实现增强信噪比的多光子光学成像的光纤光学装置的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种能改进多光子成像信噪比、含有单根双包层光纤(DCF)的光纤装置。该装置还包括具有2毫米左右外径的内窥显微镜内的用于聚焦、扫描和信号采集的所有组件。离体和在体实验都证实了这种微型内窥显微镜的前所未有的成像能力。
【专利说明】实现増强信噪比的多光子光学成像的光纤光学装置
[0001]相关申请
[0002]本申请要求以下专利申请的优先权:美国临时专利申请号N0.62/169,712(标题为Fiber-Optic Methods and Devices Enabling Multiphoton Imaging with ImprovedSignal-to-Noise Rat1，2015年6月2日提交)上述专利申请的内容通过引用并入本次申请中并适用于所有目的。
技术领域
[0003]本发明与成像领域有关，尤其涉及用于实现增强信噪比的多光子光学成像的光纤光学方法与装置。
【背景技术】
[0004]由于其固有的光学层析性能、更深的穿透能力和减弱的焦外区域光损伤，多光子显微成像技术，尤其是基于双光子焚光(TPF)和光学二次谐波产生(SHG)信号的显微成像，已经被广泛应用在基础生物和生物医学研究中。然而，由于传统的台式激光扫描显微镜(LSM)无法直接接触和成像动物体内深处的组织，多光子成像技术对活体研究和临床应用的益处还十分有限。为了扩展这一类具有高分辨率的强大成像模式的应用范围，一种小型化的、易弯曲的、成像能力堪比标准激光扫描显微镜的内窥显微装置是非常必要的，并且近年来也有各种各样的内窥显微镜设计问世。
[0005]不管采用何种光学和机械设计方案，开发一款适合实际临床应用的内窥显微镜系统的核心挑战是尽可能提高系统的检测灵敏度。这里我们把检测灵敏度定量地定义为在给定单位荧光团浓度和单位入射功率成像时系统可以达到的信噪比(SNR)。这是从根本上对系统获取高信噪比双光子图像能力的一种综合全面的度量。具备足够高的检测灵敏度对于临床应用尤其关键，因为:I)在临床应用中会被优先选用的内源性荧光团，比如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，和(或)结构蛋白，比如胶原蛋白纤维，通常存在丰度较低，并且其双光子吸收截面相比外源性的荧光染料或荧光蛋白质要小得多；
2)出于安全考虑，临床上可以使用的最大入射功率是有限的。以前的内窥显微镜原型，虽然表现出良好的应用潜力，整体上却依然受困于其匮乏的灵敏度，所以只有在使用外源染色的样品或者非常高的激发光功率(?70毫瓦)的情况下才能获得足够高的图像质量。
[0006]实现小型化的要求加剧了在内窥显微镜上取得高检测灵敏度的难度。以前有若干设计方案采用了两根光纤:一根单模光纤用于传输激发光、另一根大孔径的多模光纤用于信号收集。这种双光纤设计方案，虽然有利于收集更多的非线性荧光信号，但通常会导致探头尺寸过大，以至于没法穿过市场上商品化的胃镜或结肠镜的介入通道(约2.8-4.0毫米直径)。
[0007]因此开发一款既能提供高质量图像又能适配市场上的商品化内窥镜介入通道的、更小的显微内窥探头是大有裨益的。
【发明内容】
[0008]根据本发明的第一个实施例，该装置包括一个外壳。该装置还包括安置于外壳内的单根光波导，用于激发光的传输和出射光的收集。另外，该装置还包括安置于外壳第一端的用作致动器的压电晶体管(PZT)，以及安置于外壳第二端的消色差物镜。
[0009]根据本发明的一个实施例，单根光波导采用了单根光纤的形式。单根光波导可能含有一个或多个单模纤芯和多个包层，其中纤芯(一个或多个)用于将激发光传输至样品，而至少一个包层(和一个或多个纤芯)用于从样品中收集出射(荧)光。单根光波导可以具有纯二氧化硅纤芯、钾掺杂的二氧化硅纤芯、或者一个中空芯。单根光波导也包括一根具有至少一个单模纤芯、一个包层、以及一层低折射系数的涂覆层的光纤。
[0010]根据本发明的另一个实施例，所述物镜在相关的波长范围表现出低色差或无色差，以便提高将出射光耦合回光纤的效率。消色差物镜用于收集主要在长波长(例如750-1060纳米)激发光的聚焦体积内产生的短波长(例如350-600纳米)出射光。消色差物镜还包括一个进一步含有多个具有不同折射率分布(包括渐变折射率透镜/玻璃)和/或不同曲率的镜片、以便校正色差和输入扫描成像光束的场平整度的微型复合透镜。消色差物镜还可以采用一个包含衍射元件/掩模以补偿色差和减少纵向焦点偏移、并同时保持高数值孔径(因此高分辨率)和小尺寸的微型复合透镜的形式。
[0011]本发明的另一个实施例，该装置包含了内置的用于实施二维和三维光束扫描的机制。该内置机制可以采用的形式包括:一根压电晶体管致动的二维光纤扫描器，一个微机电器件致动的二维或三维光纤扫描器，一个内置的深度扫描器，或一个包括压缩弹簧和形状记忆合金丝、用于将部分聚焦光学组件相对于探头其余部分平移的机械扫描器。内置的机构会配备有相应的用于驱动和控制的电子设备。短脉冲光源可以用作激发光源。色散管理模块被用于补偿系统中的光纤和其他光学器件的带来的色散，以便实现短脉冲和良好的信号生成效率。该色散管理模块可以米取的形式包括:一根光子带隙光纤，一对光栅，一对棱镜，或一个光栅透镜对。该装置可以包括一种将出射光从激发光中分离出来的机制。这一从激发光中分离出出射光的机制可以采取分色镜的形式。光探测器被配置成探测出射光，并包含用于预处理和获取信号的电子设备和用于信号数字化和存储数字化的信号的电子设备。光检测器可以采用一个光电倍增管的形式。该装置还可以包括控制装置，成像光束扫描器驱动器，用于控制和同步驱动信号和数据采集、数字化数据、处理并存储数据的数据获取、显示和存储模块。为了将光在自由空间与光纤之间来回耦合而配置的光学器件也包括在本装置当中。
【附图说明】
[0012]附图提供了可视化表示，以用于更充分地描述本文所公开的代表性实施例，也可以用于帮助本领域的技术人员更好地理解该装置及其固有的优点。在这些附图中，相同的附图标记标识了相应的元件:
[0013]图1A展示了根据本发明研发的一款内窥显微镜实例的透视图。
[0014]图1B展示了三种不同双包层光纤(DCF)的非线性背景光子出射率随波长的变化谱图。
[0015]图1C展示了微物镜的透视图。
[0016]图1D展示了微物镜的后焦点偏移仿真图。
[0017]图2A显示了本发明的一个实施例的系统框架图。
[0018]图2B展示了在单光纤(SF)和双光纤(DF)补偿方案下，激发光脉冲通过整个系统过程中的光谱演变(890纳米中心波长)。在单光纤补偿方案中通过比较输出光谱(点线25)和激光光谱(实线26)、在双光纤补偿方案中通过比较DCF的输出光谱(虚线24)和SMF的输出光谱(点划线23)，都可以观测到负啁啾脉冲在自相位调制(SPM)效应下光谱被压缩的现象。
[0019]图2C比较了在两种不同补偿方案下，各个激发功率水平所能产生的双光子信号的强度。
[0020]图3A和3B显示了从小鼠小肠黏膜同时采集的、对应于如下两个谱段的内源性TPF图像:417-477纳米(伪绿色)和496-680纳米(伪红色)。
[0021 ]图3C和3D显示了从小鼠肝脏组织获得的内源性TPF和SHG图像的叠加，对应的光谱频段范围是:496-680纳米(伪绿色)和435-455纳米(SHG信号，伪红色)。
[0022]图3E和3F分别展示了由米非司酮诱导早产(PTB)的小鼠(图3E)和正常妊娠15天的小鼠(图3F)的宫颈组织切片的SHG图像;每张图都包括四张从不同的位置获取的子图，以更好地揭示胶原蛋白结构的形态学差异。用于获取每张附图的激发条件为:750纳米中心波长30晕瓦(图3A和3B)，890纳米中心波长30晕瓦(图3C和3D)，和890纳米中心波长40晕瓦(图3E和3F);图3A和3B使用了4帧原始图像的平均，图3C和3D使用了5帧平均，图3E和3F使用了 10帧平均。比例尺:10微米。
[0023]图4A-4H展示了代表性的活体TPF显微内镜图像。更具体地说，图4A和4B展示了从小鼠小肠黏膜同时采集的、对应于两个不同谱段的内源性TPF图像(与离体情况相同)。获取图像时激发光的焦点相对于小肠绒毛尖端的深度分别为约3微米(A)和约16微米(B)。图4C-4H分别展示了从小鼠尾静脉注射荧光素缀合的葡聚糖示踪剂后约4分钟(图4C)，约7分钟(图4D)，约10分钟(图4E)，约13分钟(图4F)，约16分钟(图4G)和约40分钟(图4H)后的来自肾小管细胞的双光子自发荧光(417-477nm出射谱段，伪绿色)和双光子荧光素荧光(496-680nm出射谱段，伪红色)的叠加图像。用于这里的所有子图的激发条件为750纳米中心波长30毫瓦和2帧原始图像平均。比例尺:10微米。
[0024]其中:
[0025]01:双包层光纤;02:压电晶体管致动器;03:微物镜;04:不锈钢外套管;05:渐变折射率透镜I; 06:渐变折射率透镜2; 07:高折射率平凸透镜;08:保护性玻璃片;09:相位衍射光栅；10: S丽900型号双包层光纤；11 = NuFern 5/130型号双包层光纤；12:定制的双包层光纤；13:微物镜焦点偏移曲线；14:光栅对；15:直角回射镜对；16:来自掺钛蓝宝石激光器的飞秒脉冲；17:单模光纤；18:分色镜；19:带通滤光片；20:短通滤光片；21:光电倍增管;22:内窥显微镜探头;23:双光纤补偿方案下单模光纤的输出光谱;24:双光纤补偿方案下双包层光纤的输出光谱;25:单光纤补偿方案下双包层光纤的输出光谱;26:掺钛蓝宝石激光器的输出光谱;27:双光纤补偿方案;28:单光纤补偿方案；
【具体实施方式】
[0026]下文中将参照附图更充分地描述目前公开的主题，并展示本发明的一些、但不是全部的可能实施例。相同的数字指代相同的元件。目前公开的主题可以有许多不同的实现形式，而不应被理解为仅限于这里阐述的实施例;相反，提供这些实施例是指为了使得本公开满足适用的法律要求。事实上，对于熟悉与本发明公开主题相关技术的相关领域的技术人员而言，由于前述描述和相关附图的教学作用，他们很容易想到许多针对目前公开主题的修改方案和其它实施例。因此，目前公开的主题内容应被理解为不局限于所公开的特定实施例，而旨在将相关的修改和其他实施例也包括在所附的权利要求范围之内。
[0027]目前的发明涉及一种能改进多光子成像信噪比、含有单根双包层光纤(DCF)的光纤装置。该装置还包括包含在2毫米左右外径的内窥显微镜内的所有用于聚焦、扫描和信号采集的组件。离体和在体实验都证实了这种微型内窥显微镜的前所未有的成像能力。
[0028]为了将功能强大的多光子显微镜技术应用到活体的临床实践中，近年来可弯曲的光纤内窥镜被探索用来实现对内部脏器的直接成像。为了真正适合和有助于临床应用，应该首选只利用内源性荧光基团和/或结构蛋白的内窥显微技术。因此，除了追求小型化，内窥显微镜必要的另一个属性是足够高的检测灵敏度，而这恰恰是之前报告的内窥显微镜设计所缺乏的。本发明针对几个关键的性能限制性难题一一包括用于脉冲传输的光纤中的非线性背景干扰和微物镜的焦点偏移一一提供了相应的解决方案。在小巧的探头直径(?2毫米)内，本发明新研发的内窥显微镜达到了前所未有的检测灵敏度，它可以在仅使用内源性双光子信号和中等激发功率的情况下就清晰地呈现亚细胞结构。这些成像结果证实了该装置在临床环境实现活体光学活检的光明前景。
[0029]图1A展示了基于本发明的内窥显微镜探头的机械组装图。该装置包括了一根具有单模纤芯的双包层光纤(DCF)02。该DCF是用来传输飞秒激光脉冲。该装置还包括一个微物镜03用于聚焦激发光和收集出射光子。微型物镜被安置在支架的内部。DCF12的大直径内包层可以把信号导回该装置的近端以便被检测。管状压电致动器02被用来把光纤悬臂共振地振动成螺旋扫描模式。所有部件都被容纳在一根不锈钢壳体管04中，其中该不锈钢外壳管的直径小到足以穿过典型的商业化内窥镜。应该指出的是，这些部件都是示例性的，其他任何适当的、已知或相关领域的技术人员能够想到的能达成相同目的部件也可被使用。
[0030]在关于本发明的该装置中，第一个挑战来自于DCF纤芯中的非线性背景出射光。市售的被动DCF—般使用二氧化锗(Ge02)掺杂剂以提高纤芯的折射率。事实证明，该掺杂剂也使得纤芯具备了双光子激发活性，当飞秒激光脉冲通过时，纤芯会产生可感知的TPF与SHG信号。先前的研究将SHG的来源归因于通过锗原子中心电荷转移激子自组织而建立的二氧化硅反演对称性的断裂，将TPF的来源归因于Ge02掺杂导致的氧不足型缺陷。我们研究了如下两种常用的商业DCF的背景光谱:Nufern公司SM-GDF-5/130光纤和Fibercore公司的SMM900光纤；这两种光纤都在以前的内窥显微镜设计中被采纳过。通过将飞秒激光脉冲(890纳米中心波长)耦合进DCF纤芯、并在同一端面上检测后向传播的非线性背景出射光，我们可以测量非线性背景出射光的光谱分布(图1B，上两条曲线，10和11)。通过曲线看出，这两种商业DCF的背景出射光谱都包含一个相对窄而突出的SHG峰和延伸到600nm波段的宽谱荧光成分。这种非线性的背景出射光是很难消除的。首先，非线性背景光的宽光谱在很大程度上与典型的内源性TPF和SHG信号相重叠，从而无法使用滤光片将其剔除。其次，背景荧光光子以随机方式出现(满足泊松随机过程)，所以噪声水平在像素之间剧烈变化。即使将平均背景噪声减去，噪声的显著波动仍然足以掩盖典型水平的内源性TPF和SHG信号，进而降低整体的图像信噪比和系统检测灵敏度。
[0031 ]由于TPF与SHG背景的根源都来自锗掺杂，定制的具有纯二氧化硅纤芯的DCF 12可以很好地解决这个问题;纯二氧化硅纤芯可以确保降低双光子背景荧光的发光效率和产生SHG背景所需的准相位匹配条件的发生几率。为形成波导结构，DCF包层区域被掺入了氟掺杂剂以降低折射率系数。我们用测量商业DCF背景时相同的实验条件测量了定制DCF的背景出射光谱(图1B，底部曲线12)。与前两种商业DCF相比，定制DCF的背景噪声具有相似的光谱形状，但是光谱的绝对强度要相对低得多。通过数值积分光谱曲线，两种商业DCF的总背景光子出射率比定制DCF分别高出约35倍和约15倍。基于泊松分布假设，定制DCF将背景噪声的波动水平相比分别降低了约5.9和约3.9倍，从而降低了最小可检测信号水平并相应地增强了系统的检测灵敏度。
[0032]增加系统检测灵敏度的第二种方法是提高信号收集能力。多光子内窥显微镜依赖于微物镜将激发光聚焦到组织上，并且将出射光子收集回光纤端面。不幸的是，普通的微透镜，比如渐变折射率(GRIN)透镜，通常表现出相当大的正色差，这会导致出射光的聚焦位置显著偏离光纤端面(即激发波长的聚焦位置)。特别地，由于双光子荧光的出射波长(400-600纳米)比激发波长(800-950纳米)短很多，出射光的后焦点将落在光纤端面的前方，因此即便使用大口径包层的DCF收集也难以避免显著的出射光子收集损失率。为了减少这种焦点偏移，也曾有由2至3个非球面镜片和/或双合透镜组成的微物镜设计出现。然而，这些设计要么焦移仍高达I毫米(对400纳米出射波长)，要么牺牲了聚焦的数值孔径。更加复杂的、集成了更多镜片的设计可能会有更好的性能，但这样的镜头其整体长度可能会太长而不适合用在易弯曲、紧凑的内窥镜探头上。
[0033]为了有效地校正色差并保持物镜的紧凑性，本发明的装置将一个衍射光学器件(DOE)集成到了物镜设计中，如图1C所示)。该装置包括两个渐变折射率透镜05，06和一个夹在二者之间的相位衍射光栅09。该装置还包括一个平凸透镜07和防护玻璃罩08。由于具有与常见的折射透镜相补的色差属性，衍射光学器件已在目镜和相机镜头设计中得以广泛应用。我们这里使用的衍射光学器件是一个多层相位衍射光栅，它具有同心的、由中心到边缘逐渐加密的光栅结构。波长较长的光，有更大的衍射角度，从而聚焦位置更近(因此是互补的色差性质)；具体的波前形状可以通过调谐光栅间隔而进一步优化。这一衍射光学器件被夹在两个渐变折射率透镜之间，第一个渐变折射率透镜(约1/4节距)用来准直出自DCF纤芯的发散光束，第二个渐变折射率透镜(〈1/4节距)用来预聚焦光束。再前面是一个高NA的平凸透镜用来实现强聚焦，镜头的工作距离(WD)在水中约为200微米。通过优化这两个渐变折射率透镜的折射率分布和相位衍射光栅的间隔样式，整个物镜的球差和色差可以降到最低。所有的折射和衍射元件最终都被封装和固定在一个用于保护的不锈钢护套内(外径1.4晕米X长度6.5晕米)。
[0034]最终镜头设计在一个很宽波长范围内的焦点偏移可以通过仿真获得，其结果如图1D所示。从中可以看出，最大的焦点偏移也被很好的控制在150微米范围内。给定微物镜的设计NA(约0.16的像端NA和约0.80的物端NA)，通过几何光学计算可以估计出，对于无散射的弹道出射光子，只要能被微物镜收集，最终都会集中在光纤端面上一个直径约49微米的圆形区域内；因此，这些光子将被具备185微米直径、0.35NA的定制DCF的内包层完全收集。这里采用的超大号高NA的DCF内包层和良好控制的微物镜焦移对于成像实际的强散射组织有更关键的作用，因为其中许多会以较大的倾斜角度进入微物镜的非弹道信号光子相对更难收集。为了通过实验验证和评估收集效率的提高程度，我们将定制的镜头与一款复合透镜做了比价。两个镜头被安装到相同的内窥显微探头上，并成像相同的鼠尾腱组织(或荧光体模)以比较SHG(或TPF)信号的收集效率。最终的比较结果表明前述的定制微物镜可以把SHG和TPF的信号强度分别提高约2.5和约2.0倍。注意这两个比率是用定制的大内包层DCF获得的，所以如果和普通的DCF相比，通过定制DCF和微物镜所取得整体收集效率的提升程度(倍数)应该更高。
[0035]结合到本发明的装置中的最后一个增强系统检测灵敏度的方法是保持短脉冲长度，从而使得在给定入射功率下能够激发更多的非线性出射光子。众所周知，飞秒激光脉冲在光纤纤芯中传播时，会经受由线性色散和非线性效应共同引发的时域展宽。以前的研究表明主要的非线性效应是自相位调制(SPM)，而SPM效应会压缩负啁啾飞秒脉冲的光谱；因此，由于时域带宽积限制，在仅使用线性的预啁啾补偿时，脉冲展宽是“不可避免”的。本发明在施加负的线性预啁啾补偿的基础之上又引入了光谱域的补偿，从而可以保持短的脉冲长度。如图2A的系统框图所示，未啁啾的激光脉冲被首先射入一根单模光纤17中以便通过SPM效应达到光谱展宽的效果。然后脉冲在负啁啾调制后被耦合到DCF的纤芯中，在这里脉冲的时域长度和光谱带宽都在传播过程中被逐渐压缩;图2B展示了这种光谱演化的一个示例。数值模拟已经表明，当由光栅对施加的负群延迟刚好抵消两段光纤中总的正群延迟时，脉冲的时域长度会达到最小，并且这一最佳条件对脉冲功率的变化并不敏感。我们用光学自相关器验证表明，当DCF中传输的脉冲激光的平均功率从14毫瓦变至56毫瓦的过程中，输出脉冲的强度自相关函数(ACF)的半高全宽(FffHM)会一直维持在约120飞秒。反之，当仅使用光栅对施加线性预啁啾补偿时，随着平均传输功率从14毫瓦提高到56毫瓦，输出脉冲的强度ACF的FWHM会相应从约420飞秒增长到约720飞秒。如图2C所示的定量的体模实验表明，相比于仅使用光栅对的单光纤方案28，双光纤方案27可以把TPF的信号强度提升约2-3倍。
[0036]图3A-3F展示了具有代表性的、从未染色的离体小鼠组织中获得的内源性TPF和SHG图像。图3A和3B是小鼠小肠黏膜在不同深度处的TPF图像。在图3A中，焦平面被调至刚好低于小肠绒毛的尖端，这时上皮细胞(主要是肠上皮细胞)呈现出一种马赛克式的图案和绿带微黄的伪彩色，这与NADH和FAD的出射光谱相匹配。在图中负责粘液分泌的杯状细胞呈现为散布于明亮的肠上皮细胞之间的暗斑(如虚线框所示)。当焦平面向深处进一步移动约20微米时，我们能看到如图3B所展示的由一个个肠上皮细胞排列而成的肠绒毛的横截面图；相对于富含线粒体的细胞质，上皮细胞的细胞核呈现为暗淡的圆形。在小肠绒毛的固有层中，含有许多溶酶体的抗原提呈细胞(APC)显示为鲜亮的红色颗粒(如三角所指)。溶酶体对肠上皮细胞的吸收功能也至关重要，并且它们会优先积聚在上皮细胞细胞质的顶部，如图3A和3B中淡黄色的点状颗粒(如箭头所指)所示。
[0037]图3C和图3D展示了从离体小鼠肝脏的相同横向位置(但对应于不同深度)同时获得的内源性TPF和SHG信号的叠加图像。随着焦平面从图3C的位置深入了约20微米到图3D的位置，胶原蛋白纤维的SHG信号(红色)减弱，而细胞质的TPF信号(绿色)变强，这反映了肝脏细胞(这里大部分是肝实质细胞)和胞外由网状纤维组成的支撑网络(主要是III型胶原蛋白)在空间位置的纵横交错。在这两张图中值得注意的是散落在细胞质中的多处明亮的颗粒状物质;这些颗粒被认为是具有强烈自发荧光、并随着细胞衰老不断积累的脂褐质。
[0038]并置相比较的是分别来自于用米非司酮处理诱导的早产(PTB)小鼠模型(图3E)和正常妊娠15天的小鼠(图3F)的宫颈组织切片的胶原蛋白纤维的SHG图像。从形态上看，PTB组的胶原蛋白结构更加疏松多孔，这反映了由米非司酮诱导的宫颈早熟。
[0039]在对活的动物进行活体成像的过程中，动物组织通常会有由呼吸导致的整体运动和/或胃肠的蠕动。因此，为了避免引入严重的运动伪影和图像模糊，活体成像中可用的平均帧数是有限的。在这种情况下，由于具有优异的检测灵敏度，本发明的内窥显微镜仍可拍摄到清晰的亚细胞结构。
[0040]使用与离体成像时相同的激发功率，我们实验了在活体的小鼠小肠黏膜上进行内源性TPF成像，并相应使用了更少的平均帧数(图4A和4B均只用了 2帧平均)。在所得的活体图像中依然可以情况得看到与离体情况相似的亚细胞结构，例如呈现为红色的位于固有层中的抗原提呈细胞和呈现为黄色的位于肠上皮细胞胞浆顶部的点状颗粒。活体研究的一个最好的特征就是具备监测正在运转的器官或组织的动态信息的潜力。为了证实这一点，我们对活体的小鼠肾脏实施了持续的TPF成像;为了呈现肾小管中的流体输运，我们从小鼠尾静脉注射了分子量约为3，000至5，000的荧光素缀合葡聚糖(Aldrich化学公司)作为示踪剂。如图4C到4H所示，肾小管的区段边界可以通过上皮细胞的胞浆自发荧光(绿色)划定出来，而荧光素的信号(红色)可以用来示踪管内的流体动力学信息。由图可见，在注射葡聚糖后(约4分钟)，荧光素信号迅速在近端肾小管中出现(图4C)，然后随时间逐渐衰减(图4C至4G)。在注射后经过约40分钟，大部分的荧光素信号都从近端小管中清除出来并浓缩到了远端小管内(图4H);—部分葡聚糖示踪剂被近端小管细胞吸收，如图中的微黄色点状颗粒(如箭头所指)所示。
[0041]总之，本发明的内窥显微镜具有显著增强的检测灵敏度，它可以仅利用内源性的TPF与SHG信号和适度的激发功率(30?40毫瓦)就清晰地呈现组织的亚细胞结构，从而表现出适用于广泛临床应用的强大潜力。如果在一些情况下引入适当的外源性荧光团，那么在自发荧光的背景上可以进一步捕捉到动态变化，从而产生有价值的功。
[0042]过去的研究表明，与共聚焦显微成像术相比，双光子激发能降低整体的光损伤。然而，焦点内的非线性光损伤仍然可能对组织带来伤害。虽然本文中包括的示范实验所使用的平均激发功率达到了 30毫瓦(除了离体宫颈组织切片使用了约40毫瓦平均功率)，这已经超过了以前细胞培养研究所建议的无光损伤激发阈值(〈10毫瓦)；但是在我们的实验过程中没有观测到明显的光损伤迹象。可能的解释包括这里的内窥显微镜使用了更低的聚焦NA(约0.6)，实行了连续波束扫描，以及与细胞培养物相比实际组织可能具有更高的光损伤容限。
[0043]通过更好的机械设计，本发明目前的内窥显微镜的2毫米左右外径尺寸可以进一步减小，因为该尺寸的下界根本上是由压电晶体管(1.3毫米外径)和微物镜(1.4毫米外径)所决定的。当前内窥显微镜的视场直径约为100微米，超过此范围则激发光的渐晕效应变得很明显。有限的视场大小和工作距离主要都源自要在狭小的探头外径内实现强聚焦的需求，寻求更好的光学设计的研究正在进行当中。
[0044]限制内窥显微镜探头的灵活性的另一个机械因素是其刚性部分的长度(这里约32毫米)；目前该长度受限于光纤悬臂和压电晶体管(各约10毫米长)的总长度。这两个长度与谐振扫描频率和单位驱动电压下能取得的扫描范围息息相关。虽然缩短光纤悬臂可以提高扫描速度，从而有可能减少运动伪影，具体缩短的程度需要权衡由此引发的可实现扫描范围的减小程度和每帧中可用的出射光子数量(假设相同的激发条件)。最佳的折衷方案依赖于具体的应用。
[0045]最后，有人可能已经注意到，与仅使用了光栅对的单光纤补偿方案相比，双光纤脉宽补偿方案所实际取得的TPF信号增强程度(约2-3倍)要小于光脉冲的强度ACF的FWHM的减小程度(约4-6倍)。这种差异源自于两种补偿方案最终的输出脉冲在时域形状和光谱轮廓上的差别。特别的，在双光纤补偿方案中，大幅度展宽的脉冲光谱可能已经超出了荧光团的吸收光谱范围，因此激发效率也会随之降低。如何更好地控制光谱展宽是一个值得进一步研究和探讨的课题。
[0046]—根表面划分为四个象限电极的压电晶体(PZT)管被用作致动器。简而言之，我们将一根DCF穿过并固定到PZT管上，并将露出的自由端用作悬臂。通过在两组电极对上施加适当的调幅正弦驱动信号，光纤末梢能够共振地振动成开启和关闭的螺旋扫描模式。当DCF悬臂设定为约11毫米长时，对应的机械共振频率为约1380赫兹。在本文中，每一帧原始图像含有512圈扫描轨迹，所以单帧图像的采集时间是约0.37秒。所述内窥显微镜的空间分辨率(横向约0.7微米，纵向约6.5微米)是通过成像和测量由机械平台扫描的0.1微米直径的荧光珠和I微米厚度的荧光薄膜、然后再高斯拟合所得的荧光信号随距离的变化曲线而估计得到的。
[0047]从掺钛蓝宝石激光器(Chameleon Vis1n II ,Coherent)中产生的未啁啾的激光脉冲的FWHM是大约150飞秒。这里采用的SMF(PM780-HP，Thorlabs公司)同时也是保持偏振的。对890纳米(780纳米)中心波长的光脉冲，这里采用的光栅对(600线/毫米，WasatchPhotonics)每毫米间距可以产生约-1000飞秒平方(约-642飞秒平方)的群延迟色散。介于当前使用的单模光纤和双包层光纤的长度(分别约25厘米和约75厘米)，中心波长为890纳米(780纳米)的激光脉冲的最佳脉冲宽度应该在光栅对间距等于约36毫米(约55毫米)的时候取得。由于光栅的有限传输效率(约80 % )和系统其它部分的耦合损耗，在DCF纤芯中传输的激光只有在SMF中功率的约20 %。于是DCF中的SPM效应相比SMF中要弱很多，因此导致光谱不能被充分压缩，如图2B所示。通过DCF传回的出射荧光信号首先在分色镜(FFF665-Di02-25x36，Semrock)上与激发光分离，然后在通过一个短通滤光片(FF01-680/SP-25，Semrock)和适当的(一个或多个)荧光滤光片之后进入光电倍增管(H10771P-40，Hamamatsu)中被探测。
[0048]为了实现用于比较的单光纤脉宽补偿方案，我们首先旁路了系统中的单模光纤，然后将光栅对的间距调(长)到使DCF纤芯中的传输功率为56毫瓦时输出脉冲的强度ACF最窄。用于比较TPF强度的荧光体模是通过将荧光素均匀分散(10微摩尔浓度)于稀释的明胶溶液(约％10质量浓度)中制得的。体模被密封在一块O号盖玻片(约100微米厚)下面，以避免由于微物镜需要水浸环境而使得明胶在成像过程中发生溶解。用于比较微物镜的荧光素体模中也是用相同的方式制备而成的。在整个成像过程中没有观察到可见的光漂白迹象。
[0049]具有纯二氧化硅纤芯的DCF是通过外部汽相沉积(OVD)技术制得的。通过调谐内包层的氟掺杂浓度，纤芯的NA可以被调到约0.12;纤芯的单模操作则是通过精确控制纤芯的尺寸(约5.5微米)来实现的。与之类似地，内包层的高NA(约0.35)则是通过进一步调节外包层中的氟掺杂浓度来实现的。
[0050]背景荧光的测量方法与系统框图很类似，唯一不同的是出射信号首先通过了一款基于光栅的单色器(ActonSP2300i ,Princeton Instruments)当中，然后再被光电倍增管(H7422-P50,Hamamatsu)在光子计数模式下(SPC-150，Becker&Hickl GmbH)检测。PMT需要冷却以便确保一个低而稳定的暗计数率(〈200光子/秒)。出射光谱的波长测量间距是I纳米，每个波长下的出射率强度则是通过将测得的12秒内的出射率进行平均并扣除背景得至IJ。为了比较，三根DCF的长度(约70厘米)和纤芯中的传输功率(890纳米中心波长，40毫瓦)前后保持一致，并且远侧的DCF端面被直接暴露于空气中。
[0051]对于离体成像，我们先将小鼠通过二氧化碳窒息安乐死，然后将感兴趣的器官解剖出来。切出的肝叶首先用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，然后被钉在一块固定于培养皿中的自制蜡基上。为避免组织脱水和维持微物镜的水浸环境，PBS被倒入培养皿中直至刚刚浸没组织。解剖出来的小肠的一段(约I厘米长)被纵向切开、并用PBS轻轻冲洗，直至没有明显可见的肠道内容物。然后这一段小肠被展开放置在显微镜载玻片上，使得粘膜层(内侧)朝上并轻微压覆一片O号盖玻片以尽量压制运动伪影。PBS被扩散到载玻片与盖玻片之间以在成像过程中保持小肠组织湿润。
[0052]为了活体成像，小鼠被首先放在引导室中用约5%的异氟醚-氧气混合气体充分麻醉;然后小鼠被移到一个温控的加热垫(36°C)上，其头部被放置于相应的啮齿动物面罩中，从而使其持续吸入约2-3%浓度的异氟醚-氧气混合气体以便保持麻醉状态。对于小肠成像，我们在小鼠的腹部做一个小的切口，并通过该切口辨别出小肠部分(空肠或者回肠)。然后，一段小肠被仔细地拖曳出来，并在不破坏肠系膜血管的前提下固定在自制的支架上。为了成像小肠内部粘膜，我们将一小段小肠(约I厘米长)沿着相对于肠系膜动脉弓的背侧切开以尽量减少出血。然后用与离体情况相似的方法，我们把切开的部分进行了清洗和覆以盖玻片以便于成像。对于肾功能成像，我们首先在小鼠背侧做一个约10毫米长的横向切口以暴露肾脏。一小滴PBS被扩散到微物镜和肾脏表面之间以维持成像时微物镜所需的水浸环境。
[0053]这里公开的技术是一种非侵入式的(或至多微创的)、高分辨率的光学成像技术。其中该技术的关键组成部分，即内窥显微镜，是可弯曲的、有潜力做成一次性的、并且能够直接到达和成像除了易于接近的器官(如皮肤，口腔等)之外的其他内部器官(如胃肠道等)。该技术能够可视化组织在细胞和亚细胞水平上的显微解剖结构，进而在不需要组织切除的情况下实现活体的、原位的、实时的“光学组织学”。
[0054]所述技术的成像原理基于多光子非线性光学成像，即必须同时吸收两个或更多的光子以激发能发荧光的、或具有特定结构的、或其它类型的可激发分子。传统的非线性光学成像平台是台式显微镜。基础研究已经证明了能提供亚细胞分辨率和实现免标记成像的非线性显微技术的强大效能。然而，台式显微镜的庞大体积一直是将非线性显微技术转化到临床应用特别是内部器官成像的障碍。
[0055]本文公开的内窥显微成像术可以实现将上述强大的非线性显微成像技术向临床应用的转化。此外，内窥显微成像术也可以被用作一种基础研究工具，相比于台式显微镜，该技术更加灵活并且便宜得多。
[0056]潜在的应用包括:组织病理学检测:所述的内窥显微镜能够以内窥的方式，在使用或者不使用外来染料的前提下，对活体组织实现原位的、实时的组织学和生理学(如细胞代谢或氧化还原率)评估。这可以免除组织切除、组织学组织制备和处理的需要，从而降低时间和成本。图像引导的组织活检:该技术可用于在革G向活检中识别与疾病如癌症相关联的可疑区域。这有助于降低目前临床实践中常用的随机活检的假阴性率，从而提高诊断率。手术指导:通过实时划分正常和异常组织的边界，该技术可以用于外科手术指导。早产风险评估:该技术可以直接呈现宫颈的胶原蛋白纤维网络及其跟早产有关的异变，从而提供了一种非侵入式的、评估早产风险的方法。美国的早产率大约为12.7%，而且早产是新生儿死亡的首要原因。相关的医疗保健费用约为每年260亿美元。该技术还可以帮助开发用于治愈或预防早产的疗法。骨关节炎的评估:通过将内窥显微镜经由插管递送到关节空间，该技术可以靠直接可视化胶原蛋白纤维的结构来评估软骨完整性，也可以用来监测软骨治疗的效果。
[0057]便携小巧的光纤内窥显微成像系统也可以用作一种价格合理的基础研究工具，它比台式显微镜要便宜得多(成本降低了至少100-200倍)。该技术可用于监测细胞或组织的生长，成像神经元的功能(通过将内窥显微镜直接安置于活的、甚至清醒的或自由行走的动物的头上)，以及用于研究传染病(使内窥显微镜直接接触传染性样本，而其他昂贵的设备，如激光和电子，可以留在隔离墙之外)。
[0058]应当指出的是，计算机应用程序被编程到非暂时性的计算机可读介质上，并可以通过任何在本申请中提及的计算装置读取和执行。这里非暂时性计算机可读介质可以采取本领域技术人员已知的任何一个合适的形式。这里非暂时性计算机可读介质应被理解为用计算机可读的任何制品。这样的非暂时性计算机可读介质包括，但不限于:磁介质，如软盘、柔性磁盘、硬盘、双卷盘式磁带、卡盒式磁带、及盒式磁带或磁卡，光学介质，如⑶_R0M、DVD、蓝光DVD、可写光盘、以及以光盘、磁带或卡形式存在的磁光媒体，和纸质介质，如穿孔卡或纸带。还有一种方式是，用于执行本发明的方法和算法的程序可以存在于远程服务器或其他网络设备上。与本发明相关联的任何数据库可以被存储在中央计算设备、服务器、云端存储、或任何其他已知的或所属领域技术人员可以想到的合适的工具上。与本申请相关的所有信息可以采取有线或无线的方式通过局域网、互联网、蜂窝式电话网络、RFID或任何其它已知的或通过所属领域技术人员可以想到的合适的数据传输工具进行传输。
[0059]至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已结合优选实施例描述了本发明，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出这里未描述的其他增添、删减、修改或替换。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他的变型或修改。
【主权项】
1.实现增强信噪比的多光子光学成像的光纤光学装置，其特征在于，包括: 夕卜壳； 安置在外壳内用于激发光传输和出射光收集的单根光波导； 安置在外壳第一端用作致动器的压电晶体管； 安置在外壳第二端的消色差物镜。2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，单根光波导可由一根光纤构成。3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，单根光波导包括一个或多个单模纤芯和多个包层，其中纤芯被用来传输激发光，而至少一个包层(加上一个或多个纤芯)被用来收集从样品中产生的出射光。4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，单根光波导可从下组中任选一种构成:纯二氧化硅纤芯、钾掺杂的二氧化硅纤芯和中空纤芯。5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，其中所述的单根光波导由一根包括至少一个单模纤芯、一个包层、和一层低折射率涂覆层的光纤构成。6.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述物镜在所关注的波长范围内表现出低色差或者无色差以提高将出射光耦合回光纤的效率。7.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述消色差物镜被设定为用于收集在长波长(例如750-1060纳米)激发光的聚焦体积内产生的短波长(例如350-600纳米)出射光。8.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的消色差物镜由一个进一步包含了多个具有不同的折射率分布(包括渐变折射率透镜/玻璃)和/或曲率的元件、以便校正色差和扫描输入成像光束的场平坦度的微型复合透镜组成。9.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的消色差物镜由一个含有用于补偿色差和降低纵向焦移的衍射元件/掩模、同时保持了高数值孔径(因此高分辨率)和微小尺寸的微型复合透镜构成。10.如权利要求1所述的装置，其特征在于，还进一步包括一个内置的机构来执行二维和三维光束扫描。11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，其中内置的二维和三维光束扫描装置可从下组中任选一种构成:由压电晶体管(PZT)致动的二维光纤扫描器，一个由微机电器件致动的二维或三维光纤扫描器，一个内置的深度扫描器，和一个由压缩弹簧和记忆形状合金线构建的、用来将部分聚焦元件相对于探头的其余部分平移的机械扫描器。12.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，其中内置的扫描机构应配有相应的驱动和控制电子电路。13.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包含用作激发光源的短脉冲光源。14.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还步包含用来补偿光纤和系统中其他光学器件色散、以取得短脉冲和更好的激发效率的色散管理模块。15.根据权利要求14所述的装置，其特征在于，其中色散管理模块由下组中任选一种构成:一根光子带隙光纤、一对光栅、一对棱镜、和一组光栅镜头对。16.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包含用来把出射光从激发光中分离的机制。17.根据权利要求16所述的装置，其特征在于，其中用来将出射光从激发光中分离的机制可以由一个分色镜组成。18.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括用来探测出射光的光探测器、用来预处理和采集信号、以及用来数字化和存储数字化信号的电子设备。19.根据权利要求18所述的装置，其特征在于，其中的光探测器可以由一个光电倍增管构成。20.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包含控制设备，成像光束扫描器的驱动设备，和用来控制和同步驱动信号与数据采集、以及用来数字化、处理和存储数据的数据采集、显不和存储t旲块。21.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包含用于将光在自由空间和光纤之间耦合的光学器件。
【文档编号】A61B10/04GK106037831SQ201610389096
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】李兴德, 吴聪, 吴一聪, 梁文轩
【申请人】李兴德, 吴聪, 吴一聪, 梁文轩