专利名称：一种从裂殖壶藻中提取油脂的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种从裂殖壶藻中提取并精制富含油脂的微藻油脂的方法。
背景技术：
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,简称DHA)是目前发现的碳链最长、不饱和度最高的长链高度不饱和脂肪酸。DHA是机体生物膜的重要结构组分，在婴幼儿神经发育、视网膜形成、智力发展等方面具有重要作用，而且也是前列腺素、换前列腺素和白三烯 素等具有强烈生理活性的自身调节物质的前体，对预防心血管疾病、抗血脂、降血压、抑制肿瘤形成等具有显著作用。由于具有上述多种重要生理功能，DHA已经成为价值高、市场广泛的脂肪酸产品。裂殖壶菌，又称裂壶藻，属于真菌门(Eumycota)、卵菌纲(Oomycetes )、水霉目(Saprolegniales )、破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的一类海洋真菌，单细胞、球形。裂殖壶藻细胞积累大量对人体有用的活性物质，如油脂、色素、角鲨烯等，其中油脂占细胞干重的70%以上，总脂中二十二碳六烯酸(DHA)含量非常高，达到359Γ40%，结构类似的脂肪酸含量低，容易分离纯化，而且没有鱼腥味，故裂殖壶菌是一种极具实现工业化生产DHA潜力的微生物之一。CN 101638361Α公开了一种从裂殖壶菌提取并精制富含二十二碳六烯酸的方法，发酵液絮凝处理再进行固液分离，通过碱破壁后在将细胞机械破碎，然后对破碎的菌体采用有机溶剂萃取，获得DHA粗油，DHA粗油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到DHA精油。该方法解决了裂殖壶藻油脂提取精炼的技术问题，但该技术破壁工艺繁琐，用时较长，设备投入大，在水、藻和有机溶剂分层工艺中采用静置分层工艺，该工艺在实际应用分层效果不好，且时间较长。CN102199485A公开了一种提取裂壶藻油脂的方法，该方法是以裂壶藻泥为原料，经均质、碱提、酶解、离心、有机溶剂萃取得到裂壶藻油。原料先经柠檬酸钠缓冲液稀释并均值后进行高温处理，再经碱提并依次采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，离心后分离清油并采用有机溶剂萃取乳油。该方法采用水酶法提油技术解决了裂殖壶藻藻油提取的技术问题，但该技术工艺复杂、破壁工序繁多，不适合工业化生产应用。现有技术中裂殖壶藻粗油的精炼均采用化学精炼技术，DHA粗油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到DHA精油。该工艺不可避免地存在一些问题，例如部分中性油不可避免的被皂化；废水污染环境；从副产品皂角中回收脂肪酸时，需要经过复杂的加工环节(水解、蒸馏);特别是用于高酸值毛油的精炼时，油脂炼耗大，经济效果欠佳。而且，目前的破乳分层中多采用加入乙醇、氯化钠等方法进行破乳分层，该工艺在实际应用存在生产成本高、工艺操作复杂、分层时间长、分层效果不稳定、乙醇回收困难和产生大量的废盐水等问题
发明内容
本发明的目的在于提供一种从裂殖壶藻中提取油脂的方法，所述方法破壁操作时间和分层工艺时间短，分层效果好，同时避免了因破乳工艺造成的废水排放和水处理的负担，降低了水处理的成本。为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案一种从裂殖壶藻中提取油脂的方法，所述方法包括如下步骤(I)调节裂殖壶藻发酵液的pH至酸性，加入有机溶剂，搅拌，实现裂殖壶藻细胞的破壁和微藻油脂的提取；(2)向步骤(I)得到的发酵液中加入絮凝剂絮凝处理后，采用有机溶剂萃取得到藻毛油；
(3)藻毛油经脱胶，脱色，脱酸/脱臭，得到富含DHA的微藻油脂。本发明所述裂殖壶藻，也称裂殖壶菌。本发明示例性的裂殖壶藻发酵液的制备方法为采用裂殖壶藻安培罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养后，再转接入6m3发酵罐培养，其所属的培养基组成为葡萄糖100-130g，酵母膏15-30g，蛋白胨10-20g，磷酸二氢钾2_4g，硫酸镁1-38，微量元素复合液8-111111，维生素复合液4-81111，用0. 5 X海水定容至IL ；所述的0. 5X海水是将I体积的海水与I体积的水混合得到；所述的微量元素复合液的制备方法如下Na2 EDTA 6. 0g, FeCl3 6H20 0. 29g,H3BO3 6. 84g, MnCl2 4H20 0. 86g, ZnCl2 0. 06g, CoCl2 6H20 0. 026g, NiSO4 6H200. 052g,CuSO4 5H20 0. 002g, NaMoO4 2H20 0. 005g，用水定容至 IL ；所述维生素复合液的制备方法如下维生素BI IOOmg,维生素B7 0. 5mg,维生素B12 0. 5mg，用水定容至IL ；所述发酵培养的参数为温度25 30°C，pH值5. 5^7. 5，培养时间72、6h，所述发酵培养的参数优选为温度25°C，pH值6. 0，培养时间96h，溶氧10%。本发明调节发酵液的pH后，在一定的温度和转速下进行搅拌，使微藻细胞发生自溶破壁，细胞内部的油脂游离出来，通过有机溶剂进行萃取，实现了裂殖壶藻细胞的自溶破壁的同时有效地提取微藻细胞中的油脂，大大缩短了微藻油脂的破壁提取时间。自溶法是一种特殊的酶水解方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。在微生物生长代谢过程中，大多都能产生一定的水解自身细胞壁上聚合物结构的酶，以便使生长繁殖过程进行下去。控制一定条件，可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。本专利中通过调节藻液的PH值，控制自溶温度和时间，实现了微藻细胞的自溶破壁。所述方法大大简化了油脂提取的工艺，且提油效率高，工艺简单，有利于实现工业
化生产。优选地，所述絮凝剂为生物絮凝剂，优选壳聚糖。在水、藻、有机溶剂分层工艺中，本发明采用生物絮凝剂壳聚糖进行生物絮凝工艺。壳聚糖是一种储量极为丰富的天然碱性多糖，由甲壳素经浓碱水脱乙酰基后生成的产物。壳聚糖絮凝微藻细胞，从而完成破乳。壳聚糖与微藻细胞主要通过中和作用、吸附作用和网捕架桥作用与微藻细胞发生作用，使微藻细胞发生絮凝，达到破乳分层效果。采用生物絮凝剂壳聚糖进行破乳分层，壳聚糖的加入大大缩短了破乳分层的时间，同时提高了破乳分层的效果，同时避免了因破乳工艺造成的废水排放和水处理的负担。优选地，步骤(3)所述脱酸/脱臭采用真空脱酸/脱臭工艺。真空脱酸/脱臭工艺是在真空条件下利用蒸汽携带去除FFA和挥发性物质等，它避免了中性油皂化损失，降低了油脂损失，而且操作简单，蒸汽、水和能量的消耗都较少，因此投资较少，并且色素和臭味物质也随着蒸汽被去除。优选地，步骤(2)包括如下步骤(2a)向步骤(I)得到的发酵液中加入生物絮凝剂，充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相；(2b)向步骤(2a)抽取混合油相后的发酵液中再次加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，静置分层后，抽取上层混合油相； (2c)将步骤(2a)和步骤(2b)得到的混合油相中的溶剂蒸发，得到藻毛油。本发明采用三相分层工艺提取混合油相。将步骤(I)得到的发酵液中加入生物絮凝剂，充分搅匀后，静置分层，最下层为水，中层为藻渣，上层为混合油相，所述混合油相为有机溶剂和藻毛油的混合物。将步骤(2a)的发酵液抽取上层混合油相后，再次加入有机溶齐U，进行二次萃取。将两次萃取得到的混合油相中的溶剂蒸发，得到藻毛油。中层的藻渣可通过固液分离，干燥后得到，可用于动物饲料使用。步骤(I)调节pH 至 3. 5 4. 5，例如调节 pH 至 3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4.，1,4. 2、
4.3,4.4,优选3. 7^4. 2。调节发酵液的pH至3. 5^4. 5，可实现裂殖壶藻的自溶破壁，简化了裂殖壶藻破壁提取的工艺流程，显著降低了破壁操作时间，减少了设备投入。优选地，步骤(I)采用酸调节pH值，所述酸选自盐酸、磷酸、醋酸或者柠檬酸中的任意一种或者至少两种的混合物。所述混合物例如盐酸和磷酸的混合物，磷酸和醋酸的混合物，醋酸和柠檬酸中的混合物，盐酸、醋酸和柠檬酸中的混合物，磷酸、醋酸和柠檬酸中的混合物。优选地，步骤(I)和步骤(2b)中，有机溶剂的体积为步骤(I)发酵液体积的0. 8^2倍，例如0. 9倍、I. I倍、I. 3倍、I. 4倍、I. 6倍、I. 8倍、I. 9倍，优选f I. 5倍。优选地，步骤(I)在4(T60°C下搅拌，例如在 42°C、46°C、48°C、50°C、52°C、54°C、56 V、58 °C、59 V下搅拌，优选在45 55 °C下搅拌。所述有机溶剂选自六号溶剂、正己烷、异己烷或异戊烷中的任意一种或者至少两种的混合物。所述混合物例如六号溶剂和正己烷的混合物，正己烷和异己烷的混合物，异己烷和异戊烷的混合物，六号溶剂、正己烷和异己烷的混合物。上述溶剂均可市购得到。生物絮凝剂的添加量为10(T500mg/L步骤(I)得到的发酵液，即“每L步骤(I)得到的发酵液中添加10(T500mg的生物絮凝剂”，优选添加量为30(T500mg/L步骤(I)得到的发酵液。所述揽拌的揽拌速率为80 150rpm,例如 85rpm、95rpm、105rpm、llOrpm、115rpm、125rpm、135rpm,优选 90 140rpm,进一步优选 100 130rpm。步骤(I)所述搅拌时间为2飞小时，例如2. 5小时、3小时、3. 5小时、4小时、4. 5小时、5小时、5. 5小时，优选2. 5^5. 5小时。步骤(2b)所述搅拌时间为0. 5 I小时，例如0. 55小时、0. 6小时、0. 65小时、0. 7小时、0. 75小时、0. 85小时、0. 95小时，优选0. 6小时 0. 9小时。
所述脱胶采用磷酸酸化脱胶工艺；优选地，所述磷酸酸化脱胶工艺为将步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油预热到8(T85°C，加入步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的O. 3^0. 5%的磷酸，酸化脱胶后，9(T95°C的水洗2飞次，得到脱胶后的脱胶藻毛油；所述每次水洗用水的重量是步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的5 10%。所述藻毛油的预热温度可以是81°C、82°C、83°C、84°C。所述磷酸的加入量为藻毛油重量的O. 3^0. 5%，例如
O.33%,O. 36%,O. 38%,O. 41%,O. 44%,O. 47%,O. 49%。所述热水的重量为藻毛油重量的 5 10%，例如 5. 5%、6%、6· 5%、7%、7· 5%、8%、9%、9· 5%。优选地，所述脱色采用活性炭或活性白土脱色。优选地，所述脱色工艺为在真空条件下，温度为10(Tl05°C，向脱胶后的藻毛油添加脱胶后藻毛油重量3 5%的活性炭或活性白土进行脱色，真空度为-O. 094mPa以下。所述 温度例如可以为 101°C、102°C、103°C、104°C。所述真空度例如为-O. ImPa,-O. 2mPa、_0· 3mPa、-O. 4mPa、_0. 5mPa。所述真空度为表压。所述脱酸/脱臭采用真空脱酸/脱臭工艺，所述工艺为将脱色后的藻毛油在温度为12(T280°C、真空度为-0.094mPa以下，脱色广2小时。所述温度例如可以为130°C、150°C、180°C、210°C、230°C、25(rC、27(rC。所述脱色时间例如为 I. 2 小时、I. 4 小时、I. 6 小时、I. I小时、I. 8小时、I. 9小时。所述真空度例如为-O. ImPa,-O. 2mPa、_0. 3mPa、_0. 4mPa、-O. 5mPa。所述真空度为表压。优选地，一种从裂殖壶藻中提取油脂的方法，所述方法包括如下步骤(I)调节裂殖壶藻发酵液的pH至3. 5^4. 5，加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，实现裂殖壶藻细胞的破壁和微藻油脂的提取；(2a)向步骤(I)得到的发酵液中加入生物絮凝剂，充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相；(2b)向步骤(2a)抽取混合油相后的发酵液中再次加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，静置分层后，抽取上层混合油相；(2c)将步骤(2a)和步骤(2b)得到的混合油相中的溶剂蒸发，得到藻毛油；(3)藻毛油经脱胶，脱色，脱酸/脱臭，得到富含DHA的微藻油脂。优选地，一种从裂殖壶藻中提取油脂的方法，所述方法包括如下步骤(I)调节裂殖壶藻发酵液的pH至3. 5 4. 5，加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，实现裂殖壶藻细胞的破壁和微藻油脂的提取；(2a)向步骤(I)得到的发酵液中加入生物絮凝剂，充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相；(2b)向步骤(2a)抽取混合油相后的发酵液中再次加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，静置分层后，抽取上层混合油相；(2c)将步骤(2a)和步骤(2b)得到的混合油相中的溶剂蒸发，得到藻毛油；(3)将步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油预热到8(T85°C，加入步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的O. 3^0. 5%的磷酸，酸化脱胶后，9(T95°C的水洗2飞次，得到脱胶后的脱胶藻毛油；所述每次水洗用的水的重量是步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的5 10%;在真空条件下，温度为10(T105°C，向脱胶后的藻毛油添加脱胶后藻毛油重量3^5%的活性炭或活性白土进行脱色，真空度为-O. 094mPa以下；将脱色后的藻毛油在温度为12(T280°C、真空度为-O. 094mPa以下，脱色2小时，得到富含DHA的微藻油脂，同时得
到部分游离脂肪酸。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(I)本发明采用自溶破壁技术，简化了裂殖壶藻破壁提取的工艺流程，降低了破壁操作时间，减少了设备投入，降低了成本；在水、藻、有机溶剂分层工艺中采用生物絮凝剂絮凝工艺，简化了破乳工艺流程，减少了分层工艺时间，提高了分层效果，同时避免了因破乳工艺造成的废水排放和水处理的负担，降低了水处理的成本；(3)本发明采用微藻破壁和油脂提取同时进行的工艺，实现了微藻细胞破壁和油脂提取同时进行，大大缩短了微藻油脂的破壁提取时间； (2)本发明采用物理精炼技术得到富含DHA的微藻油脂，降低了化学精炼的炼耗，工艺流程简单，产品稳定性好，原辅材料省，产量高，经济效益好，避免了中性油皂化损失，精炼效率高，产品稳定性好，可以直接获得高质量的副产品一脂肪酸，以及没有废水污染等诸多优点，特别是对于一些高酸值裂殖壶藻油脂的脱酸，其优越性更为突出。
下面结合附图并通过具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。图I :本发明从裂殖壶藻中提取油脂的工艺流程图。
具体实施例方式为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下实施例I采用裂殖壶藻安培罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养后，再转接入6m3发酵罐培养，其所属的培养基组成为葡萄糖100-130g，酵母膏15-30g，蛋白胨10-20g，磷酸二氢钾2_4g，硫酸镁1-38，微量元素复合液8-11!111，维生素复合液4-81111，用().5 X海水定容至IL ；所述的O. 5X海水是将I体积的海水与I体积的水混合得到。所述的微量元素复合液的制备方法如下Na2 · EDTA 6. 0g, FeCl3 · 6H20 O. 29g,H3BO3 6. 84g, MnCl2 · 4H20 0. 86g, ZnCl2 0. 06g, CoCl2 · 6H20 0. 026g, NiSO4 · 6H200. 052g,CuSO4 · 5H20 0. 002g, NaMoO4 · 2H20 0. 005g，用水定容至 1L。所述维生素复合液的制备方法如下维生素BI IOOmg,维生素B7 O. 5mg,维生素B12 O. 5mg，用水定容至IL0所述发酵培养的参数为温度25 30°C，pH值5. 5^7. 5，培养时间72、6h，所述发酵培养的参数优选为温度25°C，pH值6. 0，培养时间96h，溶氧10%。裂殖壶藻的发酵液4m3，用冰乙酸调节pH到4. 5。加入4m3正己烷，在55飞(TC，IOOrpm转速下搅拌4h，实现裂殖壶藻细胞的破壁，并同时提取微藻油脂，然后加入生物絮凝剂壳聚糖，使壳聚糖浓度保持在400mg/L。充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相，然后再次加入4m3正己烷，在55飞(TC，100rpm转速下搅拌lh，静置分层后，抽取上层混合油相。下层的藻渣通过固液分离，干燥后得到藻渣，可用于动物饲料使用。得到的混合油相，通过蒸发溶剂，得到藻毛油。
藻毛油精炼工艺采用技术先进的物理精炼工艺，具体参数如下脱胶工艺采用磷酸酸化脱胶工艺，藻毛油温度为8(T85°C，磷酸加入量为藻毛油重量的0. 5%，水洗时热水加入量为藻毛油重量的5%，水洗三次。脱色工艺温度为10(T105°C，活性白土添加量为脱胶藻毛油重量的5%，真空度(表压)为-0. 094mpa以下。脱酸/脱臭工艺温度为200°C，真空度(表压)为-0. 094mpa以下，时间为2h。通过上述工艺得到富含DHA的微藻油脂。测定发酵液生物量为50g/L，提取的总脂肪酸含量为30%，DHA含量(即DHA占总脂肪酸的比例)为43. 36%。
实施例2采用裂殖壶藻安培罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养后，再转接入6m3发酵罐培养，其所属的培养基组成为葡萄糖100-130g，酵母膏15-30g，蛋白胨10-20g，磷酸二氢钾2_4g，硫酸镁l_3g，微量元素复合液8-111111，维生素复合液4-81111，用0. 5 X海水定容至IL ；所述的0. 5X海水是将I体积的海水与I体积的水混合得到。所述的微量元素复合液的制备方法如下Na2 EDTA 6. 0g, FeCl3 6H200. 29g,H3BO3 6. 84g, MnCl2 4H20 0. 86g, ZnCl2 0. 06g, CoCl2 6H20 0. 026g, NiSO4 6H20 0. 052g,CuSO4 5H20 0. 002g, NaMoO4 2H20 0. 005g，用水定容至 1L。所述维生素复合液的制备方法如下维生素BI IOOmg,维生素B7 0. 5mg,维生素B12 0. 5mg，用水定容至1L。所述发酵培养的参数为温度25 30°C，pH值5. 5^7. 5，培养时间72、6h，所述发酵培养的参数优选为温度25°C，pH值6. 0，培养时间96h，溶氧10%。裂殖壶藻的发酵液4m3，用冰乙酸调节pH到3. 5。加入6m3正己烷，在55飞(TC，IOOrpm转速下搅拌4h，实现裂殖壶藻细胞的破壁，并同时提取微藻油脂，然后加入生物絮凝剂壳聚糖，使壳聚糖浓度保持在500mg/L。充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相，然后再次加入6m3正己烧,在55 60°C, IOOrpm转速下搅拌Ih,静置分层后,抽取上层混合油相。下层的藻渣通过固液分离，干燥后得到藻渣，可用于动物饲料使用。得到的混合油相，通过蒸发溶剂，得到藻毛油。藻毛油精炼工艺采用技术先进的物理精炼工艺，具体参数如下脱胶工艺采用磷酸酸化脱胶工艺，藻毛油温度为8(T85°C，磷酸加入量为藻毛油重量的0. 3%，水洗时热水加入量为藻毛油重量的5%，水洗三次。脱色工艺温度为10(T105°C，活性白土添加量为脱胶藻毛油重量的3%，真空度(表压)为-0. 094mpa以下。脱酸/脱臭工艺温度为280°C，真空度(表压)为-0. 094mpa以下，时间为2h。通过上述工艺得到富含DHA的微藻油脂。测定发酵液生物量为47g/L，提取的总脂肪酸含量为32%，DHA含量(即DHA占总脂肪酸的比例)为36.81%。实施例3采用裂殖壶藻安培罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养后，再转接入6m3发酵罐培养，其所属的培养基组成为葡萄糖100-130g，酵母膏15-30g，蛋白胨10-20g，磷酸二氢钾2_4g，硫酸镁l_3g，微量元素复合液8-111111，维生素复合液4-81111，用O. 5 X海水定容至IL ；所述的O. 5X海水是将I体积的海水与I体积的水混合得到。所述的微量元素复合液的制备方法如下Na2 · EDTA 6. 0g, FeCl3 · 6H20 O. 29g,H3BO3 6. 84g, MnCl2 · 4H20 0. 86g, ZnCl2 0. 06g, CoCl2 · 6H20 0. 026g, NiSO4 · 6H200. 052g,CuSO4 · 5H20 0. 002g, NaMoO4 · 2H20 0. 005g，用水定容至 IL ；所述维生素复合液的制备方法如下维生素BI IOOmg,维生素B7 O. 5mg,维生素B12 O. 5mg，用水定容至IL0所述发酵培养的参数为温度25 30°C，pH值5. 5 7. 5，培养时间72 96h，所述发酵培养的参数优选为温度25°C，pH值6. 0，培养时间96h，溶氧10%。 裂殖壶藻的发酵液4m3，用冰乙酸调节pH到3. 5。加入3. 2m3正己烷，在55飞(TC，IOOrpm转速下搅拌4h，实现裂殖壶藻细胞的破壁，并同时提取微藻油脂，然后加入生物絮凝剂壳聚糖，使壳聚糖浓度保持在500mg/L。充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相，然后再次加入3. 2m3正己烧,在55 60°C, IOOrpm转速下搅拌Ih,静置分层后,抽取上层混合油相。下层的藻渣通过固液分离，干燥后得到藻渣，可用于动物饲料使用。得到的混合油相，通过蒸发溶剂，得到藻毛油。藻毛油精炼工艺采用技术先进的物理精炼工艺，具体参数如下脱胶工艺采用磷酸酸化脱胶工艺，藻毛油温度为8(T85°C，磷酸加入量为藻毛油重量的O. 5%，水洗时热水加入量为藻毛油重量的5%，水洗三次。脱色工艺温度为10(T105°C，活性白土添加量为脱胶藻毛油重量的5%，真空度(表压)为-O. 094mpa以下。脱酸/脱臭工艺温度为260°C，真空度(表压)为-O. 094mpa以下，时间为2h。通过上述工艺得到富含DHA的微藻油脂。测定发酵液生物量为43g/L，提取的总脂肪酸含量为28%，DHA含量(即DHA占总脂肪酸的比例)为35. 73%。实施例4采用裂殖壶藻安培罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养后，再转接入6m3发酵罐培养，其所属的培养基组成为葡萄糖100-130g，酵母膏15-30g，蛋白胨10-20g，磷酸二氢钾2_4g，硫酸镁1-38，微量元素复合液8-11!111，维生素复合液4-81111，用().5 X海水定容至IL ；所述的O. 5X海水是将I体积的海水与I体积的水混合得到。所述的微量元素复合液的制备方法如下Na2 · EDTA 6. 0g, FeCl3 · 6H20 O. 29g,H3BO3 6. 84g, MnCl2 · 4H20 0. 86g, ZnCl2 0. 06g, CoCl2 · 6H20 0. 026g, NiSO4 · 6H200. 052g,CuSO4 · 5H20 0. 002g, NaMoO4 · 2H20 0. 005g，用水定容至 1L。所述维生素复合液的制备方法如下维生素BI IOOmg,维生素B7 O. 5mg,维生素B12 O. 5mg，用水定容至IL0所述发酵培养的参数为温度25 30°C，pH值5. 5^7. 5，培养时间72、6h，所述发酵培养的参数优选为温度25°C，pH值6. 0，培养时间96h，溶氧10%。裂殖壶藻的发酵液4m3，用柠檬酸调节pH到4. O。加入Sm3异己烷，在4(T50°C，SOrpm转速下搅拌6h，实现裂殖壶藻细胞的破壁，并同时提取微藻油脂，然后加入生物絮凝剂壳聚糖，使壳聚糖浓度保持在100mg/L。充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相，然后再次8m3异己烷，在4(T50°C，80rpm转速下搅拌0. 8h，静置分层后，抽取上层混合油相。下层的藻渣通过固液分离，干燥后得到藻渣，可用于动物饲料使用。得到的混合油相，通过蒸发溶剂，得到藻毛油。脱胶工艺采用磷酸酸化脱胶工艺，藻毛油温度为8(T85°C，磷酸加入量为藻毛油重量的0. 4%，水洗时热水加入量为藻毛油重量的10%，水洗两次。脱色工艺温度为10(T105°C，活性白土添加量为脱胶藻毛油重量的4%，真空度(表压)为-0. 094mpa以下。脱酸/脱臭工艺温度为120°C，真空度(表压)为-0. 094mpa以下，时间为I. 5h。通过上述工艺得到富含DHA的微藻油脂。
测定发酵液生物量为48g/L，提取的总脂肪酸含量为26%，DHA含量(即DHA占总脂肪酸的比例)为37. 25%。实施例5采用裂殖壶藻安培罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养后，再转接入6m3发酵罐培养，其所属的培养基组成为葡萄糖100-130g，酵母膏15-30g，蛋白胨10-20g，磷酸二氢钾2_4g，硫酸镁1-38，微量元素复合液8-111111，维生素复合液4-81111，用0. 5 X海水定容至IL ；所述的0. 5X海水是将I体积的海水与I体积的水混合得到。所述的微量元素复合液的制备方法如下Na2 EDTA 6. 0g, FeCl3 6H20 0. 29g,H3BO3 6. 84g, MnCl2 4H20 0. 86g, ZnCl2 0. 06g, CoCl2 6H20 0. 026g, NiSO4 6H200. 052g,CuSO4 5H20 0. 002g, NaMoO4 2H20 0. 005g，用水定容至 1L。所述维生素复合液的制备方法如下维生素BI lOOmg，维生素B7 0. 5mg，维生素B12 0. 5mg，用水定容至1L。所述发酵培养的参数为温度25 30°C，pH值5. 5^7. 5，培养时间72、6h，所述发酵培养的参数优选为温度25°C，pH值6. 0，培养时间96h，溶氧10%。裂殖壶藻的发酵液4m3,用朽1檬酸调节pH到4. O。加入5m3六号溶剂,在50 60°C,150rpm转速下搅拌2h，实现裂殖壶藻细胞的破壁，并同时提取微藻油脂，然后加入生物絮凝剂壳聚糖，使壳聚糖浓度保持在300mg/L。充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相，然后再次加入5m3六号溶剂，在5(T6(TC，150rpm转速下搅拌0. 5h，静置分层后，抽取上层混合油相。下层的藻渣通过固液分离，干燥后得到藻渣，可用于动物饲料使用。得到的混合油相，通过蒸发溶剂，得到藻毛油。脱胶工艺采用磷酸酸化脱胶工艺，藻毛油温度为8(T85°C，磷酸加入量为藻毛油重量的0. 4%，水洗时热水加入量为藻毛油重量的8%，水洗五次。脱色工艺温度为10(T105°C，活性白土添加量为脱胶藻毛油重量的4%，真空度(表压)为-0. 094mpa以下。脱酸/脱臭工艺温度为280°C，真空度(表压)为-0. 094mpa以下，时间为lh。通过上述工艺得到富含DHA的微藻油脂。测定发酵液生物量为39g/L，提取的总脂肪酸含量为24%，DHA含量(即DHA占总脂肪酸的比例)为38. 14%。申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.一种从裂殖壶藻中提取油脂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (1)调节裂殖壶藻发酵液的PH至酸性，加入有机溶剂，搅拌，实现裂殖壶藻细胞的破壁和微藻油脂的提取； (2)向步骤(I)得到的发酵液中加入絮凝剂絮凝处理后，采用有机溶剂萃取得到藻毛油； (3)藻毛油经脱胶，脱色，脱酸/脱臭，得到富含DHA的微藻油脂。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂为生物絮凝剂，优选壳聚糖。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述脱酸/脱臭采用真空脱酸 /脱臭工艺。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括如下步骤 (2a)向步骤(I)得到的发酵液中加入生物絮凝剂，充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相； (2b)向步骤(2a)抽取混合油相后的发酵液中再次加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，静置分层后，抽取上层混合油相； (2c)将步骤(2a)和步骤(2b)得到的混合油相中的溶剂蒸发，得到藻毛油。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(I)调节pH至3.5^4. 5，优选3. 7^4. 2 ； 优选地，步骤(I)采用酸调节pH值，所述酸选自盐酸、磷酸、醋酸或者柠檬酸中的任意一种或者至少两种的混合物； 优选地，步骤(I)在4(T60 °C下搅拌，优选在45 55 °C下搅拌； 优选地，步骤(I)和步骤(2b)中，有机溶剂的体积均为步骤(I)发酵液体积的O. 8^2倍，优选广I. 5倍； 优选地，所述有机溶剂选自六号溶剂、正己烷、异己烷或异戊烷中的任意一种或者至少两种的混合物。
6.如权利要求2-5之一所述的方法，其特征在于，所述生物絮凝剂的添加量为10(T500mg/L步骤(I)得到的发酵液，优选添加量为30(T500mg/L步骤(I)得到的发酵液。
7.如权利要求4-6之一所述的方法，其特征在于，所述搅拌的搅拌速率为8(Tl50rpm，优选90 140rpm,进一步优选100 130rpm ； 优选地，步骤(I)所述搅拌时间为2飞小时，优选2. 5^5. 5小时； 优选地，步骤(2b)所述搅拌时间为O. 5^1小时，优选O. 6小时 0. 9小时。
8.如权利要求4-7之一所述的方法，其特征在于，所述脱胶采用磷酸酸化脱胶工艺；优选地，所述磷酸酸化脱胶工艺为将步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油预热到8(T85°C，力口入步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的O. 3^0. 5%的磷酸，酸化脱胶后，9(T95°C的水洗2飞次，得到脱胶后的脱胶藻毛油；所述每次水洗用水的重量是步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的5 10% ； 优选地，所述脱色采用活性炭或活性白土脱色； 优选地，所述脱色工艺为在真空条件下，温度为10(T105°C，向脱胶后的藻毛油添加脱胶后藻毛油重量3 5%的活性炭或活性白土进行脱色，真空度为-O. 094mPa以下； 优选地，所述脱酸/脱臭采用真空脱酸/脱臭工艺，所述工艺为将脱色后的藻毛油在温度为12(T280°C、真空度为-O. 094mPa以下，脱色I 2小时；优选地，步骤(2b)抽取上层混合油相后，位于中层的藻渣通过固液分离，干燥后得到。
9.如权利要求4-8之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (I)调节裂殖壶藻发酵液的PH至3. 5^4. 5，加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，实现裂殖壶藻细胞的破壁和微藻油脂的提取； (2a)向步骤(I)得到的发酵液中加入生物絮凝剂，充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相； (2b)向步骤(2a)抽取混合油相后的发酵液中再次加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，静置分层后，抽取上层混合油相； (2c)将步骤(2a)和步骤(2b)得到的混合油相中的溶剂蒸发，得到藻毛油； (3)藻毛油经脱胶，脱色，脱酸/脱臭，得到富含DHA的微藻油脂。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (I)调节裂殖壶藻发酵液的PH至3. 5^4. 5，加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，实现裂殖壶藻细胞的破壁和微藻油脂的提取； (2a)向步骤(I)得到的发酵液中加入生物絮凝剂，充分搅匀后，静置分层，抽取上层混合油相； (2b)向步骤(2a)抽取混合油相后的发酵液中再次加入有机溶剂，在4(T60°C下搅拌，静置分层后，抽取上层混合油相，中层的藻渣通过固液分离，干燥后得到； (2c)将步骤(2a)和步骤(2b)得到的混合油相中的溶剂蒸发，得到藻毛油； (3)将步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油预热到8(T85°C，加入步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的O. 3^0. 5%的磷酸，酸化脱胶后，9(T95°C的水洗2飞次，得到脱胶后的脱胶藻毛油；所述每次水洗用水的重量是步骤(2)或步骤(2c)得到的藻毛油重量的5 10% ;在真空条件下，温度为10(T105°C，向脱胶后的藻毛油添加脱胶后藻毛油重量3 5%的活性炭或活性白土进行脱色，真空度为-O. 094mPa以下；将脱色后的藻毛油在温度为12(T280°C、真空度为-O. 094mPa以下，脱色f 2小时，得到富含DHA的微藻油脂，同时得到部分游离脂肪酸。
全文摘要
本发明公开了一种从裂殖壶藻中提取油脂的方法，所述方法包括如下步骤(1)调节裂殖壶藻发酵液的pH至酸性，加入有机溶剂，搅拌，实现裂殖壶藻细胞的破壁和微藻油脂的提取；(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入絮凝剂絮凝处理后，采用有机溶剂萃取得到藻毛油；(3)藻毛油经脱胶，脱色，脱酸/脱臭，得到富含DHA的微藻油脂。本发明采用自溶破壁技术，简化了裂殖壶藻破壁提取的工艺流程，降低了破壁操作时间，减少了设备投入，降低了成本；采用生物絮凝剂絮凝工艺，简化了破乳工艺流程，减少了分层工艺时间，提高了分层效果，同时避免了因破乳工艺造成的废水排放和水处理的负担，降低了水处理的成本。
文档编号C11B1/10GK102965182SQ201210491610
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者杜彦山, 张雨忠, 刘敏胜, 徐春保 申请人:新奥科技发展有限公司