专利名称：增强胰腺功能的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种增强胰腺功能的组合物，一种促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物，或者一种预防和治疗未分化的胰腺癌的组合物；该组合物中包含了一种β细胞素蛋白(betacellulin)及其突变产物。
背景知识β细胞素蛋白(下文中也称为BTC蛋白)是一种来源于转基因小鼠的胰腺β肿瘤细胞产生的多肽因子，通过cDNA分析已清楚它的全长氨基酸序列。〔Shing等，《科学》(Science)，2591604(1993年)〕、〔Sasada等，《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochemical and Biophysicai ResearchCommunications)，1901173(1993年)〕。虽然，最初发现BTC蛋白是一种小鼠3T3细胞生长的促进因子，随后又发现它对血管平滑肌细胞和视网膜色素上皮细胞具有促进生长的活性〔Shing等，Science，2591604(1993年)〕。
生理条件下人的BTC蛋白数量非常少，由于受到各种限制从组织中提取也非常困难。近年来，通过基因工程技术已经成功地生产了数量较多，价格也相对低廉的人BTC蛋白(EP-A-0555785)。而且已有报道BTC蛋白可用于治疗一些疾病如创伤、肿瘤和血管畸形，还可制备成诸如抗体或假性肽的竞争剂用于治疗一些由于平滑肌生长导致的疾病，如动脉粥样硬化和糖尿病视网膜病变。(EP-A-0482623，EP-A-0555785)
另外，BTC蛋白的mRNA已经在除了脑以外的器官中测到，如肝脏、肾脏和胰腺，提示该蛋白在这些器官中也发挥了一定的作用，但仍需进一步详细地研究。
发明的公开糖尿病是一种与持续血糖升高有关，出现各种合并症为特征的疾病，可分为三种类型胰岛素依赖型、非胰岛素依赖型和其它类型。其病因很复杂，但基本上与胰岛素的作用减弱有关。特别是胰岛素依赖型糖尿病，与胰岛素产生量的绝对减少有关。基于这种背景，有必要合成一种药物能够增强胰腺的功能，用于预防和治疗糖尿病。
考虑到上述问题，本发明者通过深入研究发现，已知的BTC蛋白可作用于具有多向分化功能的部分胰腺外分泌腺细胞，使之向胰腺β细胞分化。本发明者基于这个发现，经进一步研究后完成了本项发明。
相应地，本项发明提供了(1)一种增强胰腺功能的组合物，该组合物中包含了一种β细胞素蛋白(betacellulin)及其突变产物。
(2)根据(1)的组合物，其中的β细胞素蛋白是一种至少含有一个选自序列表中SEQ ID No3，SEQ ID No4，SEQ IDNo5或SEQ ID No6所示的氨基酸序列的蛋白质。
(3)根据(1)的组合物，其中的β细胞素蛋白是一种含有SEQ ID No1或SEQ ID No2所示的氨基酸序列的蛋白质。
(4)根据(1)的组合物，其中的β细胞素蛋白的突变产物是一种含有(i)一段从SEQ ID No1号或SEQ ID No2号所示的氨基酸序列中删除大约1-40个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质；(ii)一段SEQ ID No1号或SEQ ID No2号所示的氨基酸序列中大约1-40个氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序列的蛋白质；或(iii)一段在SEQ ID No1号或SEQ IDNo2号所示的氨基酸序列中增加大约1-40个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质；(5)根据(1)的组合物，其中的β细胞素蛋白的突变产物是一种含有一段从SEQ ID No1号所示的氨基酸序列N-端删除大约12或30个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质；(6)根据(1)至(5)的组合物，其中还含有苯丙酸诺龙(activin)；(7)根据(6)的组合物，其中的苯丙酸诺龙与β细胞素蛋白及其突变产物的含量比率大约是1∶10至10∶1；(8)根据(1)至(7)的组合物，用于预防或治疗糖尿病；(9)根据(1)至(7)的组合物，用于预防或治疗糖尿病患者的胰腺功能障碍或与老年性胰岛素分泌减少有关的胰腺功能低下；(10)一种促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物，其中包含了一种β细胞素蛋白或其突变产物；(11)一种预防或治疗未分化型胰腺癌的组合物，其中包含了一种β细胞素蛋白或其突变产物；(12)一种增强人类或哺乳类动物胰腺功能的方法，该方法包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物；(13)一种促进人类或哺乳类动物胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的方法，该方法包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物；(14)一种预防或治疗人类或哺乳类动物未分化型胰腺癌的方法，该方法包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物；(15)应用β细胞素蛋白或其突变产物制备一种增强胰腺功能的组合物；
(16)应用β细胞素蛋白或其突变产物制备一种促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物；(17)应用β细胞素蛋白或其突变产物制备一种预防或治疗胰腺癌的组合物。
进一步，本项发明还提供了(18)一种增强胰腺功能的组合物，其中包含了一段编码β细胞素蛋白或其突变产物的DNA；(19)一种促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物，其中包含了一段编码β细胞素蛋白或其突变产物的DNA；(20)一种预防或治疗未分化型胰腺癌的组合物，其中包含了一段编码β细胞素蛋白或其突变产物的DNA；(21)一种增强人类或哺乳类动物胰腺功能的方法，该方法包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物；(22)一种促进人类或哺乳类动物胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的方法，该方法包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物；(23)一种预防和治疗未分化型胰腺癌的方法；(24)应用一段编码β细胞素蛋白或其突变产物的DNA，以制备一种增强胰腺功能的组合物；(25)应用一段编码β细胞素蛋白或其突变产物的DNA，以制备一种促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物；(26)应用一段编码β细胞素蛋白或其突变产物的DNA，以制备一种预防或治疗未分化型胰腺癌的组合物。图表的简单说明
图1示β细胞素蛋白浓度与分化为分泌胰岛素的β细胞或分泌胰腺肽(PP)的F细胞的关系。横坐标示β细胞素蛋白浓度(M)，纵坐标示分泌上述激素的细胞占总细胞数的比率(％)。
示分泌胰岛素的β细胞数，●示分泌胰腺肽(PP)的F细胞数。
图2示不同因子对分化为分泌胰岛素的β细胞的作用效果。纵坐标示作用因子的名称，横坐标示分泌胰岛素的细胞占总细胞数的比率(％)。EGF示表皮生长因子；TGF-α示转化生长因子-α；Betacellulin示人β细胞素蛋白。苯丙酸诺龙A(Activin A)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)和人β细胞素蛋白的度分别是1×10-19M。苯丙酸诺龙A+表皮生长因子，苯丙酸诺龙A+转化生长因子-α和苯丙酸诺龙A+β细胞素蛋白示1×10-19M浓度的表皮生长因子、转化生长因子-α和β细胞素蛋白分别与2×10- 19M浓度的苯丙酸诺龙A混合。
图3示K+离子和甲苯磺丁脲(tolbulamide)对AR42J细胞分泌胰岛素的影响，AR42J细胞是一种已经分化的分泌胰岛素的细胞。横坐标上空白、K+离子、甲苯磺丁脲分别示没有K+离子或甲苯磺丁脲、40mM的K+离子和10mM的甲苯磺丁脲。纵坐标示分泌的胰岛素浓度(pg/mg.蛋白质)。
图4示通过糖尿病小鼠在四氧嘧啶治疗之前的腹膜内糖耐量实验(ipGTT)，表明人β细胞素蛋白能够增强小鼠的葡萄糖耐量。横坐标示腹膜内给葡萄糖后的时间，纵坐标示血糖水平(mg/ml)。○、●、▲分别示未给四氧嘧啶的小鼠、给予四氧嘧啶但未给人β细胞素蛋白的小鼠和同时给予四氧嘧啶和人β细胞素蛋白的小鼠的三种结果。
图5通过糖尿病小鼠在四氧嘧啶治疗4周后的腹膜内糖耐量实验(ipGTT)，表明人β细胞素蛋白能够增强小鼠的葡萄糖耐量。横坐标示腹膜内给葡萄糖后的时，纵坐标示血糖水平(mg/ml)。○、●、▲分别示未给四氧嘧啶的小鼠、给予四氧嘧啶但未给人β细胞素蛋白的小鼠和同时给予四氧嘧啶和人β细胞素蛋白的小鼠的三种结果。
图6通过糖尿病小鼠在四氧嘧啶治疗8周后的腹膜内糖耐量实验(ipGTT)，表明人β细胞素蛋白能够增强小鼠的葡萄糖耐量。横坐标示腹膜内给葡萄糖后的时间，纵坐标示血糖水平(mg/ml)。○、●、▲分别示未给四氧嘧啶的小鼠、给予四氧嘧啶但未给人β细胞素蛋白的小鼠和同时给予四氧嘧啶和人β细胞素蛋白的小鼠的三种结果。
图7示人β细胞素蛋白对胰腺癌细胞的抑制生长的活性。横坐标示细胞培养的天数，纵坐标示来源于胰腺癌的AR42J细胞的第71号细胞系的数目(×10-3)。○示细胞在含人BTC蛋白的培养基里孵育的结果，●示细胞在不含人BTC蛋白的培养基里孵育的结果。
任何一种BTC蛋白质均可以应用在本发明的组合物中，用于增强胰腺功能(下文中也称为具有增强功能的组合物)，用于促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化(下文中也称为具有促进功能的组合物)，或者用于预防、治疗未分化型的胰腺癌(下文中也称为用于预防、治疗未分化型胰腺癌的组合物)，其中包含的BTC蛋白及其突变产物具有与BTC蛋白质一样的生物活性，即促进纤维母细胞、血管平滑肌细胞、视网膜色素上皮细胞和其它细胞的生长活性。而且，也可以应用非蛋白类物质如发酵产物、合成的化合物和合成的多肽。BTC蛋白可以来源于自然，或是通过基因工程技术生产的重组蛋白质。
自然来源的BTC蛋白质可以来源于任何一种动物，如人类、猴子、狒狒、黑猩猩、猪、牛、马、小鼠和大鼠，其中以人类或小鼠较好，尤以人类最佳。而且当本组合物用于增强胰腺功能，或促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或预防、治疗未分化型的胰腺癌时，接受该种治疗的物种最好与BTC蛋白的来源物种一致。当本发明用于人类时，最好也使用来源于人类的BTC蛋白。
BTC蛋白的实例应该是至少含有一个选自序列表中SEQ IDNo3，SEQ ID No4，SEQ ID No5或SEQ ID No6中所示的氨基酸序列的蛋白质。
来源于人类的BTC蛋白的实例应该是最好含有一个SEQ IDNo1(EP-A-0555785)所示的氨基酸序列的蛋白质，而来源于小鼠的BTC蛋白的实例则是最好含有一个SEQ ID No2所示的氨基酸序列的蛋白质。〔Shing等，Science，2591604(1993年)〕。
这些BTC蛋白可以是仅由氨基酸组成的简单蛋白质，也可以是复合蛋白质如糖蛋白、脂蛋白、血红素蛋白、金属离子蛋白、核黄素蛋白和磷蛋白。如果为糖蛋白，其中糖链的实例是中性糖如D-甘露糖、D-半乳糖和L-果糖，氨基糖如D-葡萄糖胺、D-半乳糖胺和唾液酸。
BTC蛋白突变产物的实例是从以上叙述的BTC蛋白中删除至少一个组成氨基酸的删除型突变蛋白、或者BTC蛋白中至少一个组成氨基酸被其它氨基酸替代的替代型突变蛋白，或者至少一个氨基酸加至BTC蛋白上的增加型突变蛋白。被删除、替代或增加的氨基酸的数目可以任意改变，只要BTC蛋白仍将保持其基本的生物学活性。
BTC蛋白的突变产物的实例是最好包含(i)一段从SEQID No1或者SEQ ID No2所示的氨基酸序列中删除大约1-40个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质；(ii)一段SEQ ID No1或者SEQ ID No2所示的氨基酸序列中大约1-40个氨基酸被替代的氨基酸序列的蛋白质；(iii)一段在SEQ ID No1或者SEQ IDNo2所示的氨基酸序列中增加大约1-40个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。而且BTC蛋白的突变产物最好含有至少一个下面部分的氨基酸序列1) His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile(SEQ ID NO3)，2) Gly Arg Cys Arg Phe Val Val (SEQ ID NO4)，3) Glu Gln Thr Pro Ser Cys (SEQ ID NO5)，and4) Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr (SEQ IDNO6).
在这些突变蛋白中，删除型突变蛋白是较好的，特别是包含了一段从SEQ ID No1或者SEQ ID No2所示的氨基酸序列N-端删除大约1-40个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质较好。特别指出的是，BTC蛋白的删除型突变蛋白的实例最好是来源于人类或鼠类的删除型突变蛋白，其中含有一段从SEQ ID No1或者SEQ ID No；2所示的氨基酸序列N-端删除大约12或30个氨基酸的氨基酸序列〔Watanabe等，《生物化学》(Journal ofBiochemistry)，2699966(1994年)〕。其中尤以从SEQID No1所示的氨基酸序列N-端删除12或30个氨基酸得到的人BTC蛋白的删除型突变蛋白最佳。
作为其它任何一种BTC蛋白的突变蛋白，只要保持了BTC蛋白的活性，任何一种突变蛋白质，例如通过BTC蛋白的N-端酰化作用、糖基化作用、化学修饰如聚乙二醇衍生物得到的突变蛋白都可以应用。
在组合物中用于增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或用于预防、治疗未分化型的胰腺癌的BTC蛋白及其突变产物当中，含有SEQ ID No1所示的氨基酸序列的人BTC蛋白、含有从SEQ ID No1所示的氨基酸序列N-端删除12或30个氨基酸的氨基酸序列的人的删除型突变蛋白；以及含有SEQ ID No2所示的氨基酸序列的鼠BTC蛋白均是已知的；其它BTC蛋白和突变产物则可通过已知方法或基于以上提到的方法改进后产生。
另外，BTC蛋白或其突变产物的C-端羧基也可以是一个酰胺(-CONH2)或酯。
本发明中的BTC蛋白及其突变产物中所含的盐最好包括可作药用的酸加成盐，例如与无机酸(盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等)所成的盐和与有机酸(乙酸、甲酸、丙炔酸、富马酸、顺式丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等)所成的盐。
可以通过已知的本质上与合成肽类相同的方法来合成BTC蛋白，或者通过一个合适的肽酶裂解(消化)本发明中的BTC蛋白或前体。合成肽类可以采用任何一种固相或液相合成的方法。这样，组成本发明的蛋白或其前体的一部分肽或氨基酸与其残断缩合以后，当产物中含有一个保护性的基团，除去所说的保护性基团后，所需的肽就合成了。下面文献(1)至(5)列出了已知的缩合和去除保护性基团的方法。(1)M.Bodanszky 和 M.A.Ondetti《肽的合成》，科学间出版社，纽约(1996年)(2)Schroeder和Luebke《肽》，学术出版社，纽约，1965年(3)Nobuo Izumiya《肽类合成的基础与实验》，日本(1975年)(4)Haruaki Yajima 和 Shumpei Sakakibara“SeikagakuJikken Koza 1”(《生物化学实验》第一部分)，“TanpakusituNo Kagaku IV”(《蛋白质的化学》第IV部分)，205页(1977年)，日本(5)Haruaki Yajima(编辑)《药学进展》(第二版)，14卷，《肽的合成》，Hirokawa Shoten，日本。
反应以后，常规纯化技术例如盐析、溶剂萃取、蒸馏、柱层析、液相层析、电泳、再结晶等任选几种以纯化和分离本发明的蛋白质或其前体。当通过以上方法得到一个游离化合物后，可以通过已知的方法将它转化为一种适宜的盐；得到的盐又可以通过已知的方法转化为一种游离化合物或其它的盐类化合物。
除了以上提到的BTC蛋白及其突变产物，本项发明中的组合物用于增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或预防、治疗未分化型的胰腺癌时，其中还可以含有苯丙酸诺龙(Activin)。
苯丙酸诺龙是一种已知的促进滤泡刺激素分泌的激素(Jikken Igaku，第10卷，15期，1992年)。苯丙酸诺龙分为苯丙酸诺龙A、苯丙酸诺龙B和苯丙酸诺龙AB，以苯丙酸诺龙A最佳。这些产品都已经商品化(澳大利亚生物公司)。
因为苯丙酸诺龙能够增强BTC蛋白的活性，虽然它本身并不具有这种活性。所以最好将它与BTC蛋白联合使用。而且，它配制在组合物中可以增强本发明的功效。但是，可以将它与BTC蛋白分开制备，使含有BTC蛋白的组合物与含有苯丙酸诺龙的组合物联合应用以增强BTC蛋白的活性。
本发明中的一段编码BTC蛋白或其突变产物的DNA在组合物中用于增强胰腺功能(下文中也称为具有增强功能的含DNA的组合物)，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化(下文中也称为具有促进作用的含DNA的组合物)，或者预防、治疗未分化型的胰腺癌(下文中也称为用于预防、治疗未分化型胰腺癌的含DNA的组合物)，其中包含的一段DNA编码了BTC蛋白或其突变产物。可以使用任何一段编码上述提到的BTC蛋白或其突变产物的DNA。
DNA可以是任何一种基因组DNA、基因组DNA文库、来源于组织或细胞的cDNA、来源于组织或细胞的cDNA文库或合成的DNA。用于文库的载体包括噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。进一步通过逆转录酶多聚酶链式反应(下文中简称为RT-PCR)技术，从组织细胞中提取的mRNA直接扩增出DNA。
编码SEQ ID No1所示的人BTC蛋白的DNA的实例，例如，是一段含有SEQ ID No7(EP-A-0555785)所示的核苷酸序列的DNA；而编码SEQ ID No2所示的鼠BTC蛋白的DNA的实例，则是一段包含SEQ ID No8所示的核苷酸序列的DNA。(Science，2591604，1993年)。
编码BTC蛋白或其突变产物的DNA通过下面的方法克隆(1)用一段合成的DNA引物进行PCR扩增，该引物含有编码BTC蛋白或其突变产物的DNA的部分核苷酸序列；(2)通过杂交技术用一段标记的DNA片段，或一段标记的编码部分或全部BTC蛋白或其突变产物的合成的DNA，筛选构建在合适载体上的DNA。杂交方法根据已公开的文献。如《分子克隆》，第二版，J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989年。如果使用的是商品化的DNA文库，则可以根据其中附带的实验手册完成杂交。需特别指出，根据EP-A-0482623，EP-A-0555785和Science，2591604(1993年)等的叙述和其类似方法，可以克隆得到编码BTC蛋白及其突变产物的DNA。
根据不同目的，已克隆的BTC蛋白及其突变产物可以被直接应用，或经过修饰，例如与限制酶消化反应或连接一个接头或连接子等以后再应用。DNA在5’端可以含有一个启动密码子ATG，在3’端含有终止密码子TAA、TGA或TAG等。这些启动和终止密码子可通过一个合适的合成的DNA接头进行连接。
BTC蛋白及其突变产物的表达载体通过下面方法合成，如(a)从编码BTC蛋白及其突变产物的DNA上切下一段目的DNA片段；(b)将目的DNA片段与合适表达载体中启动子的下游部位连接。具体地，BTC蛋白及其突变产物的表达载体可以根据EP-A-0482623，EP-A-0555785，Science，2591604(1993年)等的叙述以及类似的方法合成。
本发明中用于增强胰腺功能的组合组，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物，以及预防、治疗未分化型的胰腺癌的组合物，可以用药学上接受的载体(包括稀释剂和赋形剂)，通过已知的制药方法制备。
例如，本发明用于增强胰腺功能的注射用的水溶液通过常用的方法，如溶剂制备，例如水(蒸馏水)、水溶液(生理盐水、林格氏液)和油溶剂(芝麻油、橄榄油)。可以根据需要添加不同的添加剂，如辅助溶解剂(水杨酸钠、醋酸钠等)、缓冲液(糖、转化糖等)、稳定剂(人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(苄基醇、苯酚)和膨松剂(苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因)。
所说的用于注射用的水溶液调PH值大约为3-8，最好是5-7。为了把溶液调至上述范围的PH值，可以加入稀释盐酸和稀释碱(如氢氧化钠、碳酸氢钠等)。
本发明中的BTC蛋白在增强、促进或预防或治疗组合物中的含量一般占总重量的1％-95％，较好是占10％-80％，最好占总制剂重量的20％-70％。
本发明中苯丙酸诺龙在增强、促进或预防或治疗组合物中的含量一般占总重量的0％-90％，最好占总制剂重量的0％-80％。
BTC蛋白与苯丙酸诺龙的含量比率一般大约是1∶10-10∶1，较好是1∶5-5∶1，更好的是1∶2或2∶1。最佳比率大约是1∶2。
其它成分(载体等)占总制剂中的含量，在不抑制BTC蛋白活性的条件下可以适当选择。一般大约占重量的0.01％-90％，最好占总制剂重量的0.1％-80％。
在制造本发明的组合物的过程中，最好将人血清白蛋白(HSA)加至含有BTC蛋白的水溶液中，以调节PH值为3-8。这样可以抑制保藏过程中BTC蛋白活性的降低。
可以选用任何一种人血清白蛋白，最好在质量上能够满足临床肠道外给药途径的需要。例如，通过乙醇分馏的Cohn氏法6，从健康人中分馏纯化血浆制备HSA。还可以含有乙酰色氨酸钠或辛酸钠作为稳定剂。当制备为水溶液时，人血清白蛋白的浓度最好是0.1-50mg/ml，尤以0.5-20mg/ml为佳。
除了以上提到的人血清白蛋白，本发明中的组合物用于增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型的胰腺癌，其中还可以含有一种或更多的其它成分，包括氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸，单氨基脂肪族氨基酸和环氨基酸；单糖如葡萄糖和甘露糖；糖醇如山梨醇和甘露醇；以及生理上接受的盐或其衍生物。当组合物制备成水溶液时，最好含有10-100mg/ml的单糖或糖醇，和5-50mg/ml的氨基酸。
当添加酸性氨基酸如谷氨酸以调整本发明中组合物的制剂的溶液状态时，其中含有人血清白蛋白使PH值大约为5-7，还可以添加以上提到的一定量的物质成分以达到所需的液体状态。如果没有所需的酸性氨基酸，则可以使用无机酸如盐酸和磷酸，或缓冲液如琥珀酸、酒石酸和柠檬酸以达到所需pH。
由于本发明中的组合物用于增强胰腺功能时毒性很低，故针对胰腺功能障碍和低下，可以安全使用以增强胰腺的功能。特别是本发明中用于增强胰腺功能的组合物作为一种细胞分化的促进因子，具有促进胰腺β细胞分化的活性。换言之，即能够作用于未分化的胰腺干细胞，使之向胰腺β细胞分化。由此通过诱导分化产生的胰腺β细胞能够分泌和产生胰岛素。
本发明中用于增强胰腺功能的组合物还能够诱导未分化的胰腺干细胞向其它胰腺细胞分化，例如分泌胰腺肽(下文中也称为PP)的F细胞。而且该组合物在体内具有增加葡萄糖耐量的活性。因此，本发明中的组合物可作为糖尿病的预防剂和治疗剂，用于增强患者(即胰岛素依赖型糖尿病患者)的胰腺功能，改善患者胰腺功能障碍，以及与老年性胰岛素分泌减少有关的胰腺功能低下等。
本组合物还可以安全地用于促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，促进胰岛素的分泌等。
由于本发明中的组合物在预防、治疗未分化型的胰腺癌时毒性很低，故可以安全地用于预防和治疗未分化型的胰腺癌。
本发明中的组合物可以在人类或哺乳动物身上实施，如猴子、狒狒、黑猩猩、猪、牛、马以及小鼠和大鼠等。
给药方法可以是口服或非口服，后者更好。例如，可以采取静脉内或皮下注射途径给药。
组合物用于增强胰腺功能，或者促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化时，给药剂量根据接受治疗的物种、胰腺功能障碍的严重程度和其它的因素决定。通过注射途径给药时，作为成人BTC的日剂量所使用的本发明组合物一般为0.02ug-10mg/kg体重，最好是2ug-2mg/kg体重。
组合物用于预防和治疗未分化型的胰腺癌时，给药剂量根据接受治疗的物种、未分化型胰腺癌的严重程度决定。通过注射途径给药时，作为成人BTC的日剂量所使用的本发明组合物一般为0.02ug-10mg/kg体重，最好是2ug-2mg/kg体重，通过注射途径给药。
本发明中含有DNA的组合物用于增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型的胰腺癌，含DNA的组合物的制备方法与上面提到的制备含BTC蛋白及其突变产物的组合物的方法一样。所说的DNA可以是独立的，或被插入到一个合适的载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关的病毒载体中。
由于本发明中含DNA的组合物用于增强胰腺功能时毒性很低，故针对胰腺功能障碍和低下，可以安全使用以增强胰腺的功能。特别是本发明中用于增强胰腺功能的含有DNA的组合物作为一种细胞分化促进因子，具有促进胰腺β细胞分化的活性。换言之，本发明中用于增强胰腺功能的含有DNA的组合物能够作用于未分化的胰腺干细胞，使之向胰腺β细胞分化。由此诱导分化产生的胰腺β细胞能够分泌和产生胰岛素。含DNA的组合物还能诱导未分化的胰腺干细胞向其它胰腺细胞分化，如分泌胰腺肽的F细胞。而且该组合物在体内还具有增加葡萄糖耐量的活性。
因此，本发明中含DNA的组合物作为糖尿病的预防剂和治疗剂，用于增强患者(即胰岛素依赖型糖尿病患者)的胰腺功能，改善患者胰腺功能障碍，以及与老年性胰岛素分泌减少有关的胰腺功能低下等。
本发明中含DNA的组合物还可以安全地用于促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，促进胰岛素的分泌等。
由于本发明中含DNA的组合物在预防、治疗未分化型的胰腺癌时毒性很低，故可以安全地用于预防和治疗未分化型的胰腺癌。
本发明中含DNA的组合物可以在人类或哺乳动物身上实施，如猴子、狒狒、黑猩猩、猪、牛、马和鼠类等。
含DNA的组合物的给药方法可以是口服或非口服，后者更好。例如，可以采取静脉内或皮下注射途径给药。
本发明中含DNA的组合物用于增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型的胰腺癌时，给药剂量受到多种因素的影响，包括给药对象、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径和症状的严重程度。通常口服剂量每个成人(体重60公斤)每天大约为0.1-100mg，较好为1.0-50mg，最好为1.0-20mg。如果通过肠道外给药，则每次给药剂量根据给药对象、给药器官、症状、给药方法等而定。如果采用注射途径，一般较方便的是静脉内注射，剂量每个成人(体重60公斤)每天大约为0.01-30mg，较好为0.1-20mg，最好为0.1-10mg。如果是其它种类的动物，则剂量根据60公斤换算后给药。
本项发明中用于增强胰腺的功能的组合物，其中含有BTC蛋白。它能够作用于未分化的胰腺干细胞，促进它们分化为分泌胰岛素的胰腺β细胞。它还具有诱导未分化的胰腺干细胞向其它胰腺细胞分化的活性，如分泌胰腺肽的F细胞。因此，本发明中增强胰腺功能的组合物可以用于预防和治疗糖尿病(例如胰岛素依赖型糖尿病)，改善糖尿病患者胰腺功能障碍。它还能够预防和治疗未分化型的胰腺癌。
实施例本发明通过以下的实施例和实验实施例进一步详细叙述，但发明的范围不受此局限。实施例1制备含人BTC蛋白的注射剂2.5g人BTC蛋白质(SEQ ID No.1)溶解于1L蒸馏水中，加1.1g人血清白蛋白充分溶解，配制成终溶液。终溶液消毒过滤后，每个安瓿(容量5ml)分装4ml。通过冷冻干燥机干燥后，每个安瓿封口制成使用前溶解的安瓿。使用时，打开安瓿并将内容物溶于2ml的生理盐水，配制成用于皮下、静脉和肌肉内给药的注射剂。制备的这种注射剂可以用作增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型胰腺癌的组合物。实施例2制备含人BTC蛋白和苯丙酸诺龙A的注射剂2.5g人BTC蛋白质(SEQ ID No.1)和12.5g苯丙酸诺龙A溶解于1L蒸馏水中，加1.0g人血清白蛋白充分溶解，配制成终溶液。终溶液消毒过滤后，每个安瓿(容量5ml)分装4ml。通过冷冻干燥机干燥后，每个安瓿封口制成使用前溶解的安瓿。使用时，打开安瓿并将内容物溶于2ml的生理盐水，配制成用于皮下、静脉和肌肉内给药的注射剂。制备的这种注射剂可以用作增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型胰腺癌的组合物。实施例3制备含有编码人BTC蛋白的DNA的注射剂2.5g人BTC蛋白质(SEQ ID No.1)溶解于1L蒸馏水中，加1.1g人血清白蛋白充分溶解，配制成终溶液。终溶液消毒过滤后，每个安瓿(容量5ml)分装4ml。通过冷冻干燥机干燥后，每个安瓿封口制成使用前溶解的安瓿。使用时，打开安瓿并将内容物溶于2ml的生理盐水，配制成用于皮下、静脉或肌肉内给药的注射剂。制备的这种注射剂可以用作增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型胰腺癌的含有DNA的组合物。实施例4制备含人BTC蛋白的注射剂0.5g人BTC蛋白质(SEQ ID No.1)溶解于1L蒸馏水中，加2.0g人血清白蛋白充分溶解，配制成终溶液。终溶液消毒过滤后，每个安瓿(容量5ml)分装4ml。通过冷冻干燥机干燥后，每个安瓿封口制成使用前溶解的安瓿。使用时，打开安瓿并将内容物溶于2ml的生理盐水，配制成用于皮下、静脉或肌肉内给药的注射剂。制备的这种注射剂可以用作增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型胰腺癌的组合物。实施例5
制备含人BTC蛋白和苯丙酸诺龙A的注射剂2.5g人BTC蛋白质(SEQ ID No.1)和5.0g苯丙酸诺龙A溶解于1L蒸馏水中，加1.0g人血清白蛋白充分溶解，配制成终溶液。终溶液消毒过滤后，每个安瓿(容量5ml)分装4ml。通过冷冻干燥机干燥后，每个安瓿封口制成使用前溶解的安瓿。使用时，打开安瓿并将内容物溶于2ml的生理盐水，配制成用于皮下、静脉或肌肉内给药的注射剂。制备的这种注射剂可以用作增强胰腺功能，促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化，或者预防、治疗未分化型胰腺癌的组合物。实验实施例1BTC蛋白对分化为分泌胰岛素的β细胞和分泌胰腺肽的F细胞的影响将一种化学致癌物产生的胰腺癌细胞来源的AR42J细胞系(Christophe，《美国生理学杂志》，266G963，1994年)接种于有盖片的培养皿中，细胞密度为105个/ml，培养基是改良的Dulbecco氏Eagle MEM(Flow公司产品，美国)，里面含有20mM Hepes/NaOH(pH 7.4)，5mM NaHCO3，10％小牛血清和不同浓度的人BTC蛋白(SEQ ID No.1)，置于37℃的CO2孵箱中(5％的CO2，95％的空气)。培养5天后，细胞用3％的多聚甲醛固定，0.1％的Triton-100处理5分钟，先与“阻断王牌”(Blocking Ace)(Morinaga牛奶公司产品，日本)一起孵育后，再与一抗(抗胰岛素抗体或抗胰腺肽抗体)和二抗(吲哚碳花青结合的猴抗兔IgG或吲哚碳花青结合的猴抗豚鼠IgG)孵育。然后用Carl Zeiss公司(纽约，美国)生产的Axiophoto显微镜检查细胞。结果如图1所示○示荧光染色的细胞数目，即分化为分泌胰岛素的β细胞的数目，随着BTC蛋白浓度的升高而增加。BTC蛋白浓度为2×10-19M时，最多大约有4％的细胞分化为分泌胰岛素的β细胞。同时也发现大约有5％的细胞分化为分泌胰腺肽的F细胞。
应用RT-PCR技术对mRNA的分析也得出同样的结果。需特别指出，在BTC蛋白存在的条件下，AR42J细胞进行分化，合成了胰岛素、胰腺肽、糖激酶和葡萄糖转运体2的mRNA，但是未检测到胰高血糖素的mRNA。实验实施例2不同因子对分化为分泌胰岛素的β细胞的影响。
应用实验实施例1同样的方法，可以研究不同因子对分化为分泌胰岛素的β细胞的影响。如图2的结果所示，1×10-19M浓度的表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGF-α)，纤维母细胞生长因子(FGF)、胰岛素样的生长因子(IGF)、胃泌素、缩胆囊素、转化生长因子-β(TGF-β)和苯丙酸诺龙A都不能诱导AR42J细胞分化为分泌胰岛素的β细胞，但是1×10-9M浓度的人β细胞素蛋白可以诱导2.5％的AR42J细胞分化为分泌胰岛素的β细胞。如图2所示，在2×10-9M浓度的苯丙酸诺龙A分别与1×10-9M浓度的表皮生长因子、转化生长因子-α混合的条件下，AR42J细胞不能分化为分泌胰岛素的β细胞。但是，在2×10-9M浓度的苯丙酸诺龙A与1×10-9M浓度的人BTC蛋白混合时，10％的AR42J细胞分化为分泌胰岛素的β细胞。这个结果说明苯丙酸诺龙A增强了BTC蛋白诱导分化的能力。实验实施例3一种已经分化为分泌胰岛素的β细胞AR42J细胞胰岛素的分泌应用实验实施例1同样的方法，将AR42J细胞接种于直径为6cm的培养皿中，细胞密度1×105个/ml，在2×10-9M浓度的苯丙酸诺龙A与1×10-9M浓度的人BTC蛋白(SEQID No.1)条件下培养5天。然后用DMEM冲洗，在分别含有40mM的K+离子或者10uM的甲苯磺丁脲，和5.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐的缓冲液中孵育60分钟。收集培养的上清，用TR-IFMA(时间分辨的免疫荧光分析系统)方法分析其中的胰岛素浓度(Lovgren等，《改良免疫分析》，W.P.Collins编辑，John Whiley & Sons有限公司，203页，1985年)。结果如图3所示，说明已经分化的AR42J细胞在培养上清中分泌了大量的胰岛素，而且高浓度的K+离子或甲苯磺丁脲能够促进这种分泌功能。实验实施例4BTC蛋白增强糖尿病小鼠的葡萄糖耐量8周龄的成年ICR小鼠用四氧嘧啶进行部分胰腺融合得到了小鼠的糖尿病模型。(给药剂量是100mg/公斤体重；当结扎肠系膜上静脉后，通过静脉给予四氧嘧啶以选择性破坏胰尾的胰腺β细胞，而保护了胰头的细胞)。〔《糖尿病前沿》(DiabetesFrontier)，7285-286，1966年。《IBID》，7287-288，1966年〕。在四氧嘧啶处理1天以后连续8周时间，这种糖尿病小鼠按照每天1mg/公斤体重的剂量，皮下给予人BTC蛋白(SEQ ID No.1)。在四氧嘧啶处理之前，以及处理之后2周、4周和8周时，进行腹膜内葡萄糖耐量实验(ipGTT)(2克葡萄糖/公斤体重)以测定未给葡萄糖负荷之前，以及给予葡萄糖负荷1小时、2小时后的血糖水平，并且周期测定小鼠的体重变化。结果表明，四氧嘧啶处理之前(图4)和处理4周(图5)后进行的腹膜内葡萄糖耐量实验(ipGTT)，BTC蛋白治疗组和非治疗组无显著性的差异。然而图6却表明，四氧嘧啶处理后8周进行的腹膜内葡萄糖耐量实验(ipGTT)，BTC蛋白治疗组(▲)在给予葡萄糖负荷1小时后血糖水平显著地下降，而BTC蛋白非治疗组无这种变化(●)。图4-6的结果说明人BTC蛋白具有增强葡萄糖耐量的活性。治疗组和非治疗组的小鼠体重无显著性的差异。实验实施例5BTC蛋白对胰腺癌细胞抑制生长的活性大约3×103的AR42J细胞的第71号细胞系接种于直径3cm的Falcon-sharle培养皿中(Bectondickinson公司产品，美国)，培养基是改良的Dulbecco氏Eagle MEM，里面含有2nM的人BTC蛋白(SEQ ID No.1)和1％小牛血清，置于37℃的5％CO2孵箱中培养，通过犁刀计数仪计算出细胞周期性增加的数目。同时，计算出不合有人BTC蛋白的条件下培养的细胞周期性增加的数目作为对照。结果如图5所示。图7的结果说明，在含有人BTC蛋白的培养基中的第71细胞系与不含人BTC蛋白的培养基中的细胞相比，细胞生长明显受到了抑制。
序列表有关SEQ ID No1的资料(i)序列特征(A)长度80(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线状(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID No1Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys20 25 30Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Glu Thr Pro Ser Cys Val Cys50 55 60Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr65 70 75 80有关SEQ ID No2的资料(i)序列特征(A)长度80(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线状(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID No2Asp Gly Asn Thr Thr Arg Thr Pro Glu Thr Asn Gly Ser Leu Cys Gly1 5 10 15Ala Pro Gly Glu Asn Cys Thr Gly Thr Thr Pro Arg Gln Lys Val Lys20 25 30Thr His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ilo His35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Asp Glu Gln Thr Pro Ser Cys Ile Cys50 55 60Glu Lys Gly Tyr Phe Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr65 70 75 80有关SEQ ID No3的资料(i)序列特征(A)长度14(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线状(ii)分子类型肽类(iii)序列描述SEQ ID No3His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile1 5 10有关SEQ ID No4的资料(i)序列特征(A)长度7(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线状(ii)分子类型肽类(iii)序列描述SEQ ID No4Gly Arg Cys Arg Phe Val Val1 5有关SEQ ID No5的资料(i)序列特征(A)长度6(B)类型氨基酸
(C)拓扑结构线状(ii)分子类型肽类(iii)序列描述SEQ ID No5Glu Gln Thr Pro Ser Cys1 5SEQ ID No6的资料(i)序列特征(A)长度11(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线状(ii)分子类型肽类(iii)序列描述SEQ ID No6Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr1 5 10有关SEQ ID No7的资料(i)序列特征(A)长度240(B)类型核苷酸(C)链式双链(D)拓扑结构线状(ii)分子类型cDNA(ix)特点(C)识别方法S(xi)序列描述SEQ ID No7GATGGGAATT CCACCAGAAG TCCTGAAACT AATGGCCTCC TCTGTGGAGA CCCTGAGGAA60AACTGTGCAG CTACCACCAC ACAATCAAAG CGGAAAGGCC ACTTCTCTAG GTGCCCCAAG 120CAATACAAGC ATTACTGCAT CAAAGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGCCGA GCAGACGCCC 180TCCTGTGTCT GTGATGAAGG CTACATTGGA GCAAGGTGTG AGAGAGTTGA CTTGTTTTAC 240有关SEQ ID No8的资料(i)序列特征(A)长度240(B)类型核苷酸(C)链式双链(D)拓扑结构线状(ii)分子类型cDNA(ix)特点(C)识别方法S(xi)序列描述SEQ ID No8GATGGGAACA CAACCAGAAC ACCAGAAACC AATGGCTCTC TTTGTGGAGC TCCTGGGGAA60AACTGCACAG GTACCACCCC TAGACAGAAA GTGAAAACCC ACTTCTCTCG GTGCCCCAAG 120CAGTACAAGC ATTACTGCAT CCATGGGAGA TGCCGCTTCG TGGTGGACGA GCAAACTCCC 180TCCTGCATCT GTGAGAAAGG CTACTTTGGG GCTCGGTGTG AGCGAGTGGA CCTGTTTTAC 240
权利要求
1一种增强胰腺功能的组合物，该组合物中包含了一种β细胞素蛋白(betacellulin)或其突变产物。
2根据权利要求1的组合物，其中的β细胞素蛋白是一种含有至少一个选自序列表中SEQ ID No3，SEQ ID No4，SEQID No5和SEQ ID No6所示的氨基酸序列的蛋白质。
3根据权利要求1的组合物，其中的β细胞素蛋白是一种含有SEQ ID No1或者SEQ ID No2所示的氨基酸序列的蛋白质。
4根据权利要求1的组合物，其中的β细胞素蛋白的突变蛋白是一种含有(i)一段从SEQ ID No1或SEQ ID No2所示的氨基酸序列中删除大约1-40个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质；(ii)一段SEQ ID No1或SEQ ID No2所示的氨基酸序列中大约1-40个氨基酸被其它氨基酸替代的氨基酸序列的蛋白质；或(iii)一段在SEQ ID No1或SEQ ID No2所示的氨基酸序列中增加大约1-40个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。
5根据权利要求1的组合物，其中的β细胞素蛋白的突变产物是一种含有一段从SEQ ID No1所示的氨基酸序列N-端删除12或30个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。
6根据权利要求1至5的组合物，进一步还含有苯丙酸诺龙(activin)。
7根据权利要求6的组合物，其中的苯丙酸诺龙与β细胞素蛋白或其突变产物的含量比率大约是1∶10至10∶1。
8根据权利要求1至7的组合物，用于预防和治疗糖尿病。
9根据权利要求1至7的组合物，用于预防和治疗糖尿病患者的胰腺功能障碍或与老年性胰岛素分泌减少相关的胰腺功能低下。
10一种促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物，其中包含了一种β细胞素蛋白或其突变产物。
11一种预防和治疗未分化型胰腺癌的组合物，其中包含了一种β细胞素蛋白或其突变产物。
12一种增强人类或哺乳类动物胰腺功能的方法，其中包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物。
13一种促进人类或哺乳类动物胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的方法，其中包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物。
14一种预防和治疗人类或哺乳类动物未分化型胰腺癌的方法，其中包括给予人类或哺乳类动物有效剂量的β细胞素蛋白或其突变产物。
15β细胞素蛋白或其突变产物在制备一种增强胰腺功能的组合物中的应用。
16β细胞素蛋白或其突变产物在制备一种促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化的组合物中的应用。
17β细胞素蛋白或其突变产物在制备一种预防和治疗胰腺癌的组合物中的应用。
全文摘要
本项发明提供了一种极好的增强胰腺功能的组合物,这种组合物可以促进未分化的胰腺干细胞向胰腺β细胞分化,或者预防和治疗未分化的胰腺癌。该组合物中包含了一种β细胞素蛋白(betacellulin)或其突变产物。本项发明中的组合物能够作用于未分化的胰腺干细胞,促进它们分化为分泌胰岛素的胰腺β细胞。它还能诱导未分化的胰腺干细胞向其它胰腺细胞分化,如分泌胰腺肽的F细胞。因此,本项发明中的组合物能够减轻和治疗糖尿病(例如胰岛素依赖型糖尿病),改善糖尿病患者胰腺功能障碍,增强胰腺的功能。而且,组合物还能够用于预防和治疗未分化型的胰腺癌。
文档编号A61K38/22GK1202112SQ9619818
公开日1998年12月16日 申请日期1996年11月8日 优先权日1995年11月9日
发明者小岛至 申请人:武田药品工业株式会社