Pedinophyllol B在制备血管保护性药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物PedinophyllolB的新用途，具体涉及PedinophyllolB在制 备神经保护药物中的应用。
【背景技术】
[0002] NaLiu等人首次分离纯化出化合物PedinophyllolB，并将成果发表在著名天 然产物杂志JournalofNaturalProduct上（HighlyOxygenatedent-Pimarane-Type DiterpenoidsfromtheChineseLiverwortPedinophylluminterruptumand TheirAllelopathicActivities，J.Nat.Prod.，2013, 76,1647-1653)。
[0003]目前尚未有该化合物的活性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种PedinophyllolB的医药用途。
[0005] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006] PedinophyllolB在制备血管保护性药物中的应用，所述PedinophyllolB化学结 构式如下，
【具体实施方式】
[0008] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
[0009] 实施例I:PedinophyllolB的分离制备及结构确证
[0010]PedinophyllolB的制备方法同文献报道的制备方法（HighlyOxygenated ent-Pimarane-TypeDiterpenoidsfromtheChineseLiverwortPedinophyllum interruptumandTheirAllelopathicActivities?J.Nat.Prod. ?2013?76?1647-1653) 〇 [0011] 结构确证：分子式为C2C)H2803,不饱和度为7c3核磁共振氢谱数据5H(ppm，DMS〇-d6， 500MHz) :H-2 (2. 82,dt，J= 4. 9,13. 3)，H-2 (2. 23,m)，H-3 (1. 79-1. 83,m)，H-5 (2. 39,dd， J= 3. 8,12.6)，H-6 (2.28,m)，H-7 (6.80,d，J= 4.8)，H-Il(1.96,dt，J= 17. 9, 2. 5)， 36，m)，H-12(1. 73，m)，H-12(2. 24，m)，H-15(5. 70，dd，J= 10. 7,17. 6)，H-16(5. 07， d，J= 10. 7)，H-16 (4. 83,d，J= 17. 6)，H-17 (I. 23,s)，H-18 (I. 02,s)，H-19 (I. 19,s)， H-20(1.19,s);核磁共振碳谱数据Sc(ppm，DMS0-d6，150Hz) :218.5(C，1-C)，37.1(CH2， 2-C)，41. 5 (CH2, 3-C)，32. 7 (C，4-C)，44. 2 (CH，5-C)，24. 6 (CH2, 6-C)，137. 8 (CH，7-C)， 138. 4 (C，8-C)，76. 8 (C，9-C)，54.I(C，10-C)，26. 8 (CH2,11-C)，31.I(CH2,12-C)，50. 8 (C， 13-C)，203.I(C，14-C)，142. 5 (CH，15-C)，115.I(CH2,16-C)，24. 8 (CH3, 17-C)，32. 0 (CH3， 18-C)，22. 4 (CH3,19-C)，15. 4 (CH3, 20-C)。结构确证数据与文献报道一致，因此可以确定本 发明制备的化合物即为文献报道的PedinophyllolB。
[0012] 实施例2:PedinophyllolB的药理作用试验
[0013] -、材料和仪器
[0014] 血管内皮细胞（ECV-304)由山东大学医学院免疫教研室馈赠。PedinophyllolB 自制，HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640干粉培养基、胰蛋白酶购于美国Gibeo公司。 胎牛血清购于天津TBD公司。MTT、琼脂糖、AilllexinV-FITC购于美国Sigma公司。LDH、 MDA、SOD、GSH-Px测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。DMSO购于中国医药（集团） 上海化学试剂有限公司。苏木素购于福州迈新生物技术有限公司。Rhodaminel23购于美国 Solarbic公司。阳性药川考嗪购自上海源叶生物科技有限公司。
[0015] 倒置光学显微镜（日本OlymPus公司），二氧化碳培养箱（美国FormaScientific 公司），电子分析天平（ER-182A型）（日本A&D公司），超净工作台（2HJH-1209型）（上 海智城分析仪器制造有限公司），流式细胞仪（FACSVantage型）（美国BeetonDiehnson 公司），恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂），2420Viet〇r3多标记分析仪（美国Perki 此ImerLifeseienee公司），721型可见紫外光栅分光光度计（上海精密科学有限公司）， 电热恒温水浴箱（上海医疗仪器三厂生产），酶联免疫检测仪（MK3Multiskan)(上海 ThLabsystem仪器公司）。
[0016] 二、试验方法
[0017] 1、细胞培养
[0018]ECV-304细胞以RPMI-1640培养基于37°C，5%CO2培养箱中传代培养。镜下观察， 待细胞汇合率达到70%以上时用胰蛋白酶消化传代，以生长稳定的第3-5代细胞制备细胞 悬液。
[0019] 2、细胞分组及处理
[0020] 取生长良好的ECV-304细胞制成细胞悬液，接种于96孔、24孔、6孔细胞培养板 或培养皿中，37°C，5%CO2培养24h。随机分为六组：①正常组；②H2O2模型组（150ymol/ L);③川考嘆（TMP) (50ymol/L)+H202组；④PedinophyllolB(10iimol/L)+H202组； ⑤PedinophyllolB(50ymol/L)+H2O2组；⑥PedinophyllolB(100ymol/L)+H2O2组。
[0021] 3、实验项目及检测指标
[0022] 3.IMTT法检测细胞活力
[0023] 将生长良好的ECV-304细胞制备成5XIO4AiL的细胞悬液，按每孔100yL接种 于96孔板，置37°C，5%CO2孵育24h。细胞分组及处理上。继续培养6h和12h后，每孔加 入10yLMTT溶液（终浓度0? 5mg/L)置37°C，5%CO2培养箱孵育4h后，每孔加入100yL DMSO,静置IOmin后振荡60s，30min内置酶联免疫检测仪上检测570nm处吸光度值（OD5J。
[0024] 按公式：细胞损伤抑制率=(用药组0D57。-模型组OD5J八正常组0D57。-模型组 OD5JX100%，计算细胞损伤抑制率。
[0025] 3.2LDR释放率测定
[0026] 取生长良好的ECV-304细胞制成IXIO5AiL的细胞悬液接种于24孔板，置37°C， 5%C0J?育24h。细胞分组及处理同上。继续培养6h和12h，收集培养上清液。PBS洗涤2 次后，每孔加入 〇.5mL细胞裂解液（150mmol/LNaCl，150mmol/LTris-HCI，lmmol/LEDTA， 1%TritonX-100)，于4°C静置15min后振荡数分钟，10000rpm，4°C离心IOmin收集细胞裂 解液，参照LDH试剂盒说明书分别测定上清液和细胞裂解液中的LDH活性。
[0027] 按公式：LDH释放率=上清液中LDH活性八上清液中LDH活性+细胞裂解液中LDH 活性）'X100 %，计算LDH释放率。
[0028] 3. 3酶生化法测定MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力
[0029] 取生长良好的ECV-304细胞制成IXIO5AiL的细胞悬液接种于24孔板，置37°C， 5%〇)2孵育2411。细胞分组及处理同上。继续培养1211，收集培养上清液。按10^、3(?、 GSH-Px检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。
[0030] 4、数据处理
[0031] MicrosoftExcel自带的统计软件进行处理，实验数据以无±8.表示，组间差异用t 检验。
[0032] 三、结果及结论
[0033] 1、PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞生存率的影响
[0034] 正常活细胞线粒体能量代谢过程中产生琥珀酸脱氢酶，可将淡黄色MTT还原成不 溶于水的蓝紫色的甲腊结晶，结晶数量与活细胞数成正比。本实验结果显示：ECV-304细 胞经H2O2 (150ymol/L)氧化损伤6h和12h后，细胞OD值明显降低且与正常组比具有统计 意义（P〈0. 01)，表明细胞活力下降。而PedinophyllolB对细胞具有保护作用，能显著抑 制H2O2对细胞的氧化损伤，提高存活率。作用6h，50、100ymol/LPedinophyllolB对细胞 损伤抑制率分别为16.67%(?〈0.05)和28.21%(?〈0.01)。作用1211，10、50、100 11111〇1/ 1^6虹11(^1^11〇18对细胞损伤抑制率提高为 24.85 %(?〈0.05)，29.64 %(?〈0.01)和 38. 47% (P〈0. 01)。见表I(**P〈0.OlvsNormal;#P〈0. 05, #P〈0.OlvsH202group;AP〈0. 05， ▲▲P〈0.OlvsTMPgroup，下同）〇
[0035] 2、PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304 细胞LDH释放率的影响
[0036] 乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2, 4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸 二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色测定反应产物可间接求出乳酸脱氢酶活力。 实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞LDH释放率显著增高（P〈0. 01)。与模 型组比，PedinophyllolB各组细胞LDH释放率均减少：10、50、100iimol/LPedinophyllol 8作用611，细胞的0)11释放率降为 20.54%(?〈0.01)和21.22%(?〈0.01);50、10(^111〇1/ LPedinophyllolB作用 12h，细胞的LDH释放率降为 33. 64 % (P〈0. 01)和 29. 53 % (P〈0. 01)。PedinophyllolB随浓度的增加，对氧化损伤ECV-304细胞的保护作用也逐渐增 强，呈现出一定的量效关系。结果见表2。
[0037] 3、PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304 细胞MDA含量、S0D、GSH-Px活力的影响
[0038] 实验结果表明：与正常组比模型组ECV-304细胞培养液中MDA含量显著增 高（P〈0.01)。与模型组相比，10、50、100ymol/LPedinophyllolB组细胞MDA生成量 均明显减少，分别为3.00±0.79nmol/ml(P〈0.05)，2.86±0.75nmol/ml(P〈0.05)和 2. 69±0. 45nmol/ml(P〈0. 01)。PedinophyllolB各浓度组组间对照显示，随浓度的增加， PedinophyllolB对ECV-304细胞脂质过氧化损伤的保护作用也逐渐增强，呈现一定的量 效关系。结果见表3。
[0039] 实验结果表明：与正常组比，模型组ECV-304细胞SOD活性显著降低（P〈0. 01)。与 模型组相比，50、100ymol/LPedinophyllolB均可增强ECV-304细胞的SOD活性，SOD活性 分别提高为 17. 9±1. 34U/ml(P〈0. 05)和 19. 25±0. 81U/ml(P〈0. 01)。且随浓度的增加，细 胞的SOD活性也逐渐提高，表明PedinophyllolB可增强ECV-304细胞的抗氧自由作用，具 一定量效关系；lOymol/LPedinophyllolB虽也可提高SOD活性，但不具有显著统计意义。 见表3。
[0040] 实验结果表明：与正常组相比，模型组ECV-304细胞培养液中GSH-Px活性显著降 低（P〈0.01)。与模型组相比，10、50、100ymol/LPedinophyllolB组细胞GSH-Px活性均 显著提高，分别为73. 8±10. 3U/mL(P〈0. 05)，92. 2±8. 5U/mL(P〈0. 01)和102. 5±10. 3U/ mL(P〈0. 01)。且随PedinophyllolB浓度的增加，ECV-304细胞的GSH-Px活性也逐渐提高， 表明细胞抗氧化作用的能力也逐渐增强，呈现一定的量效关系。结果见表3。
[0041]总结，本实验采用H2O2作为外源性自由基生成系统，能够诱导血管内皮细胞 (ECV-304))氧化应激损伤，促进细胞凋亡。通过MTT法和LDH活性检测证实Pedinophyllol B对H2O2氧化损伤细胞具有保护作用；通过细胞上清液MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性的 测定，证实PedinophyllolB有清除自由基和活性氧的抗氧化特性。
[0042]表IPedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304细胞生存率的影响（：??,n= 8)
[0043]
[0044]表 2PedinophyllolB对H2O2损伤ECV-304 细胞LDH释放率的影响（5c±s,n= 8)
[0045]
【主权项】
l.PedinophyllolB在制备血管保护性药物中的应用，所述PedinophyllolB化学结构 式如下，
【专利摘要】本发明公开了Pedinophyllol？B在制备血管保护性药物中的应用，属于药物领域。通过MTT法和LDH活性检测证实Pedinophyllol？B对H2O2氧化损伤ECV-304细胞具有保护作用；通过细胞上清液MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性的测定，证实Pedinophyllol？B有清除自由基和活性氧的抗氧化特性，可以进一步研究开发成制备血管保护性药物。
【IPC分类】A61K31/122, A61P39/06, A61P9/14
【公开号】CN105078945
【申请号】CN201510558223
【发明人】林天样
【申请人】林天样
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月5日