多剂型黑色素前体物质染发剂及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种二剂型黑色素前体物质染发剂和一种三剂型黑色素前体物质染发剂。所述的二剂型染发剂包括：A剂和B剂；所述三剂型染发剂包括：A剂、B剂和C剂；其中A剂和C剂均包括黑色素前体、染发剂常用助剂以及水；染发剂常用助剂为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性剂、保湿剂、pH值调节剂中的一种或多种。本发明结合化学合成染发剂与天然染发剂的优点，通过提取天然食用菌中的复合酶液，将氨基酸通过生物转化合成多巴色素、5,6?二羟基吲哚及5,6?二羟基吲哚?2?羧酸等黑色素前体物质，对皮肤无刺激无致敏作用，安全性高，并保持自然黑的染发效果，且有多种剂型选择，在染发剂制备领域具有巨大的推广应用价值。
【专利说明】
多剂型黑色素前体物质染发剂及其使用方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种酶处理制得的染发剂，特别是涉及一种提取食用菌酶液，将氨基 酸底物转化成天然黑色素前体物质，并将其制备成非氧化型多剂型生物染发剂的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，随着人们对健康重视程度的不断提高，化学合成的染发剂中含有的致癌及 强致敏化学染色成分(如苯二胺类、氨基酚等物质)和一些有害成分(如过氧化氢、氨水等）， 已越来越多地受到人们的关注。为此，人们试图寻求天然无害、更加安全的染发材料。比如 植物色素染发剂，虽然取得了 一定的成绩，但仍然存在很多问题，这类产品仍无法避免在染 发剂中添加酚类及过氧化氢等有害物质，而且缺乏成熟的色素提炼技术。目前已知有利用 植物色素儿茶酚制备天然染发剂的方法(专利文献CN101164528A)，但其中使用的儿茶酚是 从中药材儿茶中提取，其缺点是中药材的种植规模有限，色素提取成本相对较高;也有报道 通过基因工程技术，利用表达霉菌属丝状菌细胞中的儿茶酚氧化酶，对多巴及其衍生物进 行氧化，将其转变为黑色素前体的方法(专利文献CN101914585A)，但霉菌本身会产生一些 有毒有害物质，生产过程会造成环境的污染，同时存在成本高，耗时长，性能不稳定、无法大 量应用等缺点。现有技术中也有使用芽孢杆菌发酵液中所提取酶液催化底物产生黑色素前 体物质的方法，但仍无法保证其产品的安全无毒副作用，发酵过程中的污染也会影响产品 品质。
[0003] 人体头发的颜色是由毛发皮质中的黑色素颗粒的种类和数量所决定的，随着年龄 的增长及快节奏的工作生活导致的压力，黑色素颗粒的产生会逐渐减少，黑发就会逐渐变 白。而黑色素在人体中的合成过程(图1 )，是由黑色素细胞通过酪氨酸酶将酪氨酸氧化成多 巴色素，多巴色素脱去羧基生成5,6_二羟基吲哚，或利用互变异构酶生成5,6_二羟基吲哚_ 2-羧酸，之后经过聚合形成真黑素，从而使头发呈现黑色。
【发明内容】
[0004] 本发明是为了解决上述技术问题，而根据人体毛发中黑色素的合成原理，提供了 一种从食用菌里面提取酶液，通过与氨基酸底物反应生成黑色素前体物质，然后加入辅料 制备得到多剂型生物染发剂，其工序包括：（a)食用菌复合酶液的提取、纯化、固定及保存工 序；（b)将酪氨酸等底物进行生物转变成黑色素前体的工序；（c)对上述反应液进行处理，提 高5,6-二羟基吲哚浓度的工序；（d)将黑色素前体物质和辅料混合制备得到多剂型染发剂 的工序。
[0005] 本发明二剂型黑色素前体物质染发剂，所述染发剂包括:A剂和B剂；
[0006] 所述A剂包括黑色素前体、助剂A和水;所述助剂A为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性 剂、保湿剂、pH值调节剂中的一种或几种；
[0007] 所述黑色素前体包括多巴色素、5,6_二羟基吲哚、5,6_二羟基吲哚-2-羧酸中的一 种或几种；
[0008] 所述黑色素前体占 A剂的重量百分比为0.01 %~5%;
[0009] 所述B剂包括助剂B和水;所述助剂B为助染剂、增稠剂、表面活性剂、pH值调节剂中 的一种或几种。
[0010] 优选的，所述润湿渗透剂为L-半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或两种；
[0011]所述助染剂为含有二价或三价阳离子的金属盐类；
[0012] 所述增稠剂为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、淀粉、硅凝胶、明 胶、海藻酸钠、瓜尔胶、琼脂、大豆蛋白胶、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺、聚γ-谷氨 酸、玻璃质酸钠、聚丙烯酸、低分子聚乙烯蜡、黄原胶中的一种或几种；
[0013] 所述表面活性剂为单硬脂酸甘油酯、十六烷基三甲基氯化铵、鲸蜡醇、月桂基磺化 琥珀酸单酯二钠、磺基琥珀酸单酯二钠、爱玛膏中的一种或几种；
[0014] 所述保湿剂为甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙三醇、食用油中的一种或几种；
[0015] 所述pH值调节剂为赖氨酸、精氨酸、碳酸氢钠中的一种或几种。
[0016] 优选的，所述二价或三价阳离子为Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe 2+、Fe3+中的一种或几种。
[0017]优选的，所述A剂中：
[0018] 所述润湿渗透剂占 A剂的重量百分比为1%~10% ;
[0019] 所述增稠剂占 A剂的重量百分比为0.2%~2% ;
[0020] 所述表面活性剂占 A剂的重量百分比为0.1 %~2% ;
[0021] 所述保湿剂占 A剂的重量百分比为1%~15%;
[0022] 所述pH值调节剂占染发剂的重量百分比为1 %~10% ;
[0023] 所述B剂中：
[0024] 所述助染剂占 B剂的重量百分比为0.5%~10% ;
[0025] 所述增稠剂占 B剂的重量百分比为0.2%~2% ;
[0026] 所述表面活性剂占 B剂的重量百分比为0.1%~2%;
[0027] 所述pH值调节剂占 B剂的重量百分比为0.1 %~1 %。
[0028] 优选的，所述黑色素前体的制备包括以下步骤：
[0029] (1)准备反应底物；
[0030] (2)从食用菌中提取合成黑色素前体所需的复合酶；
[0031] (3)利用步骤二制得的复合酶对步骤一中的反应底物进行催化，获得目标产物； [0032] (4)将步骤三中所得目标产物进行转化处理，获得黑色素前体；
[0033]所述反应底物为酪氨酸、多巴、多巴胺中的一种或多种；
[0034] 所述食用菌为杏鲍菇、双孢菇、褐菇、草菇、平菇、香菇、黑木耳、茶树菇中的一种或 多种。
[0035] 优选的，所述目标产物转化处理进行以下操作中的一种或多种:沸水加热、加热同 时减压蒸发、电解、添加脱羧酶。
[0036]优选的，所述底物为L-酪氨酸。
[0037] 优选的，所述底物浓度为ImM~10mM。
[0038]优选的，所述步骤二中提取的复合酶进行纯化和固定化处理;所述纯化的方法为 超滤和/或离子交换柱层析。
[0039]优选的，所述对复合酶进行固定化处理时，固定材质为分子筛、硅藻土、海藻酸钠 等公知的固定化材质。
[0040] 本发明二剂型黑色素前体物质染发剂的使用方法，所述使用方法包括以下步骤： 将待染头发清洗后，将上述二剂型黑色素前体物质染发剂的A剂均匀涂于头发表面，30~ 50min后用清水清洗;再将B剂均匀涂于头发表面，15~25min后，用清水清洗，即将头发染成 黑色。
[0041] 优选的，所述A剂与B剂的用量比例为3:1~1:1，所述比例为质量比。
[0042]本发明三剂型黑色素前体物质染发剂，所述染发剂包括:A剂、B剂和C剂；
[0043] 所述A剂包括黑色素前体、助剂A和水;所述A剂中黑色素前体占 A剂的重量百分比 为0.01%~5%;所述助剂A为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性剂、保湿剂、pH值调节剂中的一 种或几种；
[0044] 所述B剂包括助剂B和水;所述助剂B为助染剂、增稠剂、表面活性剂、pH值调节剂中 的一种或几种。
[0045] 所述C剂包括黑色素前体、助剂C和水;所述C剂中黑色素前体占 C剂的重量百分比 为0.01 %~5% ;所述助剂C为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性剂、保湿剂、pH值调节剂中的一 种或几种；
[0046] 所述黑色素前体包括多巴色素、5,6_二羟基吲哚、5,6_二羟基吲哚-2-羧酸中的一 种或几种。
[0047]优选的，所述润湿渗透剂为L-半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或两种；
[0048]所述助染剂为含有二价或三价阳离子的金属盐类；
[0049] 所述增稠剂为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、淀粉、硅凝胶、明 胶、海藻酸钠、瓜尔胶、琼脂、大豆蛋白胶、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺、聚γ-谷氨 酸、玻璃质酸钠、聚丙烯酸、低分子聚乙烯蜡、黄原胶中的一种或几种；
[0050] 所述表面活性剂为单硬脂酸甘油酯、十六烷基三甲基氯化铵、鲸蜡醇、月桂基磺化 琥珀酸单酯二钠、磺基琥珀酸单酯二钠、爱玛膏中的一种或几种；
[0051] 所述保湿剂为甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙三醇、食用油中的一种或几种；
[0052] 所述pH值调节剂为赖氨酸、精氨酸、碳酸氢钠中的一种或几种。
[0053] 优选的，所述二价或三价阳离子为Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe 2+、Fe3+中的一种或几种。
[0054] 优选的，所述A剂中：
[0055] 所述润湿渗透剂占 A剂的重量百分比为1 %~10% ;
[0056] 所述增稠剂占 A剂的重量百分比为0.2%~2% ;
[0057] 所述表面活性剂占 A剂的重量百分比为0.1 %~2% ;
[0058]所述保湿剂占 A剂的重量百分比为1%~15% ;
[0059] 所述pH值调节剂占染发剂的重量百分比为1 %~10% ;
[0060] 所述B剂中：
[0061 ]所述助染剂占 B剂的重量百分比为0.5 %~10 % ;
[0062]所述增稠剂占 B剂的重量百分比为0.2%~2% ;
[0063]所述表面活性剂占 B剂的重量百分比为0.1%~2%;
[0064]所述pH值调节剂占 B剂的重量百分比为0.1 %~1 % ;
[0065] 所述C剂中：
[0066] 所述润湿渗透剂占 C剂的重量百分比为1%~10% ;
[0067] 所述增稠剂占 C剂的重量百分比为0.2%~2% ;
[0068]所述表面活性剂占 C剂的重量百分比为0.1%~2% ;
[0069] 所述保湿剂占 C剂的重量百分比为1%~15% ;
[0070] 所述pH值调节剂占 C剂的重量百分比为1 %~10 %。
[0071] 优选的，所述黑色素前体的制备包括以下步骤：
[0072] (1)准备反应底物；
[0073] (2)从食用菌中提取合成黑色素前体所需的复合酶；
[0074] (3)利用步骤二制得的复合酶对步骤一中的反应底物进行催化，获得目标产物； [0075] (4)将步骤三中所得目标产物进行转化处理，获得黑色素前体；
[0076]所述反应底物为酪氨酸、多巴、多巴胺中的一种或多种；
[0077] 所述食用菌为杏鲍菇、双孢菇、褐菇、草菇、平菇、香菇、黑木耳、茶树菇中的一种或 多种。
[0078] 优选的，所述目标产物转化处理进行以下操作中的一种或多种:沸水加热、加热同 时减压蒸发、电解、添加脱羧酶。
[0079]优选的，所述底物为L-酪氨酸。
[0080] 优选的，所述底物浓度为ImM~10mM。
[0081]优选的，所述步骤二中提取的复合酶进行纯化和固定化处理;所述纯化的方法为 超滤和/或离子交换柱层析。
[0082]优选的，所述对复合酶进行固定化处理时，固定材质为分子筛、硅藻土、海藻酸钠 等公知的固定化材质。
[0083]本发明三剂型黑色素前体物质染发剂的使用方法，所述使用方法包括以下步骤： 将待染头发清洗后，将上述三剂型黑色素前体物质染发剂的A剂均匀涂于头发表面，15~ 25min后用清水清洗;再将B剂均匀涂于头发表面，15~25min后用清水清洗;然后将C剂均匀 涂于头发表面，15~25min后用清水清洗，即将头发染成黑色。
[0084] 优选的，所述A剂、B剂、C剂的用量比例为3:1:3~1:1:1，所述比例为质量比。
[0085] 本发明黑色素前体物质染发剂及其使用方法与现有技术不同之处在于：
[0086] 1.本发明通过提取天然食用菌中的复合酶液，将氨基酸通过生物转化合成多巴色 素、5,6_二羟基吲哚及5,6_二羟基吲哚-2-羧酸等黑色素前体物质，以这些前体物质为主要 染发成分，添加辅料制备成非氧化型的多剂型生物黑色素染发剂的生物技术。本产品避免 使用了P-苯二胺、氢醌、间苯二酚等化学染发成分，这些物质被证明有一定的致癌作用，并 且可以引起部分用户的过敏反应、而且不包含铅、汞、砷等对人体有毒害作用的重金属成 分；同时避免使用了其他化学染发剂中常用的强氧化剂过氧化氢、具有强刺激性气味的氨 水等成分，减轻了对头发和皮肤的伤害，同时本产品还具有抗紫外线功能，并含有多种氨基 酸，有利于头皮的健康及头发的保护。
[0087] 2.本发明的染发剂中小分子的黑色素前体物质在润湿渗透剂的作用下进入到头 发中，利用空气中的氧气将头发中的黑色素前体物质氧化，聚合成大分子黑色素颗粒，从而 存留在头发中，使白头发呈现自然黑色。本发明产品对皮肤无刺激无致敏作用，安全性高， 对环境无污染，并且黑色素前体成分也具有抗紫外线功能，对头皮和头发起到保护作用。
[0088] 3.本发明的染发剂在生产及使用的过程中具有原料易得、工艺简单、使用效果可 靠和安全无毒等优点，易于工厂化生产，利用食用菌中提取的酶液，经生物转化为黑色素前 体物质，并配制成染发剂的方法及生产工艺在国内外未见报导。本发明的染发剂制备方法 因具有上述优点而具有良好的开发前景。
[0089] 4.本发明的染发剂具有多种剂型可以选择，根据两剂型和三剂型的不同，对应有 不同的使用方法，使用方便灵活。
[0090] 下面结合附图对本发明的黑色素前体物质染发剂及其使用方法作进一步说明。
【附图说明】
[0091] 图1为真黑素合成反应图；
[0092] 图2为黑色素前体薄层层析成分测定图；
[0093] 图3为5,6_二羟基吲哚标准品的吸收光谱图；
[0094] 图4为本发明制得黑色素前体物溶液的吸收光谱图；
[0095]图5为人的白头发的肉眼观察图；
[0096]图6为人的白头发的显微镜观察图；
[0097]图7为人的自然黑发的肉眼观察图；
[0098]图8为人的自然黑发的显微镜观察图；
[0099]图9为市售含对苯二胺染发剂所染头发的肉眼观察图；
[0100]图10为市售含对苯二胺染发剂所染头发的显微镜观察图；
[0101] 图11为本发明染发剂所染头发的肉眼观察图；
[0102] 图12为本发明染发剂所染头发的显微镜观察图；
[0103] 图13为本发明染发剂用于白牦牛毛染色的效果图；
[0104] 图14为本发明染发剂实际染发效果图
[0105] 图15本发明染发剂与市售染发剂抗紫外线的比较图。
【具体实施方式】
[0106] 本发明的理念是模拟人体黑发中真黑素的生成过程(如图1所示），利用生物方法 合成黑色素前体物质，并通过辅助材料使黑色素前体物质进入到头发中，再聚合成黑色素 而留在头发中，形成永久型染发剂。
[0107] 本发明是以酪氨酸或其衍生物为底物，利用提取的复合酶液进行酶促反应中得到 的黑色素前体物质，包括多巴色素、5,6_二羟基吲哚、5,6_二羟基吲哚-2-羧酸等，吲哚_5,6 醌、吲哚_5,6醌-2-羧酸等，其中优选5,6_二羟基吲哚。此外，本发明中的黑色素前体不局限 于单体，也可以包括二倍体以上的低聚体。
[0108] 发明是以酪氨酸或其衍生物为底物，利用提取的复合酶液进行酶促反应中得到的 黑色素前体物质，包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚-2-羧酸等，吲哚-5，6 醌、吲哚_5,6醌-2-羧酸等，其中优选5,6_二羟基吲哚。此外，本发明中的黑色素前体不局限 于单体，也可以包括二倍体以上的低聚体。黑色素前体的制备方法如下。
[0109] 生产工序
[0110] 原料：作为底物，可以使用试剂级或食品级酪氨酸及其衍生物，例如D或L型酪氨 酸、D或L型多巴、多巴胺等，可以是其中的一种或几种组合，也可以是上述物质的异构体。
[0111] 酶液:利用粉碎方法从食用菌中提取复合酶液，在提取的过程当中可加入磷酸、柠 檬酸、Tris-HCl缓冲液，pH值控制在6.0~8.0。提取之后通过离心等方式得到粗酶液。
[0112] 上述提到的粗酶液可以直接用于产物的合成反应，也可进一步通过超滤和离子交 换柱层析，硫酸铵沉淀和/或丹宁酸沉淀等处理得到纯化的酶，冻干脱水后低温保存，可长 期保持酶活性。
[0113] 酶在使用前，可以通过2价铜离子配位处理或酸性溶液处理等使酶的活性提高。
[0114] 上述提到的酶液可以直接加入到反应液中进行酶促反应，此外，从提高酶的稳定 性及重复使用效率、使用后的容易分解程度、避免其它蛋白质混入反应体系等方面出发，也 可采用固定化的酶。酶的固定化方法没有特别限定，可以通过分子筛、硅藻土、海藻酸钠等 公知的固定化方法，也可采用食用菌粉末和毛发粉末等亲和吸附的方法进行固定。针对固 定方法的不同对粗酶和纯化酶的要求不同。
[0115] 反应步骤：
[0116] (1)酪氨酸底物溶液的预处理
[0117]以L-酪氨酸为底物时，底物浓度选择范围在ImM~10mM，酪氨酸底物溶解度较小， 可采取调节pH等手段增加其溶解度。
[0118] (2)酪氨酸酶的生物转化反应
[0119] 在生物反应器中，预先加入ImM~1 OmM的L-酪氨酸底物溶液，利用按照体积比为1 / 5~1/30的比例，加入上一步提取的复合酶液，然后通入空气，保持空气压力在0.05Mpa~ 0.2Mpa，空气流量为5LPM~20LPM，进行生物转化反应，并且定时取样检测。
[0120] (3)检测
[0121] 取出样品离心，取上清液稀释10倍，在紫外分光光度计中测定300nm(5,6-二羟基 吲哚的吸收峰）以及475nm(多巴色素的吸收峰）的吸光度。当300nm的吸光度大于2.0,并且 475nm的吸光度大于0.5时，终止生物转化反应，进行下一步处理。
[0122] 后处理工序：
[0123] (1)黑色素前体物质的收集
[0124] 在上述转化反应液中，除含有生成的黑色素前体物质外，还含有一些包括剩余的 游离酶或固定酶，及黑色素前体聚合后的黑色素。为了收集该反应液中的黑色素前体物作 为染发的染料，故需要将剩余的酶及聚合后的黑色素除去。对于酶可以通过离心、超滤等方 法除去，聚合后的黑色素可以通过吸附、过滤等方法除去。去除的酶可以返回到反应工序再 利用，去除的黑色素可以应用到其他产品。最终收集得到的溶液主要为含有黑色素前体物 质溶液，包括多巴色素、5，6-二羟基吲哚、5，6-二羟基吲哚满、5，6-二羟基吲哚-2-羧酸等， 其中多巴色素占比例较大。
[0125] (2)黑色素前体物组成的调整
[0126] 在黑色素前体物溶液中，能够使白发染黑的最主要的染发有效成分为5,6_二羟基 吲哚，其通过润湿渗透进入到头发内部，并利用空气中的氧气在头发里聚合成黑色素颗粒， 留到头发皮质中，使头发呈现黑色。根据这一最终目的，需要对黑色素前体物质溶液的组成 进行转化调整。可以通过(I)沸水加热、（Π )加热同时减压、（ΙΠ )电解、（IV)利用脱羧酶中的 一种或一种以上处理来调整组合比例，从而使得多巴色素为主的黑色素前体物向5，6_二羟 基吲哚转化。得到的黑色素前体物溶液用于配制染发剂。
[0127] (3)黑色素前体物成分的测定
[0128] 通过上述方法得到的黑色素前体物溶液，可以选用薄层层析来进行主要成分测定 (图2)，同时用紫外分光光度法在波长300nm进行检测5,6_二羟基吲哚的含量(图3,图4)。
[0129] (4)染发剂的配制方法
[0130] 本发明的染发剂中的成分主要包括黑色素前体物质、润湿渗透剂、增稠剂、表面活 性剂、pH值调节剂、助染剂、保湿剂，也可以加入一些营养成分，例如一些植物提取物、中药 成分等。作为染发剂的主要成分黑色素前体物质，其含量优选1%~5%;润湿渗透剂(L-半 胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或两种）；助染剂((：112+、1^2+、0 &2+、？62+、？63+等金属盐中的一 种或一种以上）；增稠剂(羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、淀粉、硅凝胶、明 胶、海藻酸钠、瓜尔胶、琼脂、大豆蛋白胶、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺、聚γ-基谷氨 酸，玻璃质酸钠、低分子聚乙烯蜡、黄原胶等中的一种或一种以上）；表面活性剂(单硬脂酸 甘油酯，十六烷基三甲基氯化铵，鲸蜡醇，月桂基磺化琥珀酸单酯二钠，磺基琥珀酸单酯二 钠，爱玛膏中的一种或几种）;保湿剂(甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙三醇、食用油中的一 种或一种以上）;pH值调节剂(赖氨酸、精氨酸、碳酸氢钠中的至少一种）。
[0131] 实施例1
[0132] 本实施例黑色素前体的制备方法按以下步骤进行：
[0133] 1.酪氨酸酶的提取和测定
[0134] 取杏鲍菇破碎后的材料500克加入1000ml的蒸馏水提取酪氨酸酶液或利用1000ml 中性的磷酸盐缓冲液提取酪氨酸酶液。
[0135] 酪氨酸酶活的测定方法如下：取0.1ml蘑菇复合酶液与3.9ml的底物溶液在317nm 反应lOmin，酶活力单位U的定义为每lmin引起吸光度0.01个单位的变化为1个酶活力单位。 测定的结果大于1000U时，此酶液可用于以下的黑色素前体累积反应。
[0136] 2.黑色素前体的积累反应
[0137] 配制浓度为ImM-lOmM的酪氨酸溶液2L，将酪氨酸底物溶液加入容量体积为10L生 物反应器中，利用温度控制系统，将温度控制在30°C，按照底物体积的1/20的比例，加入上 一步提取的复合酶液，然后通入空气，保持空气压力为O.lOMpa，空气流量为10LPM，进行生 物转化反应，并且定时取样检测。
[0138] 取出的液体样品离心，取上清液稀释10倍后，在紫外分光光度计中测定300nm以及 475nm的吸光度。当300nm的吸光度大于2.0并且475nm的吸光度大于0.5时，终止生物转化反 应，进行下一步处理。
[0139] 3.黑色素前体物的收集
[0140] 上述得到的黑色素前体物溶液，在SOOOrpm离心除去酪氨酸酶及杂蛋白；上清液加 入5%的活性炭，吸附反应过程中聚合的黑色素颗粒，此时得到的黑色素前体物溶液中以多 巴色素为主。
[0141] 4.黑色素前体组成的调整
[0142] 由多巴色素转化成5,6_二羟基吲哚，利用旋转蒸发仪通过操作将黑色素前体溶液 调整收集。
[0143] 实施例2
[0144] 本实施例黑色素前体的制备方法按以下步骤进行：
[0145] 1.酪氨酸酶的提取
[0146] 利用榨汁机将褐菇破碎，500g子实体碎渣加入1000ml用pH值为6.8的柠檬酸缓冲 液提取酶液，利用5%活性炭吸附处理后离心备用。
[0147] 2.酪氨酸酶的固定
[0148] 将200目的硅藻土经过60°C加热处理30min，后经过磷酸盐缓冲液浸泡20min，离心 除去上清液，将处理后得到的硅藻土加入到上述酶液中固定5h，得到固定化酶备用。
[0149] 3.黑色素前体的积累反应
[0150] 配制浓度为5mM的酪氨酸溶液2L，可采取加热溶解的方法使其完全溶解。
[0151]将酪氨酸底物溶液加入容量体积为10L生物反应器中，利用温度控制系统，将温度 控制在30°C，加入上一步固定化酶100克，然后通入空气，保持空气压力为O.lOMpa，空气流 量为10LPM，进行生物转化反应，并且定时取样检测。
[0152]取出的液体样品经过离心后，上清稀释10倍后，在紫外分光光度计中测定300nm以 及475nm的吸光度。当300nm的吸光度大于2 · 0，并且475nm的吸光度大于0 · 5时，终止生物转 化反应，进行下一步处理。
[0153] 4.黑色素前体的收集
[01 M] 上述得到的黑色素前体溶液，在12000rpm、4 °C离心5min除去固定化酶及杂蛋白； 此时得到的黑色素前体溶液中以多巴色素为主。
[0155] 5.黑色素前体组成的调整
[0156] 调整过程同实施例1。
[0157] 实施例3
[0158] 本实施例黑色素前体的制备方法按以下步骤进行：
[0159] 1.酪氨酸酶的提取
[0160] 利用榨汁机将双孢菇破碎，500g碎渣加入lOOOmlpH值为7.0的Tris-盐酸缓冲液提 取酶液，离心提取上清液，利用10%大孔吸附树脂吸附酶液中的多糖与杂蛋白等，处理后的 酶液放置4 °C的条件下备用。
[0161] 2.黑色素前体的积累反应
[0162] 配制浓度为10mM的酪氨酸溶液2L，可采取加热溶解的方法使其完全溶解。
[0163] 反应过程同实施例1。
[0164] 取出的液体样品经过滤纸过滤，滤液稀释10倍后，在紫外分光光度计中测定300nm 以及475nm的吸光度。当300nm的吸光度大于2 ·0，并且475nm的吸光度大于0 · 5时，终止生物 转化反应，所得溶液含有染发的主要染料成分一5，6二羟吲哚。
[0165] 实施例4
[0166] 本实施例的二剂型黑色素前体物质染发剂按以下步骤制备:将实施例1-3中制得 的黑色素前体物质与染发剂常用助剂和水，在减压充氮的条件下分别制成膏状或水状的染 发剂A剂和B剂，其中具体原料的选择与配比如表1和表2所示，其中所用原料均为市售。
[0167] 表1实施例4中A剂中各原料的种类和量
[0169]
[0170] 其中，黑色素前体物质为上述实施例1-3中制得的，上述百分数均为占染发剂的重 量百分数，其余量为水。
[0171] 表2实施例4中B剂中各原料的种类和量
[0173]
[0174] 上述百分数均为占染发剂的重量百分数，其余量为水。
[0175] 实施例5
[0176] 本实施例的黑色素前体物质染发剂的使用方法按以下步骤进行：
[0177] 将待染头发清洗后，将实施例4中所制得的二剂型黑色素前体物质染发剂的A剂均 匀涂于头发表面，30min后用清水清洗;再将B剂均匀涂于头发表面，25min后，用清水清洗， 即将头发染成黑色。经一次染色即可见发色显著发黑，从染发前后的效果对比图（图14)中 可以看出，经过本染发剂染发后的头发颜色均匀，且头发顺滑有光泽。
[0178] 实施例6
[0179] 本实施例的黑色素前体物质染发剂的使用方法与实施例5的不同之处在于:染发 剂A剂在头发上的停留时间为50min;染发剂B剂在头发上的停留时间为15min;经一次染色 即可见发色显著发黑。
[0180] 实施例7
[0181] 本实施例的黑色素前体物质染发剂的使用方法与实施例5的不同之处在于:染发 剂在头发上的停留时间为40min;染发剂A剂在头发上的停留时间为20min;经一次染色即可 见发色显著发黑。
[0182] 实施例8
[0183]本实施例的三剂型黑色素前体物质染发剂按以下步骤制备:将实施例1-3中制得 的黑色素前体物质与染发剂常用助剂和水，在减压充氮的条件下分别制成膏状或水状的染 发剂A剂、B剂和C剂，其中具体原料的选择与配比如表3-5所示，其中所用原料均为市售。 [0184]表3实施例8中A剂中各原料的种类和量
[0186]
[0187] 其中，黑色素前体物质为上述实施例1-3中制得的，上述百分数均为占染发剂的重 量百分数，其余量为水。
[0188] 表4实施例8中B剂中各原料的种类和量
[0190]
[0191] 上述百分数均为占染发剂的重量百分数，其余量为水。
[0192] 表5实施例8中C剂中各原料的种类和量
[0193]
[0194]
[0195] 其中，黑色素前体物质为上述实施例1-3中制得的，上述百分数均为占染发剂的重 量百分数，其余量为水。
[0196] 对比验证试验
[0197] 本发明染发剂与市售染发剂的比较
[0198] 取等量的白发，经洗发水清洗后，将市售两剂型的染发剂A剂与B剂混合后均匀涂 于头发上，40min后用清水洗去浮色。
[0199] 取等量的白发，经洗发水与清水洗后，将本发明的染发剂按照实施例5中的步骤对 头发进行染色。
[0200] 然后，在显微镜下观察白发、人的自然黑发以及染过的黑发的效果(见图5-图12)。 从结果中可看出，本产品对白发的染发效果理想，且对头发的损伤较小，染过之后的头发更 接近于人体自然黑发。
[0201] 本发明染发剂用于白色牦牛毛的染色
[0202] 白色牦牛毛的结构和人头发类似，经常被用来作为染发效果检验的替代品。
[0203]用梳子将实施例4制得的产品的A剂涂至白色牦牛毛上，正反方向反复梳理，使膏 体均匀分布在牦牛毛上，停留30min，然后用清水清洗;再将B剂均匀涂于头发表面，25min 后，用清水清洗，用毛巾擦至不滴水。
[0204]从染发前后的效果对比图（图13)中可以看出，经过本染发剂染发后的牦牛毛颜色 均勾乌黑。
[0205] 本染发剂与市售染发剂紫外线吸收光谱对比
[0206] 分别精确称取本发明染发剂单独A剂，两剂型的A剂、B剂很合物，三剂型的A剂、B 剂、C剂混合物各8mg;分别标为1号样品，2号样品和3号样品；以市售欧莱雅染发剂为对照， 均勾涂抹于4cm2的3M医用胶带上，在紫外分光光度计中扫描280nm~400nm的吸光度，得到 结果如图15所示。本发明产品的2号样品和3号样品，在UVB波段(280nm~310nm)的吸光度要 明显高于市售染发剂。
[0207] 虽然以上描述了本发明的【具体实施方式】，但是本领域的技术人员应当理解，这些 仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背 离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更 和修改均落入本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种二剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于，所述染发剂包括:A剂和B剂； 所述A剂包括黑色素前体、助剂A和水;所述助剂A为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性剂、 保湿剂、pH值调节剂中的一种或几种； 所述黑色素前体包括多巴色素、5,6_二羟基吲哚、5,6_二羟基吲哚-2-羧酸中的一种或 几种； 所述黑色素前体占 A剂的重量百分比为0.01%~5%; 所述B剂包括助剂B和水;所述助剂B为助染剂、增稠剂、表面活性剂、pH值调节剂中的一 种或几种。2. 根据权利要求1所述的二剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于： 所述润湿渗透剂为L-半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或两种； 所述助染剂为含有二价或三价阳离子的金属盐类； 所述增稠剂为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、淀粉、硅凝胶、明胶、海 藻酸钠、瓜尔胶、琼脂、大豆蛋白胶、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺、聚γ-谷氨酸、玻璃 质酸钠、聚丙烯酸、低分子聚乙烯蜡、黄原胶中的一种或几种； 所述表面活性剂为单硬脂酸甘油酯、十六烷基三甲基氯化铵、鲸蜡醇、月桂基磺化琥珀 酸单酯二钠、磺基琥珀酸单酯二钠、爱玛膏中的一种或几种； 所述保湿剂为甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙三醇、食用油中的一种或几种； 所述pH值调节剂为赖氨酸、精氨酸、碳酸氢钠中的一种或几种。3. 根据权利要求1或2所述的二剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于： 所述A剂中： 所述润湿渗透剂占 A剂的重量百分比为1%~10%; 所述增稠剂占 A剂的重量百分比为0.2%~2%; 所述表面活性剂占 A剂的重量百分比为0.1 %~2 % ; 所述保湿剂占 A剂的重量百分比为1%~15%; 所述pH值调节剂占染发剂的重量百分比为1 %~10% ; 所述B剂中： 所述助染剂占 B剂的重量百分比为0.5 %~10 % ; 所述增稠剂占 B剂的重量百分比为0.2 %~2 % ; 所述表面活性剂占 B剂的重量百分比为0.1 %~2 % ; 所述pH值调节剂占 B剂的重量百分比为0.1 %~1 %。4. 根据权利要求1所述的二剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于，所述黑色素前体 的制备包括以下步骤： (1) 准备反应底物； (2) 从食用菌中提取合成黑色素前体所需的复合酶； (3) 利用步骤二制得的复合酶对步骤一中的反应底物进行催化，获得目标产物； (4) 将步骤三中所得目标产物进行转化处理，获得黑色素前体； 所述反应底物为酪氨酸、多巴、多巴胺中的一种或多种； 所述食用菌为杏鲍菇、双孢菇、褐菇、草菇、平菇、香菇、黑木耳、茶树菇中的一种或多 种。5. -种权利要求1所述二剂型黑色素前体物质染发剂的使用方法，其特征在于，所述使 用方法包括以下步骤:将待染头发清洗后，将权利要求1所述二剂型黑色素前体物质染发剂 的A剂均匀涂于头发表面，30~50min后用清水清洗;再将B剂均匀涂于头发表面，15~25min 后，用清水清洗，即将头发染成黑色。6. -种三剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于，所述染发剂包括:A剂、B剂和C剂； 所述A剂包括黑色素前体、助剂A和水；所述A剂中黑色素前体占 A剂的重量百分比为 0.01%~5%;所述助剂A为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性剂、保湿剂、pH值调节剂中的一种 或几种； 所述B剂包括助剂B和水;所述助剂B为助染剂、增稠剂、表面活性剂、pH值调节剂中的一 种或几种。 所述C剂包括黑色素前体、助剂C和水；所述C剂中黑色素前体占 C剂的重量百分比为 0.01%~5%;所述助剂C为润湿渗透剂、增稠剂、表面活性剂、保湿剂、pH值调节剂中的一种 或几种； 所述黑色素前体包括多巴色素、5,6_二羟基吲哚、5,6_二羟基吲哚-2-羧酸中的一种或 几种。7. 根据权利要求6所述的三剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于： 所述润湿渗透剂为L-半胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或两种； 所述助染剂为含有二价或三价阳离子的金属盐类； 所述增稠剂为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、淀粉、硅凝胶、明胶、海 藻酸钠、瓜尔胶、琼脂、大豆蛋白胶、聚乙二醇、聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺、聚γ-谷氨酸、玻璃 质酸钠、聚丙烯酸、低分子聚乙烯蜡、黄原胶中的一种或几种； 所述表面活性剂为单硬脂酸甘油酯、十六烷基三甲基氯化铵、鲸蜡醇、月桂基磺化琥珀 酸单酯二钠、磺基琥珀酸单酯二钠、爱玛膏中的一种或几种； 所述保湿剂为甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙三醇、食用油中的一种或几种； 所述pH值调节剂为赖氨酸、精氨酸、碳酸氢钠中的一种或几种。8. 根据权利要求6或7所述的二剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于： 所述A剂中： 所述润湿渗透剂占 A剂的重量百分比为1%~10%; 所述增稠剂占 A剂的重量百分比为0.2%~2%; 所述表面活性剂占 A剂的重量百分比为0.1 %~2 % ; 所述保湿剂占 A剂的重量百分比为1%~15%; 所述pH值调节剂占染发剂的重量百分比为1 %~10% ; 所述B剂中： 所述助染剂占 B剂的重量百分比为0.5 %~10 % ; 所述增稠剂占 B剂的重量百分比为0.2 %~2 % ; 所述表面活性剂占 B剂的重量百分比为0.1 %~2 % ; 所述pH值调节剂占 B剂的重量百分比为0.1 %~1 % ; 所述C剂中： 所述润湿渗透剂占 C剂的重量百分比为1%~10%; 所述增稠剂占 C剂的重量百分比为0.2 %~2 % ; 所述表面活性剂占 C剂的重量百分比为0.1 %~2 % ; 所述保湿剂占 C剂的重量百分比为1 %~15 % ; 所述pH值调节剂占 C剂的重量百分比为1 %~10 %。9. 根据权利要求6所述的三剂型黑色素前体物质染发剂，其特征在于，所述黑色素前体 的制备包括以下步骤： (1) 准备反应底物； (2) 从食用菌中提取合成黑色素前体所需的复合酶； (3) 利用步骤二制得的复合酶对步骤一中的反应底物进行催化，获得目标产物； (4) 将步骤三中所得目标产物进行转化处理，获得黑色素前体； 所述反应底物为酪氨酸、多巴、多巴胺中的一种或多种； 所述食用菌为杏鲍菇、双孢菇、褐菇、草菇、平菇、香菇、黑木耳、茶树菇中的一种或多 种。10. -种三剂型黑色素前体物质染发剂的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以 下步骤:将待染头发清洗后，将权利要求6中所述三剂型黑色素前体物质染发剂的A剂均匀 涂于头发表面，15~25min后用清水清洗;再将B剂均匀涂于头发表面，15~25min后用清水 清洗;然后将C剂均匀涂于头发表面，15~25min后用清水清洗，即将头发染成黑色。
【文档编号】A61Q5/10GK106038411SQ201610530914
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】张然, 薛俊, 厉秀茹
【申请人】南京普瑞彩生物科技有限公司