一种天然组织来源的肌腱联合骨脱细胞材料的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种天然组织来源的肌腱联合骨脱细胞材料的制备方法，本发明将哺乳动物任意大小的跟腱联合骨组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水、含蛋白酶抑制剂的PBS、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得肌腱联合骨脱细胞材料。本发明能同时对肌腱联合骨组织上的肌腱细胞和骨细胞以及交界面上的软骨细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定，所得肌腱联合骨材料具有生物相容性好、可塑性强、生物力学强度高等优点，可用于修复临床上各类病因造成的肌腱退行性疾病，肌腱严重撕裂和肌腱联合骨再生、修复障碍。
【专利说明】
一种天然组织来源的肌腱联合骨脱细胞材料的制备方法
技术领域
[0001]本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源的肌腱联合骨材料的制备方法。
【背景技术】
[0002]肌腱撕裂是一种常见病，常在高强度的运动中发生。患者多为年轻人，以运动员中尤为常见。其会造成肌腱损伤，从而造成运动能力下降，严重的甚至会造成运动功能丧失，对生活带来极大不便。而骨和肌腱间的撕裂则更为严重。现有的手术治疗对于此类撕裂尚无有效的方案，常规缝合后自然机体修复往往发生肌腱和骨之间的纤维软骨层退化，取之以力学性能较差的瘢痕组织。术后再断的几率高，患者的正常活动受到较大限制。
[0003]再生医学和组织工程技术的出现给了肌腱和骨间撕裂的治疗带来了新的希望。然而由于肌腱和腱之间的结构复杂，用传统的生物材料模拟难度高，且存在生物相容性差的问题。
[0004]细胞外基质(ECM)含有正常组织或器官细胞所需的各种生化因子，并且具有天然宏观及超微三维的立体结构。ECM可调节生物物理刺激、生物化学及分子信号等一系列组织或器官发育及修复所需的各种因素，从而实现组织或器官的恢复和再生。因此ECM作为一个新型的天然生物材料正被广泛的运用于心脏瓣膜、气管、肌肉、肌腱、软骨等一系列组织或器官的修复及再生。而目前针对肌腱联合骨的脱细胞材料均处于研究的起步阶段，现有报道中制备肌腱联合骨材料的方法，细胞去除不彻底，材料免疫反应较严重，且对ECM的破坏大，材料力学性能均不理想。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种新型的肌腱连骨脱细胞材料的制备方法，以弥补现有文献中方法的不足，可用以制备异体细胞等免疫原性物质去除完全，结构完整，生物活性成分和力学性能保存完好的肌腱联合骨细胞外基质。
[0006]含蛋白酶抑制剂的生理盐水，其中蛋白酶抑制剂浓度为10-50KIU/ml;
[0007]含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，其中蛋白酶抑制剂浓度为10_50KIU/ml;
[0008]含TritonX的PBS缓冲液，体积浓度为I%_12%的Triton X-200或TritonX-100的PBS缓冲液;
[0009]含SDS的PBS缓冲液，体积浓度为0.5%_8%的SDS的PBS缓冲液；
[0010]含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.5_2mg/ml ；
[0011]混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为20KIU/ml、20KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为I: I。加入的混合抗菌液与原溶液体积比为I: I。
[0012]上述天然组织来源的肌联合骨材料的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)取宰杀12h以内任意哺乳动物的跟腱连跟骨，用剪刀除去跟腱上的脂肪，用含蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，去除血液，贴附的脂肪碎片和其他杂质。
[0014](2)在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，低温摇床150rpm震荡24-48小时，温度为4°C；
[0015](3)在含Triton X的I3BS缓冲液中，加入混合抗菌液，低温摇床150rpm震荡24_48小时，温度为4 °C;
[0016](4)在含SDS的PBS缓冲液中，低温摇床150rpm震荡24_72小时，温度为4°C ；
[0017](5)在含Triton X-100的I3BS缓冲液中，加入混合抗菌液，低温摇床150rpm震荡7_16天，温度为4°C ； (6)在含SDS的PBS缓冲液中，低温摇床150rpm震荡2_20天，温度为4°C ；
[0018](7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，浓度分别为201(11]/1111，37°(:摇床150印111震荡12小时；
[0019]步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
[0020]上述制备方法得到的天然组织来源的肌腱联合骨脱细胞材料。
[0021]针对目前用于肌腱联合骨修复和再生的材料及其制备方法存在的问题，发明人建立了一种天然组织来源的肌腱联合骨脱细胞材料的制备方法，该法将哺乳动物任意大小的跟腱联合骨组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水、含蛋白酶抑制剂的I3BS、含Triton X的I3BS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得肌腱联合骨脱细胞材料。本发明能同时对肌腱联合骨组织上的肌腱细胞和骨细胞以及交界面上的软骨细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定，所得肌腱联合骨材料具有生物相容性好、可塑性强、生物力学强度高等优点，可用于修复临床上各类病因造成的肌腱退行性疾病，肌腱严重撕裂和肌腱联合骨再生、修复障碍。
[0022]相对于现有技术，本发明的显著进步在于:
[0023](I)本发明所采用的肌腱连骨材料是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性；
[0024](2)采用脱细胞技术获得的肌腱连骨不含细胞等抗原物质，可使受体的免疫排斥反应降到最低限度，同时可不含细菌病毒等有害成分生物安全性高；
[0025](3)本新型脱细胞技术在去除异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常肌腱连骨成分和结构；
[0026](4)本发明材料可以根据病人的肌腱、骨形态大小定制相应的脱细胞肌腱连骨材料，可以直接用来替换人断裂的肌腱。
【附图说明】
[0027]图1是本发明的肌腱连骨脱细胞材料的大体外观图；
[0028]图2是肌腱连骨处HE染色组织切片图显示无细胞及无细胞核成分残留；
[0029]图3是肌腱HE染色组织切片图显示无细胞及无细胞核成分残留；
[0030]图4是骨HE染色组织切片图显示无细胞及无细胞核成分残留；
[0031 ]图5是肌腱的DNA检测数据显示材料无DNA残留；
[0032]图6是骨的DNA检测数据显示材料无DNA残留；
[0033]图7是肌腱连骨的极限抗张强度(UTS)，显示材料力学强度较好；
[0034]图8是肌腱连骨的杨氏模量(EM)，显示材料力学强度较好；
[0035]图9是肌腱连骨的最大伸长率(E)，显示材料延伸性较好。
具体实施方案
[0036]下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0037]实施例1脱细胞肌腱联合骨材料的制备和研究
[0038]1、制备肌腱连骨脱细胞基质
[0039](I)取材:取成熟家猪的跟腱连骨，机械剪除跟腱上附着的脂肪，然后把跟腱剪裁成20mm(长)X5mm(宽)X3mm(厚)，跟骨大小为3mm(厚)X7mm(直径)
[0040](2)在含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的生理盐水中漂洗3次，每次20min;
[0041 ] (3)在含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的I3BS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡24小时；
[0042](4)在浓度为4%的含Triton X-100的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素混合抗菌液，浓度为20KIU/ml，低温(4°C)摇床150rpm震荡24小时；
[0043](5)在浓度为0.5%的含SDS的PBS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡24小时；
[0044](6)在浓度为6%的含Triton X_100的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4°C)摇床150rpm震荡7天；
[0045](7)在浓度为2%的含SDS的PBS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡2天；
[0046](8)在浓度为0.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，37°C摇床150rpm震荡12小时，即可得到脱细胞的肌腱连骨材料(图1);
[0047]注:完成每一步骤后均用生理盐水冲洗5小时。
[0048](3)肌腱连骨脱细胞支架的组织学评价
[0049]图2、图3、图4分别是本发明肌腱连骨脱细胞支架肌腱连骨部分，肌腱部分，骨部分HE染色放大400倍无细胞及无细胞核成分残留图
[0050](4)肌腱连骨脱细胞支架的抗原成分定量检测
[0051]图5和图6分别是本发明肌腱连骨脱细胞支架肌腱部分和骨部分DNA定量检测几乎不含有DNA成分图。
[0052](5)肌腱连骨脱细胞支架的力学性能测验
[0053]图7，图8，图9分别是肌腱连骨脱细胞支架力学性能三个重要衡量指标极限抗张强度(UTS)，杨氏模量(EM)，最大伸长率(E)测验结果，显示和未脱细胞之前没有明显力学差
B升。
[0054]实施例2脱细胞肌腱联合骨材料的制备和研究
[0055](I)取材:取成熟家猪的跟腱连骨，机械剪除跟腱上附着的脂肪，然后把跟腱剪裁成40mm (长)X2Omm (宽)Χδπιπι (厚)，跟骨大小为5mm (厚)X2 5mm (直径)
[0056](2)在含30KIU/ml蛋白酶抑制剂的生理盐水中漂洗3次，每次20min;
[0057](3)在含30KIU/ml蛋白酶抑制剂的I3BS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡48小时；
[0058](4)在浓度为8%的含Triton X_100的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4°C)摇床150rpm震荡30小时；
[0059](5)在浓度为8 %的含SDS的PBS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡36小时；
[0060](6)在浓度为12%的含Triton X-100的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4°C)摇床150rpm震荡16天；
[0061 ] (7)在浓度为6%的含SDS的PBS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡20天；
[0062](8)在浓度为lmg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素混合抗菌液，浓度为20KIU/ml ,37 °C摇床150rpm震荡12小时
[0063]其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞肌腱联合骨材料。
[0064]实施例3脱细胞肌腱联合骨材料的制备和研究
[0065](I)取材:取成熟家猪的跟腱连骨，机械剪除跟腱上附着的脂肪，然后把跟腱剪裁成40mm(长)X2Omm(宽)X3Iiim(厚)，跟骨大小为4mm(厚)Xl5mm(直径)
[0066](2)在含50KIU/ml蛋白酶抑制剂的生理盐水中漂洗3次，每次20min;
[0067](3)在含50KIU/ml蛋白酶抑制剂的I3BS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡36小时；
[0068](4)在浓度为4%的含Triton X_100的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4°C)摇床150rpm震荡48小时；
[0069](5)在浓度为0.5%的含SDS的PBS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡72小时；
[0070](6)在浓度为612%的含Triton X-200的I3BS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4 °C)摇床150rpm震荡1天；
[0071](7)在浓度为6%的含SDS的PBS缓冲液中，低温(4°C)摇床150rpm震荡14天；
[0072](8)在浓度为2mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素混合抗菌液，浓度为20KIU/ml ,37 °C摇床150rpm震荡12小时
[0073]其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞肌腱联合骨材料。
[0074]实施例4脱细胞肌腱联合骨材料的制备和研究
[0075]取马跟腱联合骨，步骤(6)在浓度为10%的含Triton X-100的I3BS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素混合抗菌液，浓度为20KIU/ml，低温(4°C)摇床150rpm震荡7天。其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞跟腱联合骨材料。
[0076]实施例5脱细胞肌腱联合骨材料的制备和研究
[0077]取狗跟腱联合骨，步骤(6)步骤(6)在浓度为8%的含Triton X_100的I3BS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素混合抗菌液，浓度为20KIU/ml，低温(4°C)摇床150rpm震荡7天。其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞肌腱联合骨材料。
[0078]对实施例2-5所得脱细胞肌腱联合骨材料分别进行组织学评价、抗原成分定量检测和力学检测，结果与实施例1类似，这表明可通过上述多种方法制得多种组织来源，多种组织大小的脱细胞肌腱联合骨材料，并且对脱细胞肌腱联合骨材料进行组织学评价、抗原成分定量检测和软骨修复能力检测均说明材料已经完全去除细胞成分，无明显抗原成分残留。脱细胞肌腱联合骨材料可以作为临床上肌腱严重撕裂，退化以及肌腱-骨联合部位损伤等病人的安全可靠、有效、快速的替代材料。
【主权项】
1.一种天然组织来源的肌腱联合骨脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 步骤(I)取宰杀12h以内任意哺乳动物的跟腱连跟骨，用剪刀除去跟腱上的脂肪，用含蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，去除血液，贴附的脂肪碎片和其他杂质；步骤(2)在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，低温摇床150rpm震荡24-48小时，温度为4°C； 步骤(3)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，低温摇床150rpm震荡24-48小时，温度为4 °C; 步骤(4)在含SDS的PBS缓冲液中，低温摇床150rpm震荡24-72小时，温度为4°C ； 步骤(5)在含Triton X-100的I3BS缓冲液中，加入混合抗菌液，低温摇床150rpm震荡7-16天，温度为4°C ； 步骤(6)在含SDS的PBS缓冲液中，低温摇床150rpm震荡2-20天，温度为4°C ； 步骤(7)在含DNA酶的I3BS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37°C摇床150rpm震荡12小时； 步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时； 含蛋白酶抑制剂的生理盐水，其中蛋白酶抑制剂浓度为10-50KIU/ml; 含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，其中蛋白酶抑制剂浓度为10-50KIU/ml; 含Triton X的PBS缓冲液，体积浓度为I %_12% 的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液； 含SDS的PBS缓冲液，体积浓度为0.5 % -8 %的SDS的PBS缓冲液； 含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.5-2mg/ml ； 混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度都为20KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1;加入的混合抗菌液与原溶液体积比为I: I。
【文档编号】A61L27/36GK105879120SQ201610405128
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】林贤丰, 王晟毓, 宋立阳, 范顺武
【申请人】浙江大学