis，T.等人，Id.，P.146)。除非另外提供，可用已知缓冲液和条件，每0.5μg大约等摩尔量的待连接DNA片段用10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)完成连接反应。
除非另外说明，按照Graham，F.和Van der Eb，A.，Virology，52456-457(1973)中所述的方法进行转化。
实施例1MIP-3的细菌表达和纯化
首先，用相应于加工后MIP-3蛋白的5′序列(减去信号肽序列)以及MIP-3基因3′的载体序列的PCR寡聚核苷酸引物，使编码MIP-3的DNA序列ATCC#75676扩增。分别向5′和3′序列加入相应于BamHI和XbaI的额外核苷酸。5′寡聚核苷酸引物具有序列5′-TCAGGATCCGTCACAAAAGATG CAGA-3′，其含有BamHI限制性内切酶位点，限制性内切酶位点后是从推测的加工后蛋白质末端氨基酸密码子开始的MIP-3编码序列的18个核苷酸。3′序列3′-CGCTCTAGAGTAAAACGAC GGCCAGT-5′含有与XbaI位点互补的序列和与位于MIP-3DNA插入子3′的pBluescript SK-载体序列互补的序列。限制性内切酶位点相应于细菌表达载体PQE-9上的限制性内切酶位点。(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。PQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG-可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-His标记和限制性内切酶位点。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。将扩增后的序列连接到PQE-9中并与编码组氨酸标记和RBS的序列插入同一框架。图6表示该方法的示意图。然后将连接混合物用于转化大肠杆菌M15/rep4，该菌株可从Qiagen以商标M15/rep4获得。M15/rep4含有多挎贝的质粒，该质粒表达lacI阻抑物，并且还能提供卡那霉素抗性(Kanr)。通过它们在LB平板上的生长能力来鉴别转化子，并筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并用限制酶切分析确认。将含有目的结构的克隆在补充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB培养基中液体培养生长过夜(O/N)。将培养过夜的培养物用于接种大量的培养液，比例为1∶100至1∶250。使细胞生长到光密度600(O.D.600)为0.4至0.6之间。然后加入IPTG(“异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至最终浓度为1mM。IPTG通过使lacI阻抑物失活来释放P/O，导致基因表达增强。再使细胞生长3至4小时。离心收集细胞。将细胞沉淀溶解于离液剂6摩尔盐酸胍中。澄清后，在使含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，在Nickel-Chelate柱上层析，从该溶液中纯化溶解的MIP-3。Hochuli，E等人，J.Chromato-graphy 411177-184(1984)。用6摩尔盐酸胍pH5.0从柱子中洗脱出MIP-3(纯度95％)，并且为了使之复性将其调节至3摩尔盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔谷胱甘肽(还原的)和2毫摩尔谷脱甘肽(氧化的)。在该溶液中孵育12小时将该溶液对10毫摩尔磷酸钠透析。诱导后相应于14Kd的新蛋白质的出现验证了MIP-3的表达。
实施例2MIP-4的细菌表达和纯化首先，用相应于加工后的MIP-4蛋白质5′序列(减去信号肽序列)和MIP-4基因的3′pBSK载体序列的PCR寡核苷酸引物，使编码MIP-4的DNA序列ATCC#75675扩增。分别向5′和3′序列加入相应于BamHI和XbaI的额外核苷酸。5′寡聚核苷酸引物具有序列TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC，其含有BamHI限制性内切酶位点，限制性内切酶位点后是从推测的加工后蛋白质末端氨基酸密码子开始的MIP-4编码序列的18个核苷酸；3′序列CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT含有与XbaI位点互补的序列和与位于MIP-4DNA插入子3′的pBluescriptSK-载体序列互补的序列。限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-9上的限制性内切酶位点。(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG-可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-His标记和限制性内切酶位点。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。将扩增后的序列连接到pQE-9中并与编码组氨酸标记和RBS的序列插入同一框架。图6表示该方法的示意图。然后将连接混合物用于转化大肠杆菌M15/rep4，该菌株可从Qiagen以商标M15/rep4获得。M15/rep4含有多挎贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻抑物，并且还能提供卡那霉素抗性(Kanr)。通过它们在LB平板上的生长能力来鉴别转化子，并筛选氨苄氢青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并用限制酶切分析确认。将含有目的结构的克隆在补充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。将培养过夜的培养物用于接种大量的培养液，比例为1∶100至1∶250。使细胞生长到光密度600(O.D.600)为0.4至0.6之间。然后加入IPTG(“异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至最终浓度为1mM。IPTG通过使lacI阻抑物失活来释放P/O，导致基因表达增强。再使细胞生长3至4小时。离心收集细胞。将细胞沉淀溶解于离液剂6摩尔盐酸胍中。澄清后，在使含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，在Nickel-Chelate柱上层析；从该溶液中纯化溶解的MIP-4。Hochuli，E等人，J.Chromatography411177-184(1984)。用6摩尔盐酸胍pH5.0从柱子中洗脱出MIP-4(纯度95％)，并且为了使之复性将其调节至3摩尔盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔谷胱甘肽(还原的)和2毫摩尔谷胱甘肽(氧化的)。在该溶液中孵育12小时后将该溶液对10毫摩尔磷酸钠透析。诱导后相应于14kd的新蛋白质的出现验证了MIP-4的表达。(图5)。
实施例3重组MIP-3在COS细胞中的表达表达质粒CMV-MIP-3HA是从载体pcDNAI/Amp(Invitro-gen)衍化来的，其含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，其后是多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码整个MIP-3前体和同框架融合于其3′末端的HA标记物的DNA片段克隆列载体的多接头区，从而，在CMV启动子的控制下进行重组蛋白的表达。如前面所述，HA标记物对应于从流感血细胞凝集素蛋白衍生的表位(I.Wilson，H.Ni-man，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，Cell37，767)。HA标记物与我们的靶蛋白的融合使得易于用识别HA表位的抗体检测重组蛋白质。
质粒的构建方法叙述如下用两个引物在原始EST克隆上用PCR方法构建编码MIP-3的DNA序列ATCC#75676，这两个引物是5′引物(5′GGAAAGCT-TAT GAAGGTCTCCGTGGCT-3′)含有HindIII位点，该位点后是从起始密码子开始的MIP-3编码序列的18个核苷酸；3′序列(5′-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC-3′)含有与XbaI位点、翻译终止密码子、HA标记物和MIP-3编码序列(不包括终止密码子)的最后20个核苷酸互补的序列。因此，PCR产物含有HindIII位点、MIP-3编码序列、其后有同框架融合的HA标记物、跟在HA标记物后面的翻译终止密码子、以及XbaI位点。用HindIII和XbaI限制性内切酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并进行连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(可从StratageneCloning Systems获得，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037)。将转化后的培养物铺到氨苄青霉素培养基平板上，并筛选抗性克隆。从转化子中分离质粒DNA，并用限制酶切分析检查正确片段的存在。为了表达重组MIP-3，用DEAE-DEXTRAN法使表达载体转染到COS细胞中(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring LaboratoryPress，(1989))。用放射性标记和免疫沉淀法检测MIP-3-HA蛋白的表达。(W.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。转染两天后，用35S-半胱氨酸将细胞标记8小时。然后收集培养基并用洗涤剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)溶解细胞。(Wilson，I.等人，Id，37767(1984))。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞溶解物和培养基。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。
实施例4重组MIP-4在COS细胞中的表达表达质粒CMV-MIP-4HA的是从载体pcDNAI/Amp(Invit-rogen)衍化来的，其含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，其后是多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码整个MIP-4前体和同框架融合于其3′末端的HA标记物的DNA片段克隆列载体的多接头区，从而在CMV启动子的控制下进行重组蛋白的表达。如前面所述，HA标记物对应于从流感血细胞凝集素蛋白衍生的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，Cell37，767)。HA标记物与我们的靶蛋白的融合使得易于用识别HA表位的抗体检测重组蛋白质。
质粒的构建方法叙述如下用两个引物在原始EST克隆上用PCR方法构建编码MIP-4的DNA序列ATCC#75675，这两个引物是5′引物(5′GGAAAGCT-TAT GAAGGGCCTTGCAGCTGCC-3′)含有HindIII位点，该位点后是从起始密码子开始的MIP-4编码序列的20个核苷酸；3′序列(5′CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCA GGTC3′)含有与XbaI位点、翻译终止密码子、HA标记物和MIP-4编码序列(不包括终止密码子)的最后19个核苷酸互补的序列。因此，PCR产物含有HindIII位点、MIP-4编码序列、其后有同 框架融合的HA标记物、跟在HA标记物后面的翻译终止密码子、以及XbaI位点。用HindIII和XbaI限制性内切酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并进行连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(可从Stratagene CloningSystems获得，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037)。将转化后的培养物铺到氨苄青霉素培养基平板上并筛选抗性克隆。从转化子中分离质粒DNA，并用限制酶切分析检查正确片段的存在。为了表达重组MIP-4，用DEAE-DEXTRAN法使表达载体转染到COS细胞中(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring LaboratoryPress，(1989))。用放射性标记和免疫沉淀法检测MIP-4-HA蛋白的表达。(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。转染两天后，用35S半胱氨酸将细胞标记8小时。然后收集培养基并用洗涤剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)溶解细胞。(Wilson，I.等人，Id，37767(1984))。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞溶解物和培养基。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。
实施例5人体组织中MIP-3的表达模式用Northern印迹分析法检测人体组织中MIP-3的表达水平。用RNAzolTMB系统(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South LoopEast，Houston，TX77033)分离所有细胞RNA样品。将从每种人体组织中分离的所有RNA约10μg在l％琼脂糖凝胶上进行分离，并转印到尼龙滤膜上。(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，Mole cularCloning，Cold Spring Harbor Press，(1989))。按照StratagenePrime-It试剂盒用50ng DNA片段进行标记反应。用Select-G-50柱纯化标记的DNA，(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad’Boulder，CO 80303)。然后将滤膜与放射活性标记的全长MIP-3基因以1,000,000cpm/ml于0.5M Na3PO4、pH7.4和7％SDS中于65℃杂交过夜。用0.5XSSC、0.1％SDS在室温洗涤两次，在60℃洗涤两次，然后将滤膜用增敏屏在-70℃暴光过夜。实施例6人体组织中MIP-4的表达模式用Northern印迹分析法检测人体组织中MIP-4的表达水平。用RNAzolTMB系统(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South LoopEast，Houston，TX77033)分离所有细胞RNA样品。将从每种人体组织中分离的所有RNA约10μg在1％琼脂糖凝胶上进行分离，并转印到尼龙滤膜上。(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，Mole-cularCloning，Cold Spring Harbor Press，(1989))。按照StratagenePrime-It试剂盒用50ng DNA片段进行标记反应。用Select-G-50柱纯化标记的DNA，(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad，Boulder，CO 80303)。然后将滤膜与放射活性标记的全长MIP-4基因以1,000,000cpm/ml于0.5M Na3PO4、pH7.4和7％SDS中于65℃杂交过夜。用0.5XSSC、0.1％SDS在室温洗涤两次，在60℃洗涤两次，然后将滤膜用增敏屏在-70℃暴光过夜。参见图6。
实施例7MIP-1γ的细菌表达和纯化首先，用相应于加工过的MIP-1γ蛋白的5′和3′序列(减去信号肽序列)的PCR寡聚核苷酸引物，使编码MIP-1γ的DNA序列PBLSKMIP(ATCC#75572)扩增。相应于BamHI和XbaI的额外核苷酸分别加入5′和3′序列。5′寡聚核苷酸引物具有序列GCC-CGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC，其含有BamHI限制性内切酶位点，限制性内切酶位点后是从推测的加工后蛋白质末端氨基酸密码子开始的MIP-1γ编码序列的15个核苷酸。3′序列GC-CTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG含有与XbaI位点、翻译终止密码子和MIP-1γ编码序列的最后20个核苷酸互补的序列。限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-9上的限制性内切酶位点。(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌复制起点(ori)、IPTG-可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-His标记和限制性内切酶位点。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。将扩增后的序列连接到pQE-9中并与编码组氨酸标记和RBS的序列插入同一框架。图6表示该方法的示意图。然后将连接混合物用于转化大肠杆菌，该菌株可从Qiagen以商标M15/rep4获得。M15/rep4含有多挎贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻抑物，并且还能提供卡那霉素抗性Kanr)。通过它们在LB平板上的生长能力来鉴别转化子，并筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并用限制酶切分析确认。将含有目的结构的克隆在补充有Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB培养基中液体培养生长过夜(O/N)。将培养过夜的培养物用于接种大量的培养液，比例为1∶100至1∶250。使细胞生长到光密度600(O.D.600)为0.4至0.6之间。然后加入IPTG(“异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至最终浓度为1mM。IPTG通过使lacI阻抑物失活来释放P/O，导致基因表达增强。再使细胞生长3至4小时。离心收集细胞。将细胞沉淀溶解于离液剂6摩尔盐酸胍中。澄清后，在使含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，在Nickel-Chelate柱上层析，从该溶液中纯化溶解的MIP-1γ。Hochuli，E等人，J.Chromatography 411177-184(1984)。用6摩尔盐酸胍pH5.0从柱子中洗脱出MIP-1γ(纯度95％)，并且为了使之复性将其调节至3摩尔盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔谷胱甘肽(还原的)和2毫摩尔谷脱甘肽(氧化的)。在该溶液中孵育12小时后，将该溶液对10毫摩尔磷酸钠透析。诱导后相应于14Kd的新蛋白质的出现验证了MIP-1γ的表达。(图3)实施例8重组MIP-1γ在COS细胞中的表达表达质粒CMV-MIP-1γHA的是从载体pcDNAI/Amp(In-vitrogen)衍生来的，其含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，其后是多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码整个MIP-1γ前体和同框架融合于其3′末端的HA标记物的DNA片段克隆列载体的多接头区，从而，在CMV启动子的控制下进行重组蛋白的表达。如前面所述，HA标记物对应于从流感血细胞凝集素蛋白衍生的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，Cell37，767)。HA标记物与我们的靶蛋白的融合使得易于用识别HA表位的抗体检测重组蛋白质。
质粒的构建方法叙述如下用两个引物在原始EST克隆上用PCR方法构建编码MIP-1γ的DNA序列(ATCC#75572)，这两个引物是5′引物(5′GGAAAGCTTAT GAAGATTCCGTGGCTGC-3′)含有HindIII位点，该位点后是从起始密码子开始的MIP-1γ编码序列的20个核苷酸；3′序列(5′-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG-3′)含有与XbaI位点、翻译终止密码子、HA标记物和MIP-1γ编码序列(不包括终止密码子)的最后19个核苷酸互补的序列。因此，PCR产物含有HindI-II位点、MIP-1γ编码序列、其后有同框架融合的HA标记物、跟在HA标记物后面的翻译终止密码子、以及XbaI位点。用HindIII和XbaI限制性内切酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并进行连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(可从Stratagene Cloning Systems获得，11099 North Torrey PinesRoad，La Jolla，CA92037)。将转化后的培养物铺到氨苄青霉素培养基平板上并筛选抗性克隆。从转化子中分离质粒DNA，并用限制酶切分析检查正确片段的存在。为了表达重组MIP-1γ，用DEAE-DEXTRAN法使表达载体转染到COS细胞中(J.Sam-brook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecalar CloningA Laboratory Man-ual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。用放射性标记和免疫沉淀法检测MIP-1γ-HA蛋白的表达。(E.Harlow，D.Lane，Anti-bodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。转染两天后，用35S半胱氨酸将细胞标记8小时。然后收集培养基并用洗涤剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)溶解细胞。(Wilson，I.等人，Id，37767(1984))。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞溶解物和培养基。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。
实施例9人体组织中MIP-1γ的表达模式用Northern印迹分析法检测人体组织中MIP-1γ的表达水平。用RNAzolTMB系统(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South LoopEast，Houston，TX77033)分离所有细胞RNA样品。将从各种人体组织中分离的所有RNA约10μg在1％琼脂糖凝胶上进行分离，并转印到尼龙滤膜上。(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，Mole cularCloning，Cold Spring Harbor Press，(1989))。按照StratagenePrime-It试剂盒用50ng DNA片段进行标记反应。用Select-G-50柱纯化标记的DNA，(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad，Boulder，CO 80303)。然后将滤膜与放射活性标记的全长MIP-1γ基因以1,000,000cpm/ml于0.5M Na3PO4、pH7.4和7％SDS中于65℃杂交过夜。用0.5XSSC、0.1％SDS在室温洗涤两次，在60℃洗涤两次，然后将滤膜用增敏屏在-70℃暴光过夜。在脾、肺、肝中有丰富的MIP-1γ的信使RNA，而其它组织中则较少。(图5)。
基于上述讲解，本发明可以有多种修改和变型，因此在所附权利要求书的范围内，可按上面特别描述以外的方法实施本发明。
序列表(1)一般信息(i)申请人LI，等人。
(ii)发明名称巨噬细胞炎性蛋白-3、-4和1γ。
(iii)序列数6(iv)通信地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CEC-CHI，STEWART&OCSTEIN(B)大街6 BECKER FARM ROAD(C)城市Roseland(D)州新泽西(E)国别美国(F)邮编07268(v)计算机阅读形式(A)媒介类型3.5英寸软盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日.
(C)分类.
(vii)在先申请数据
(A)申请号08/173,209(B)申请日22-DEC-93(viii)在先申请数据(A)申请号08/208,339(B)申请日08-MAR-94(ix)代理人/代理机构信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注册号36134.
(C)参考号/卷号325800-163(x)电信(A)电话201-944-1700(B)传真201-944-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征.
(A)长度474个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TGAAGCTCCC ACCAGGCCAG CTCTCCTCCC ACAACAGCTT CCCACAGCAT GAAGATCTCC 60GTGGCTGCAA TTCCCTTCTT CCTCCTCATC ACCATCGCCC TAGGGACCAA GACTGAATCC 120TCCTCACGGG GACCTTACCA CCCCTCAGAG TGCTGCTTCA CCTACACTAC CTACAAGATC 180CCGCGTCAGC GGATTATGGA TTACTATGAG ACCAACAGCC AGTGCTCCAA GCCCGGAATT 240GTCTTCATCA CCAAAAGGGG CCATTCCGTC TGTACCAACC CCAGTGACAA GTGGGTCCAG 300GACTATATCA AGGACATGAA GGAGAACTGA GTGACCCAGA AGGGGTGGCG AAGGCACAGC 360TCAGAGACAT AAAGAGAAGA TGCCAAGGCC CCCTCCTCCA CCCACCGCTA ACTCTCAGCC 420CCAGTCACCC TCTTGGAGCT TCCCTGCTTT GAATTAAAGA CCACTCATGC TCTT 474(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征.
(A)长度93个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr-20 -15 -10Ile Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr-5 1 5His Pro Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro10 15 20Arg Gln Arg Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser25 30 35Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys40 45 50Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met55 60 65Lys Glu Asn(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度366个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTACATGCCT TTTTACTGCC CTTGGTCCCA 60GGGCCGGGTC ACAAAAGATG CAGAGACAGA GTTCATGAAT GTCAAAGCTT CATTGGAAAG 120ATCCAGTACT TCTGGGACAG ATTCCATGCT ACTAGTGCTG ACTGCTGCAT CTCCTACACC 180CCACGAAGCA TCCCGTGTTC ACTCCTGGAG AGTTACTTTG AAACGAACAG CGAGTGCTCC 240AAGCCGGGTG TCATCTTCCT CACCAAGAAG GGGCGACGTT TCTGTGCCAA CCCCAGTGAT 300AAGCAAGTTC AGGTTTGCAT GAGAATGCTG AAGCTGGACA CACGGATCAA GACCAGGAAG 360AATTGA366(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征.
(A)长度121个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu His Ala Phe Leu-45 -40 -35Leu Pro Leu Val Pro Gly Pro Gly His Lys Arg Cys Arg Asp Arg-30 -25 -20Val His Glu Cys Gln Ser Phe His Trp Lys Ile Gln Tyr Phe Trp-15 -10 -5Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr5 10 15Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Gln Ser Tyr Phe Glu Thr20 25 30Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys35 40 45Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val50 55 60Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys65 70 75Asn(3)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征.
(A)长度270个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGAAGGGCC TTGCAGCTGC CCTCCTTGTC CTCGTCTGCA CCATGGCCCT CTGCTCCTGT 60GCACAAGTTG GTACCAACAA AGAGCTCTGC TGCCTCGTCT ATACCTCCTG GCAGATTCCA 120CAAAAGTTCA TAGTTGACTA TTCTGAAACC AGCCCCCAGT GCCCCAAGCC AGGTGTCATC 180CTCCTAACCA AGAGAGGCCG GCAGATCTGT GCTGACCCCA ATAAGAAGTG GGTCCAGAAA 240TACATCAGCG ACCTGAAGCT GAATGCCTGA 270(4)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征.
(A)长度89个氨基酸(B)类型氨基酸(C)成链类型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met-15 -10 -5Ala Leu Cys Ser Cys Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu5 10Cys Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile15 20 25Val Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val30 35 40Ile Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Ile Cys Ala Asp Pro Asn45 50 55Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Lys Leu Asn Ala60 65 70
权利要求
1.选自下组中的分离的多核苷酸，该组由如下组成(a)编码具有图1中的推导氨基酸序列的MIP-3多肽或该多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；(b)编码具有由保藏在ATCC保藏号为75676的cDNA编码的氨基酸序列的MIP-3多肽或该多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；(c)编码具有图2中的推导氨基酸序列的MIP-4多肽或该多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；(d)编码具有由保藏在ATCC保藏号为75675的cDNA编码的氨基酸序列的MIP-4多肽或该多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸为DNA。
3.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸为RNA。
4.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸为基因组DNA。
5.权利要求2的多核苷酸，其中所说多核苷酸编码具有图1中推导氨基酸序列的MIP-3。
6.权利要求2的多核苷酸，其中所说多核苷酸编码由ATCC保藏号75676的cDNA编码的MIP-3多肽。
7.权利要求2的多核苷酸，其中所说多核苷酸编码具有图2中推导氨基酸序列的MIP-4。
8.权利要求2的多核苷酸，其中所说多核苷酸编码由ATCC保藏号75675的cDNA编码的MIP-4多肽。
9.权利要求1的多核苷酸，其具有图1中所示的MIP-3编码序列。
10.权利要求2的多核苷酸，其具有以ATCC保藏号75676保藏的MIP-3编码序列。
11.权利要求1的多核苷酸，其具有图2中所示的MIP-4编码序列。
12.权利要求2的多核苷酸，其具有以ATCC保藏号75675保藏的MIP-4编码序列。
13.含有权利要求2的DNA的载体。
14.用权利要求13的载体基因工程处理的宿主细胞。
15.一种生产多肽的方法，包括从权利要求14的宿主细胞表达由所述DNA编码的多肽
16.一种生产能表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求13的载体基因工程处理细胞。
17.一种可与权利要求2的DNA杂交并编码具有MIP-3活性的多肽的已分离的DNA。
18.一种可与权利要求2的DNA杂交并编码具有MIP-4活性的多肽的已分离的DNA。
19.选自下组中的多肽，该组由如下组成(i)具有图1中推导氨基酸序列的MIP-3多肽及其片段、类似物或衍生物，(ii)由ATCC保藏号75676的cDNA编码的MIP-3多肽及该多肽的片段、类似物和衍生物，(iii)具有图2中推导氨基酸序列的MIP-4多肽及其片段、类似物或衍生物，(iv)由ATCC保藏号75675的cDNA编码的MIP-4多肽及该多肽的片段、类似物和衍生物。
20.权利要求19的多肽，其中多肽是具有图1中的推导氨基酸序列的MIP-3。
21.权利要求19的多肽，其中多肽是具有图2中的推导氨基酸序列的MIP-4。
22.抗权利要求19的MIP-3多肽的抗体。
23.抗MIP-3受体的抗体。
24.抗MIP-4受体的抗体。
25.抗权利要求19的MIP-4多肽的抗体。
26.权利要求19的MIP-3多肽的拮抗剂/抑制剂。
27.权利要求19的MIP-4多肽的拮抗剂/抑制剂。
28.一种治疗需要MIP-3的病人的方法，包括给病人服用治疗有效量的权利要求19的多肽。
29.一种治疗需要MIP-4的病人的方法，包括给病人服用治疗有效量的权利要求19的多肽。
30.一种治疗需要抑制MIP-3的病人的方法，包括给病人服用治疗有效量的权利要求26的拮抗剂/抑制剂。
31.一种治疗需要抑制MIP-4的病人的方法，包括给病人服用治疗有效量的权利要求27的拮抗剂/抑制剂。
32.一种含有权利要求19的MIP-3多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
33.一种含有权利要求19的MIP-4多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
34.选自下组中的分离的多核苷酸，该组由如下组成(a)编码具有图8中的推导氨基酸序列的MIP-1γ多肽或该多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；(b)编码具有由保藏在ATCC保藏号为75572的cDNA编码的氨基酸序列的MIP-1γ多肽或该多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；
35.权利要求34的多核苷酸，其中多核苷酸为DNA。
36.权利要求34的多核苷酸，其中多核苷酸为RNA。
37.权利要求34的多核苷酸，其中多核苷酸为基因组DNA。
38.权利要求35的多核苷酸，其中所说多核苷酸编码具有图8中推导氨基酸序列的MIP-1γ。
39.权利要求35的多核苷酸，其中所说多核苷酸编码由ATCC保藏号75572的cDNA编码的MIP-1γ多肽。
40.权利要求34的多核苷酸，其具有图8中所示的MIP-1γ编码序列。
41.权利要求35的多核苷酸，具有以ATCC保藏号75572保藏的MIP-1γ编码序列。
42.含有权利要求35的DNA的载体。
43.用权利要求42的载体基因工程处理的宿主细胞。
44.一种生产多肽的方法，包括从权利要求43的宿主细胞表达由所述DNA编码的多肽
45.一种生产能表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求42的载体基因工程处理细胞。
46.一种可与权利要求35的DNA杂交并编码具有MIP-1γ活性的多肽的已分离的DNA。
47.选自下组中的多肽，该组由如下组成(i)具有图8中推导氨基酸序列的MIP-1γ多肽及其片段、类似物或衍生物，以及(ii)由ATCC保藏号75572的cDNA编码的MIP-1γ多肽及该多肽的片段、类似物和衍生物。
48.权利要求14的多肽，其中多肽是具有图8中的推导氨基酸序列的MIP-1γ。
49.抗权利要求47的多肽的抗体。
50.权利要求47的多肽的拮抗剂/抑制剂。
51.一种治疗需要MIP-1γ的病人的方法，包括给病人服用治疗有效量的权利要求47的多肽。
52.一种治疗需要抑制MIP-1γ的病人的方法，包括给病人服用治疗有效量的权利要求50的拮抗剂/抑制剂。
53.一种含有权利要求47的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
54.权利要求18的方法，其中通过向病人提供编码所说多肽的DNA并在体内表达该多肽来给予治疗有效量的多肽。
全文摘要
本发明公开了人巨噬细胞炎性蛋白-3、人巨噬细胞炎性蛋白-4和人巨噬细胞炎性蛋白1γ多肽和编码这些多肽的DNA(RNA)。本发明还提供了用重组技术生产这些多肽的方法以及生产抗这些多肽的抗体的方法。本发明还提供了抑制这些多肽的功能的这些多肽的拮抗剂/抑制剂。本发明另一方面提供了本发明的多肽与适宜药用载体的结合，以为各种相关疾病的治疗提供治疗有效量的多肽。
文档编号A61P17/06GK1143894SQ94194902
公开日1997年2月26日 申请日期1994年6月28日 优先权日1993年12月22日
发明者李浩东, C·A·罗森, S·M·鲁宾, M·D·亚当斯 申请人:人类基因组科学公司