专利名称：从去分化的、非诱发的刺阿甘树细胞的体外培养物产生的制剂、其用于治疗皮肤老化、炎 ...的制作方法
技术领域：
本发明的目的在于源自去分化、非诱发的阿甘树细胞体外培养物的制剂、含有所述制剂的化妆品或皮肤病学组合物、及其用于治疗皮肤老化、炎症和愈合的用途。
背景技术：
阿甘树是ー种属于植物山榄科的树，其学名为刺阿甘树(Argania spinosa(L.)bcellesノ。它的习性与橄榄树相似；其具有短且扭曲的树干。木材非常坚硬致密。枝非常多刺，且它们有小的、披针形的、互生的、短(约2厘米长)且窄的叶，叶往往汇集成簇。 叶是常绿的，但遇严重干旱时，叶死亡并脱落。花是雌雄同株的且为五聚体。它们集中在团伞花序中，并在五月和六月开花。它们是黄緑色的。阿甘树从5龄开始能结出果实。果实为黄色，椭圆形无柄浆果，约4-5厘米长。它由围绕着坚果的浆组成，坚果含有2至3个粘在一起的扁平种子，各种子包裹着富含油的仁。阿甘树是摩洛哥特有的并主要位于索维拉和阿加迪尔之间的摩洛哥西南部。阿甘树林覆盖约830000ha。由于阿甘树特别坚硬的木质，摩洛哥人们最先将其用作燃料供应。其它主要传统用途是手工初步提取的油，但现在使用压榨来提取。这种油的首要用途是作为食物；另ー个重要的应用目前是用于化妆品。源自油的生产的浆和残余的柏通常用于动物饲料。许多美容产品是从阿甘树开发的。已经有若干针对源自种子的油的发明专利，例如通过溶剂获得的油(专利Fr 2 553 788)、富含非皂化物的阿甘树油(专利Fr 2 724663)。除油以外的物质也授予了专利，例如源自油提取之后获得的种子柏的肽；来自油和柏的肽的组合物用于治疗皮肤老化有关的问题(专利Fr 2 756 183)。也有来自阿甘树的叶、柏的蛋白质和皂甙的发明专利=来自叶的提取物(专利EP I 213 025)、柏蛋白质(专利EP I 213024)、柏皂甙(专利EP I 430 900)。最近，专利申请EP I 968 536经保藏公开了来自阿甘树果实的浆的提取物在抗老化化妆品中的用途。因此，整个阿甘树的组合物对于皮肤病学和/或美容用途是令人感兴趣的。阿甘树是ー种重要的资源植物，因为首先生态学上地，它是ー个“生态系统”植物。它完全适应干旱地区，它保护土壌免于水蚀和风蚀，从而防止沙漠逼近摩洛哥内。而且还因为在经济上，它是ー种具有多种用途的树。它是摩洛哥的主导作物。因此，阿甘树林受1925年颁布的诏令(dahir)(法令)的保护，写道国家对于阿甘树林享有最高权利，但当地群众享有用益权(阿甘树下的果实、枯木、作物)。UNESCO最近将阿甘树林列为生物圏储备。这就是为什么其木材或叶用于化妆品用途的利用可对此受保护的植物产生严重的后果。从植物获得兴趣分子的另ー种手段是制备全能去分化的细胞培养物。使用去分化的植物细胞还可以避免一些化妆品产品开发过程中遇到的エ业化问题。采用细胞培养物，不存在不同植物批次或收割之间兴趣物质浓度上的差异。它也是ー种非破坏性的技术，相对容易且价格低廉地建立。最后，由于细胞在培养基中且活性化合物在培养基中或在细胞内液体中，这排除了对提取的需求。因此简单的研磨就可以获得这些化合物。专利申请W003077881公开了用于局部应用的含有至少ー种体外培养物中去分化的且诱发的植物细胞匀浆物来合成至少ー种植物抗毒素的组合物。植物材料优选来自藤。
发明内容
因此，本文件公开了可以去分化并诱发的植物细胞的化妆品应用，诱发产生足够量的次级代谢物使得能够具有局部用途中的生物活性。
令人惊奇和意外的是，申请人已证明源自去分化但非诱发的阿甘树细胞的体外培养物在抗老化、炎症和愈合领域具有良好的化妆品和/或皮肤病学活性。得到的结果表明，在阿甘树的特定情况下，阿甘树细胞培养物的另ー种应用(在这种情况下非诱发细胞)可能在上面提到的内容范围内。此外，按照本发明所公开的而获得制剂可以消除对诱发步骤的需求，诱发步骤在エ业上是困难且昂贵的步骤；由于细胞生长缓慢，诱发导致更低的生物质产量。申请W003077881提到了进行这种诱发的各种方式，例如UV辐射3天；ニ氧化碳持续24小时至2天；UV福射和ニ氧化碳5天。在本发明的框架内进行的方法，由来自源自阿甘树的植物材料的细胞去分化然后在悬液中细胞培养组成，其可以快速地产生精细的、丰富的、均匀的和无菌的这种植物的生物质。细胞培养使得有可能将这种植物的生物合成途径直接应用到细胞規模。因此，本发明目的在于源自去分化的非诱发阿甘树细胞体外培养物的制剂、包括所述制剂的化妆品或皮肤病学组合物及其在美容和/或皮肤病学中的用途，优选用于治疗皮肤老化、炎症和愈合。更通常地，植物组织在悬液中的体外培养物提供一种生产直接源自ー级或次级细胞代谢的活性有机化合物的手段。植物细胞在悬液中处于去分化状态，与用于动物细胞培养物的干细胞的状态相似。因此，这些植物细胞理论上能够产生整个植物中观察到的所有代谢物。去分化导致生物合成途径的遗传或表观遗传干扰，从而整个植物和获得的细胞株之间的化学谱是定性和定量上的差异。因此，理论上，在整个植物中没有观察到的反应中间体可能会出现在细胞悬液中。这提供了一个新的机会，从而可以获得“休眠的”化学生物多样性。在本领域的当前状态中，通常细胞培养物的诱发(化学、物理、生物的)可以刺激并产生更多的次级代谢物。在根据本发明的我们的方法中，我们将显示，不像大多数情况，令人惊讶的是，诱发不是必要的，而是不利于生物质的生长和所需的生物活性。本发明的目的之ー涉及源自去分化的非诱发的阿甘树细胞的体外培养物的制剂。“去分化的植物细胞”是指没有任何特定的特化性质的任何植物细胞，換言之，在与自然状态下植物分生组织相似的生理状态中。这些细胞能够自己生存而不依赖于其它细胞。去分化的刺阿甘树(Argania spinosa)细胞获自从树或幼芽摘取的活植物材料，其由叶、叶柄、茎、树皮、根、果实、种子、花和花器官或花蕾组成，尤其来自叶。用于获得去分化的细胞培养物的方法，是通过本领域技术人员已知的任何方法获得的，例如參阅 Murashige, T.，Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growthand bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15:473-496。/Plant Culture Media, Vol-IFormulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock,和
H.J. George (1987)Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA134QG 英国。根据本发明的制剂可通过按顺序进行以下步骤获得a)植物材料的灭菌，
b)细胞的去分化，c)置于有培养基而没有诱导子的细胞悬液中，d)用没有诱导子的培养基进行的生物质增殖和生产培养物，以及获得制剂。如果目的是生产少量的生物质，制剂可在锥形烧瓶中制备，或者用于更大的量，制剂可在生物反应器中制备。例如，收集于带有500ml细胞悬液的锥形瓶的平均量是IOOg干燥的生物质(即200g生物质/每L细胞悬液)，而收集于IOL生物反应器的平均干燥的物质是3000克(300g/L生物质)。生物反应器中植物细胞培养遇到的三种主要模式I.不连续的或分批培养，2.补给/收集或流加培养，以及3.连续培养。a.植物材料灭菌步骤:采取刺阿甘树(Argania spinosa)外植体,且更特别地叶的外植体,用钠或 丐的次氯酸盐溶液或者氯化汞溶液在环境温度下除污几分钟。用无菌蒸馏水漂洗组织，然后在除污的最后用无菌蒸馏水洗涤至少一次。b.细胞去分化的步骤除污后的外植体放置在层流罩下接触Murashige & Skoog琼脂营养培养基，已向其中添加有蔗糖和生长因子(或激素)。这些生长激素将控制外植体的细胞机制从而引起细胞分裂以及引起细胞簇或去分化的愈伤组织(愈伤组织再生)。每3-4周将得到的愈伤组织转移到新的去分化营养培养基中。这种培养基的一些富含琼脂的成分可被愈伤组织代谢或由空气的作用降解。在一般情况下，基于植物生长素(2-4 ニ氯-苯氧基こ酸)和细胞分裂素(激动素)的激素组合物被成功地测试以获得快速和充分的松散型愈伤组织(愈伤组织再生)形式的组织去分化，以及有助于转移到液体培养基中。无菌叶外植体可以保存在近轴面，接触由Murashige 和 Skoog 培养基组成的琼脂培养基(Murashige, T. , Skoog, F. 1962. A revisedmedium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol.Plant 15:473-496),其具有 30g/L 的蔗糖、8g/L 琼脂、0. 5mg/L 激动素和 O. 75mg/L 2-4 ニ氯-苯氧基こ酸(24D)添加剂，并在121°C (Ibar) 20分钟的高压灭菌之前调节至pH6。含有外植体的平皿置于28°C下在黑暗中孵育。2周后出现第一个愈伤组织。每3-4周，通过用解剖刀划分愈伤组织以保持在2至3cm的尺寸，将得到的愈伤组织转移到新的培养基。这些转移物保持2至6个月直到获得松散型愈伤组织。c.在没有诱导子的培养基中产生细胞悬液的步骤用于将愈伤组织连续转移到琼脂培养基上的细胞去分化导致松散型愈伤组织的形成。这种细胞间的粘附カ下降是去分化的后果，去分化取决于植物可在两至六个月之间发生。这种状态有利于转移至液体培养基中，因为它保证愈伤组织在细胞悬液中的分散，同时最大限度地減少诱导的机械应力。因此，松散型愈伤组织的集(按体积10-20%)引入到使用没有胶凝剂的与琼脂去分化培养基相同的制剂制备而成的液体营养培养基中。因此，松散型愈伤组织在液体培养基中通过2至3天的振动台作用被分散，得到的细胞悬液完全没有未分散的愈伤组织部分，从而形成均匀的细胞悬液。这种悬液保持培养以获得足够致密的细胞群。在此阶段，悬液经过(亚培养)或稀释于新的营养培养基中，并以同样的方式开始培养。 通过在含有200ml培养基的500ml锥形瓶中保藏20至40g松散型愈伤组织开始初始的细胞悬液。因此，松散型愈伤组织在液体培养基中通过2至3天在黑暗中在29°C下，在115rpm下的振动台作用被分散。然后使用移液器收集细胞漂浮物，留下未分散的残留愈伤组织簇。细胞漂浮物从而形成均匀的细胞悬液。这种悬液保持培养以获得“足够”致密的细胞群。得到的细胞悬液培养15天，然后通过在新的培养基中稀释至1: 5，持续相同的时间进行増殖。已作出对培养基组合物(营养、生长因子等)的调整，从而最大限度地提高生物质产率。其结果是针对液体细胞悬液而优化的ARGMS生物质增殖培养基(见表I)。这种培养基是Murashige&Skoog培养基针对愈伤组织再生的改良版本。通过加入KOH将这种培养基调整至pH 6，随后是在121°C下(P=Ibar)高压灭菌20分钟或者以O. 2μπι过滤灭菌。表I :ARGMS培养基是用于在锥形瓶中或生物反应器中于最佳条件下在悬液中培养阿甘树细胞的Murashige & Skoog (ARGMS)培养基的改良版本
_____ARGMS_____培 _—每_______:________针对细 li^FElSEl
NH4NO3_12 |g/L 「
~CaCU.2H200.33 — g/L 宏量儿素
MgS04.7H，00.25 q/L-EHaEOj_M___
M_0-83 mg/L 微:R 兀素
關 O36.2 ψ/L
MnS04.4H,0 22.3 mql
ZnSO4-IH^O_6.61 mg/L
Na-.MoOj.2HiO 0.25 mg/L
CuSO4-SH,0 [0.025 fmg/L l_
权利要求
1.用于治疗皮肤老化、炎症和愈合的源自去分化、非诱发的阿甘树细胞体外培养物的制剂。
2.根据权利要求I所述的制剂，其以细胞悬液、生物质、研磨生物质、研磨生物质漂浮物或培养物漂浮物的形式。
3.一种化妆品或皮肤病学组合物，其包括比如权利要求I或2所定义的源自非诱发去分化的阿甘树细胞培养物的制剂作为活性成分，并联合有化妆品或皮肤病学可接受的赋形剂。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于制剂的量在组合物总量的O.1-10%之间。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其用于治疗皮肤老化、炎症和愈合。
6.一种获得制剂的方法，其特征在于包括如下步骤 a)植物材料的灭菌 b)细胞的去分化 c)置于有培养基而没有诱导子的细胞悬液中， d)用没有诱导子的培养基进行生物质增殖和培养物生产，以及 获得制剂。
7.用于皮肤老化的化妆品治疗的方法，其包括利用根据权利要求3-5任一项所定义的组合物。
全文摘要
本发明涉及从去分化的、非诱发的刺阿甘树细胞的体外培养物产生的制剂，以及其用于治疗皮肤老化、炎症和瘢痕的用途。
文档编号A61Q19/00GK102821750SQ201180017061
公开日2012年12月12日 申请日期2011年3月30日 优先权日2010年3月31日
发明者N·斯图尔德, A·曼代亚, N·卡斯泰-里齐 申请人:皮埃尔·法布尔皮肤化妆品公司