专利名称：从表达外来基因的蚕的茧制丝的方法及使用该方法生成的产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于从表达外来基因的蚕的茧制丝的方法及可以通过该方法获得的产品。更具体而言，本发明涉及在从表达外来基因的蚕茧抽出蚕丝的步骤中在不导致表达外来基因的蚕茧特性丧失的同时进行茧干燥、煮茧和缫丝的技术。
背景技术：
活茧中的蚕蛹若任其自由则会变态成蚕蛾，挤穿由茧丝构成的茧壳的茧丝，并作为蚕蛾从茧壳脱出。由于这样会使茧无法缫丝，所以必须在蛾离开茧壳前将蛹杀死并干燥蚕茧。通常，通过设置初始温度至115°C或更高(在某些情况下至130°C或更高)，然后在5 至6小时内逐渐向下降低温度至60°C来干燥蚕茧。煮苗通常使用进行式煮苗机(progressive-type cocoon cooking machine)来进行。如下实施煮茧首先于约40°C的温度浸泡茧丝；然后实施高温渗透处理，包括高于 100°C的温度的蒸汽处理；接着进行低温渗透处理，包括将茧丝放置于约75°C的低温部中； 然后实施蒸汽接触处理，包括另一次蒸汽处理；此后进行调节处理，包括将温度从沸腾温度逐渐降低至约60°C等。如此，在煮茧中，通过用蒸汽、近沸腾热水、和低温水组合处理来实施蒸汽和热水进出茧腔(cocoon cavity)的转移。这导致茧层丝胶蛋白(一种包被茧丝的水溶性蛋白质)的膨胀和软化，而且改善茧丝自茧的分离。在缫丝(reeling)中，通过索绪(brushing)抽出细丝末端，索绪即使用稻穗尖端从大约90°C温度的热水中放置的茧抽出细丝末端。此类常规制丝方法中，蚕丝蛋白质遭受高温所致的热变性。结果导致蚕丝的染料亲和力和织物质地受到损害。近几年来在进行含有外来蛋白质的蚕茧的生产，对在不损害外来蛋白质特性的同时从茧产生生丝的技术存在需求。下文列示本发明的现有技术文件。[现有技术文件][专利文件][专利 文件 1]Low-Temperature Chemical Cocoon Boiling Apparatus Matsumoto, Τ.，Masago, Y.，Katsuno Μ.日本实用新型申请公布号 S55-11197[专利文件 2]Vacuum Cocoon Boiler :Nishio，Μ·(授权 / 登记)日本专利号 S49-13926发明概述本发明要解决的问题本发明是鉴于上述情况完成的。本发明的目的是提供一种用于在不损害外来蛋白质特性、且不使丝心蛋白蛋白质和丝胶蛋白蛋白质遭受热变性的同时，从表达外来基因的蚕茧产生生丝的方法。用于解决问题的手段为了解决上文所提及的问题，本发明人尝试了在比那些常规使用的温度条件低的温度条件(大约80°C或更低)下，而不是迄今为止在从茧生成生丝时使用的高于100°C的条件下进行茧的干燥。此外，在煮茧中，尝试了在低于常规温度的温度且在真空条件(减压处理)下的渗透处理，而不是常规采用的于100°c或更高的高温蒸汽处理或用近沸点热水的处理。作为一种备选的茧煮沸方法，尝试了进行组合处理，包括利用碱使丝胶蛋白膨胀， 并借助表面活性剂、酶等使热水渗透入茧层中。此外，本发明人尝试了在比常规温度低的温度进行缫丝。结果，本发明人发现，可以在不损害表达外来基因的蚕茧中所含的外来蛋白质的特性且不使丝心蛋白蛋白质和丝胶蛋白蛋白质遭受热变性的同时，从丝腺中表达外来基因的蚕茧生成生丝。本发明基于该发现，提供了下文所描述的[1]至[18][1], 一种从由转基因蚕所结的茧产生生丝的方法，其中该方法包括使用包含碱剂、表面活性剂、酶等中的至少一种的低温溶液来进行真空渗透。[2], [1]的方法，其中该方法包括下列步骤(a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中浸泡步骤(a)的茧；(c)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(b) 的茧；(d)使步骤(C)的茧真空脱水；(e)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(d) 的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；以及(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。[3], [2]的方法，其中在步骤(a)中，在大约80°C或更低的条件下干燥所述茧。[4], [2]的方法，其中在步骤(a)中，在真空条件下干燥所述茧。[5], [1]至W]中任一项的方法，其中所述碱剂选自下组碳酸钠和碳酸氢钠；所述表面活性剂选自下组非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、和两性表面活性剂；而所述酶是蛋白酶。[6], 一种从由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧产生生丝的方法，其中该方法包括下列步骤(a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在低温温水(大约80°C或更低)中浸泡步骤(a)的茧；(c)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(b)的茧；(d)使步骤(C)的茧真空脱水；(e)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(d)的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。[7], [6]的方法，其中在步骤(a)中，在大约80°C或更低的条件下干燥所述茧。[8], [6]的方法，其中在步骤(a)中，在真空条件下干燥所述茧。[9], [1]至[8]中任一项的方法，其中所述外来蛋白质选自下组荧光蛋白质、具有细胞附着活性的蛋白质、主要包含酸性和碱性氨基酸的肽、和源自非蚕生物的丝心蛋白蛋白质和丝胶蛋白蛋白质。[10].可以通过[1]至[9]中任一项的方法获得的生丝。[11].可以自[10]的生丝获得的针织或梭织织物。[12].可以自[10]的生丝获得的三维结构。[13].自[10]的生丝制成的医学材料。[14]. [13]的医学材料，其选自下组手术缝合线、人工血管、人工皮肤、人工腱、 人工骨、和角膜培养的薄膜。[15]. —种产生经遗传工程化改造的生丝的方法，其中该方法包括下列步骤(a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中浸泡步骤(a)的茧；(c)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(b) 的茧；(d)使步骤(C)的茧真空脱水；(e)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(d) 的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。[16]. —种产生经遗传工程化改造的生丝的方法，其中该方法包括下列步骤(a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在低温温水(大约80°C或更低)中浸泡步骤(a)的茧；(c)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(b)的茧；(d)使步骤(C)的茧真空脱水；(e)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(d)的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。[17]. [15]或[16]的方法，其中在步骤(a)中在大约80°C或更低的条件下干燥所述苗。[18]. [15]或[16]的方法，其中在步骤(a)中在真空条件下干燥所述茧。附图简述
图1描绘了显示茧的干燥百分比的时间过程变化的图。图2描绘了丝腺中表达外来基因的蚕茧的煮茧的实例。图3显示了标示使用荧光转基因茧丝作为内部辅助材料的照片。图4显示了自具有细胞附着特性的转基因茧丝制成的人工血管的照片。图5显示了显示将自转基因茧丝制成的人工血管材料和自PTFE(Teflon 型树脂)制成的人工血管材料移植入大鼠后的状态的照片。图6显示了显示将自转基因茧丝制成的人工血管材料和自PTFE(Teflon 型树脂)生成的人工血管材料移植入大鼠后3个月的状况的照片。
发明详述本发明涉及用于自由丝腺中含有外来蛋白质的转基因蚕所结的茧产生生丝的方法，其包括使用包含碱剂、表面活性剂、酶等中的至少一种的低温溶液进行真空渗透。本发明还涉及用于产生经遗传工程化改造的生丝的方法。更具体而言，本发明涉及用于自由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧产生生丝的方法，其包括下列步骤。本发明还涉及用于产生经遗传工程化改造的生丝的方法， 其包括下列步骤(a)在大约80°C或更低的条件下、在真空条件下、或在常温且在真空条件下干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中浸泡步骤(a)的茧；(c)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(b) 的茧；(d)使步骤(C)的茧真空脱水；(e)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(d) 的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。(1)由转基因蚕所结的茧在本发明中，获得丝腺中含有外来蛋白质的转基因蚕。丝腺中含有外来蛋白质的转基因蚕可以例如通过将编码外来蛋白质的DNA与编码后丝腺中特异性表达的蛋白质的 DNA(例如编码丝心蛋白H链或L链蛋白的基因)连接，然后生成携带此融合基因的转基因蚕来获得。本领域技术人员可以依照下列文件中所描述的已知方法，例如遵循下列文件中所披露的内容来生成并获得丝腺中含有外来蛋白质的转基因蚕。然而，方法不限于此。·日本专利申请特开2006-137739(未审查、公布的日本专利申请)· WO 2008/081922· Tamura, T. , Thibert, C. , Royer, C. , Kanda, Τ. , Abraham, Ε. , Kamba, Μ. , Komoto, N. , Thomas, J. L. , Mauchamp, B. , Chavancy, G. , Shirk, P. , Fraser, Μ. , Prudhomme, J. C., Couble, P. , Toshiki, Τ. , Chantal, Τ. , Corinne, R. , Toshio, K. , Eappen, Α. , Mari, K., Natuo, K. , Jean—Luc, Τ. , Bernard, Μ. , Gerard, C. , Paul, S. , Malcolm, F. , Jean-Claude, P.禾口Pierre,C. (2000)Germline transfirmation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol,18,81-84*Tomita,M. ,Munetsuna, H. , Sato, Τ. , Adachi, Τ. , Hino, R. , Hayashi,M. , Shimizu, K. , Nakamura, N. , Tamura, T.禾口 Yoshizato, K. (2003)Transgenicsilkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. NatBiotechnol, 21,52-56· Yamao, Μ. , Katayama, N. , Nakazawa, H. , Yamakawa, Μ. , Hayashi, Y. , Hara, S., Kamei,K.禾口Mori,H. (1999)Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev, 13,511-516· Kojima K. , Kuwana Y. , Sezutsu H. , Kobayashi I. , Uchino K. , Tamura Τ.,Tamada Y. (2007)New Method for Modification of Fibroin Heavy Chain Protein in Transgenic Silkworm. Biosci Biotechnol Biochem· 71，2943—2951· Kurihara H.，Sezutsu H.，Tamura Τ.，Yamada K. (2007) Production of an active feline interferon in the cocoon of transgenic silkworms using the fibroin H—chain expression system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 355,976-980· Tamura, T.，Kuwabara, K.，Uchino，K.，Kobayashi，I.禾口 Kanda，Τ. (2007) An Improved DNA Injection Method for Silkworm Eggs Drastically Increases the Efficiency of Producing Transgenic Silkworms. J. Insect Biotechnol. Sericol. 76， 155-159· Yanagisawa S.，Zhu Ζ.，Kobayashi I.，Uchino K.，Tamada Y.，Tamura Τ.， Asakura Τ. (2007)Improving Cell-Adhesive Properties of Recombinant Bombyx mori Silk by Incorporation of Collagen or Fibronectin Derived Peptides Produced by Transgenic Silkworms. Biomacromolecules 8 (11)，3487-3492 等。本发明的转基因蚕在丝腺中具有外来蛋白质。丝腺中含有的外来蛋白质的例子包括荧光蛋白质/色蛋白诸如CFP、GFP、YFP、DsRed, K0、KikGr, KaedeJP Dronpa ；具有细胞附着活性的蛋白质诸如胶原和纤连蛋白、和细胞生长因子；主要含有酸性和碱性氨基酸诸如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、和组氨酸的肽；和源自非蚕生物诸如蜘蛛、野生蚕天蚕(Antheraea yamamai)、和珍珠贝(pearl shell)的丝心蛋白蛋白质和丝胶蛋白蛋白质、 和源自其一级结构的肽；但是不限于此。若可以获得丝腺中含有外来蛋白质的转基因蚕，则本领域技术人员可以容易地由此蚕获得茧。(2)茧的干燥在本发明中，将丝腺中含有外来蛋白质的转基因蚕所结的茧在大约80°C或更低 (例子包括 79 V、78°C、77°C、76°C、75°C、74°C、73°C、72°C、和 71 °C，但不限于此)的温度条件下干燥。更优选地70°C或更低，甚至更优选地60°C以上及70°C以下(例子包括61°C、 62 °C、63 °C、64°C、65 °C、66 °C、67 °C、68 °C、和 69 °C，但不限于此)，且特别优选地 55 °C 以上及 65°C或以下(例子包括 56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、和 64°C，但不限于此)的温度条件下干燥茧。在使用热空气型干燥器的茧干燥外，也可以使用真空型干燥器或微波(电磁波)。茧干燥的程度随种类和特征而有所不同，但是干燥直至达到干燥百分比36%至 44% (例子包括 36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、和 44%，但不限于此)是优选的。或者，干燥20至24小时左右(例子包括20小时、21小时、22小时、23小时、和24小时，但不限于此)是优选的。本领域技术人员可以依照茧的特征适当地确定干燥百分比。例如，对于普通的蚕茧诸如“ shunrei χ syogetsu，，，42 %至43 %的干燥百分比是合适的，但是当蛹的重量相对于茧层的重量而言较重时，可以选择较低的干燥百分比(例如36%至38% 左右的干燥百分比变为可能)。在本发明中，优选在恒定的温度条件下实施茧干燥。在本发明中，还有可能在真空条件下，或在正常温度且在真空条件下干燥由丝腺中含有外来蛋白质的转基因蚕所结的茧，代替在大约80°C或更低的条件下干燥它们。在 80°C或更低、在真空条件下、或在正常温度且在真空条件下的干燥，如上文所描述地，可以使用热空气型干燥器，或者利用真空型干燥器或微波(电磁波)来实施。例如，当于恒定温度60°C干燥茧时，如图1中所显示的，可以花费约M小时来达到大约45%的干燥百分比。 因此，能够如此获得的茧可以不生霉地贮存。在通过此类方法干燥茧时，必须从干燥器快速排出来自蛹的水分。这是因为如果干燥器内部充满水分，茧丝分离会变差。在通过产生真空同时提高温度来在真空条件下干燥时，可以比仅通过热空气干燥更高效地实现干燥。(3) &铺■剂、胃碰_、_白棚夜Φ胃泡I在本发明中，在含有碱剂、表面活性剂、酶等中的至少一种的溶液中浸泡茧。更优选地，在含有碱剂和表面活性剂的溶液中，或在含有酶和表面活性剂的溶液中浸泡茧。本发明的碱剂的例子包括碳酸钠和碳酸氢钠，但不限于此。此外，本发明的表面活性剂的例子包括非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、和两性表面活性剂，但不限于此。非离子型表面活性剂的例子包括聚氧乙烯烷基醚、山梨聚糖脂肪酸酯、烷基多聚葡萄糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、和烷基单甘油酯，但不限于此。阴离子型表面活性剂的例子包括脂肪酸钠、单烷基硫酸酯、烷基聚氧乙烯硫酸酯、 烷基苯磺酸酯、和单烷基磷酸酯，但不限于此。阳离子型表面活性剂的例子包括烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、和烷基苄基二甲基铵盐，但不限于此。两性表面活性剂的例子包括烷基二甲基氧化胺和烷基羧基甜菜碱，但不限于此。
此外，本发明的酶包括蛋白酶，但不限于此。蛋白酶的例子包括丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、木瓜蛋白酶、和碱性蛋白酶(alkalase)，但不限于此。可以例如如下实施浸泡处理，但其不限于此。将放置在金属篮中的茧在例如 0. 15%碳酸钠和0. 3%非离子型表面活性剂的混合溶液(处理水)中浸泡20分钟。这导致水分可以浸入茧层表面中的条件。本领域技术人员可以依照茧的特性适当地调节碳酸钠和表面活性剂的浓度和处理时间。在本发明中，含有酶和表面活性剂的溶液是更优选的。酶和表面活性剂的组合的例子包括可以由本文中所描述的酶和表面活性剂规定的各种组合。(4)在含有碱齐H、表g活+牛齐Ι|、_等的溶液中的真空渗诱在本发明中，在含有碱剂、表面活性剂、和酶中的至少一项的溶液中对蚕茧进行真空渗透。更优选地，在含有碱剂和表面活性剂的溶液，或含有酶和表面活性剂的溶液中浸泡蚕茧。碱剂、表面活性剂、和酶的例子是那些在上文所提及的。可以例如通过如下方法实施真空渗透处理(低压渗透处理)。将接受浸泡处理的茧在仍处于处理水中的状态下转移至真空装置，并产生真空。合适的真空度(vacuumizing degree)是-620mmHg 左右(例如 _640mmHg 至 _600mmHg，或更优选地-630mmHg 至-6IOmmHg 等)，但不限于此。例如当真空度达到-620mmHg时，历时5至10分钟将压力恢复至正常压力。这样，处理水由于茧腔内部和外部间的压力差而逐渐渗透入茧层中。若在此点突然恢复压力，则处理水会试图立即进入茧腔，茧可能由于压力差异而崩溃。此外，因为处理水会通过茧层的薄的部分或茧层的容易透过的部分，所以有可能无法获得均勻煮沸的茧。因此，应
9当避免突然的压力恢复。本领域技术人员可以依照茧的特性来设置合适的压力恢复时间。在本发明中，当上述浸泡处理在含有碱剂和表面活性剂的溶液中进行时，优选地， 真空渗透处理也使用含有碱剂和表面活性剂的溶液来实施。此外，当上述浸泡处理在含有酶和表面活性剂的溶液中进行时，优选地，真空渗透处理也使用含有酶和表面活性剂的溶液来实施。在本发明中，真空不限于绝对真空，而且还包括减压。(5)真空脱水在本发明中，使用含有碱剂、表面活性剂、和酶中的至少一项的溶液进行渗透后， 在真空中对蚕茧进行脱水。用于真空脱水的方法没有特别限制，但是例如可以通过如下方法在真空中对茧进行脱水。将接受过真空渗透处理的茧从处理水中取出，并使用真空装置来进行真空处理。与上文所描述的内容相似，真空度优选设置于-620mmHg左右(例子包括但不限于-640mmHg至-600mmHg，或更优选地-630mmHg至-610mmHg)，但不限于此。优选地， 此真空处理是逐渐实施的，例如历时5至10分钟。通过逐渐地实施真空处理，可以逐渐地将茧腔中的处理水排出至茧层外。若突然实施真空处理，则溶液会穿透茧层的薄部分或容易透过的空间，可能导致无法进行均勻的煮茧处理。(6) &铺碱剂、胃碰_、_白棚夜雜诱在本发明中，将真空中脱水后的茧在含有碱剂和表面活性剂的溶液，或含有酶和表面活性剂的溶液中再次进行真空渗透处理。真空渗透处理可以通过例如上文所描述的方法来实施，但其不限于此。通过重复真空渗透和真空脱水，可以提高茧丝的解离(dissociative)特性。另一方面，重复真空渗透和真空脱水也具有不利的影响，诸如增加首次索绪的废料和降低生丝产率。因此，依照茧的特性来调节真空渗透和真空脱水的次数是至关重要的。例如，将真空渗透、真空脱水、和真空渗透的循环实施一次或者重复两次。如在上文中所述的那样，对于此处理而言，同样在通过真空处理来使处理水渗透入茧腔中的过程中优选地随时间逐渐将压力从真空状态恢复至正常压力。相似地，在通过真空处理将处理水从茧腔内部排出至外部时，优选地，花费时间来完成向真空状态的转变。在煮茧处理中，逐渐膨胀并软化茧层中茧丝胶着点处的丝胶蛋白是重要的。在本发明中，碱剂、酶等承担膨胀和软化丝胶蛋白的作用，而表面活性剂担当渗透入茧层中的茧丝胶着点中的作用。当使用含有碱基和表面活性剂的溶液来实施上述浸泡处理和真空渗透处理时，优选地，真空渗透处理也通过使用含有碱基和表面活性剂的溶液来重复实施。或者，当使用含有酶和表面活性剂的溶液来实施上述浸泡处理和真空渗透处理时，优选地，真空渗透处理也通过使用含有酶和表面活性剂的溶液来重复实施。(7)在水中浸泡茧在本发明的方法中，接着，在水中浸泡茧。通过到(6)为止的煮茧处理所获得的茧表面覆盖着碱。若置之不理，则丝胶蛋白由于粘附于茧层表面的碱而趋于膨胀，并且索绪废料会增加。因此，在正常温度的水中浸泡以收敛(converge)茧层表面上的丝胶蛋白是必要的。在水中浸泡茧，直至粘附于茧层表面的碱被除去，且茧层表面上的丝胶蛋白收敛(例如 10至20分钟左右)。
(8)缫丝在本发明中，在60°C或更低的温度下实施缫丝。更优选地于50°C或更低，且甚至更优选地在；35 V至45 V的条件下(例如包括；35 V、36°C、37 V、38°C、39°C、40°C、41°C、 42°〇、431、441、和451，但不限于此)实施缫丝。缫丝可以使用自动缫丝机、多头缫丝机 (multi-end reeling machine)、$#云力||@丰；1^$11。缫丝包括从通过上文所提及的方法进行茧层丝胶蛋白膨胀和软化的茧抽出茧丝， 并将数根这样的细丝与丝胶蛋白耦合来生成单股生丝。缫丝前，在大约80°C或更低的温水中用索绪帚(一束稻穗)摩擦茧表面，并在抽出数股茧丝(这称为索绪(brushing))后，进一步将细丝抽出，直至细丝的单一末端露出，该末端就成为正确的茧丝末端(这称为理绪 (picking end))。将从茧(茧丝末端正确的茧)抽出的几股茧丝集中起来到期望的粗度， 并将其穿过集绪器(cocoon filament guide button)(例如由陶瓷等制成，具有钮扣形状， 在中央具有小洞)。将如此获得的生丝通过集绪器上的两个离合轮返回到集绪器附近，将其与刚刚从集绪器产生的细丝线捻合在一起(这称作kennel捻丝)后，缠绕在卷轴(reel) 上。手动缫丝机和多端缫丝机依照想要的细度(fineness)使用一定数目的茧(恒定数目的茧)进行缫丝，而自动缫丝机使用细度检测仪来调节细度，使得粗度是恒定的(恒定的丝大小)°关于缫丝，可以参考文献(Sogo Sanshigaku(General Sericultural Science),Nihon Sanshi Gakkai (Japanese Society of Sericultural Science)编第 358 页-第 369 页， 1979 ^Nihon Seishi Gijyutsu Shi (History of Japanese Reeling Technology)Kato, S.第 59 页-第 144 页，1976)。此外，本发明提供了用于从由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧产生生丝的方法，其包括下列(a)至(g)的步骤。本发明还提供了用于生成经遗传工程化改造的生丝的方法，其包括下列(a)至(g)的步骤(a)在大约80°C或更低的条件下、在真空条件下、或在正常温度且在真空条件下干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在低温温水(大约80°C或更低)中浸泡步骤(a)的茧；(c)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(b)的茧；(d)使步骤(C)的茧真空脱水；(e)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(d)的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。在上述方法中，获得转基因蚕的茧、茧干燥、在低温温水中浸泡茧、茧的真空渗透、 茧的真空脱水、茧的水中浸泡、和自茧缫丝都可以通过上文所描述的方法来实施。在本发明中，使用80°C或更低(例子包括79°C、78°C、77°C、76°C、75°C、74°C、 73°C、72°C、和71°C，但不限于此)的低温温水，更优选地70°C或更低(例子包括69°C、 68 °C、67 °C、66 °C、65 °C、64°C、63 °C、62 °C、和61°C，但不限于此)的低温温水，甚至更优选地 55 0C或更高和60 °C或更高(例子包括56 °C、57 °C、58 °C、和59 V，但不限于此)的低温温水。此外，本发明提供了可以通过上文所提及的方法获得的生丝。此外，本发明提供了可以自生丝获得的针织织物或梭织织物。另外，本发明提供了可以自生丝获得的三维结构。 三维结构的例子包括灯罩、连衣套装(one-piece suit)、外套、披肩等西式服饰、日本服装(和服)、日本腰带(宽腰带)、西式服装、面板(panel)、壁纸、椅子座席、名片、和书的表装 (binding)，但不限于此。灯罩、连衣套装、外套、披肩等西式服饰、日本服装(和服)、日本腰带(宽腰带)、西式服装、面板、壁纸、椅子座席、名片、和书的表装等可以通过公知的方法来生产。此外，本发明提供了可以通过本发明的方法获得的自生丝生成的医学材料。医学材料的例子包括手术缝合线、人工血管、人工皮肤、人工腱、人工骨、和角膜培养薄膜，但不限于此。可以通过本领域技术人员已知的方法来实施医学材料中使用的本发明生丝的加工。通过提及而将本说明书中所引用的所有在先技术参考文献收入本文。 实施例在下文中，本发明会具体参照实施例进行描述，但是不应解释为局限于此。[实施例1]使用丝腺中表达外来基因的蚕茧进行制丝1.方法1. 1干燥步骤通常，在经过了约5. 5小时后，干燥方法将温度从115°C至120°C的最大温度逐渐降低至60°C。这会得到大约42%的干燥百分比。然而，在此实施例中，不使用温度梯度，而将茧放置于60°C恒定温度维持的干燥器中，并在20至M小时内干燥。结果，获得了期望的干燥百分比(图1)。1. 2煮茧步骤在本发明中，为了在低温(60°C或更低)条件下膨胀并软化茧层丝胶蛋白，使用碱剂、表面活性剂、酶等来实施煮茧。下面给出使用碱剂和表面活性剂的实施例。首先，生成0. 1 %至0. 4%碳酸钠和0. 2%至0. 4%非离子型表面活性剂的溶液，并将表达外来基因的蚕的茧在其中浸泡20分钟。然后，将在真空容器中抽真空至-600mmHg， 使其在此状态下放置，然后将压力逐渐恢复以引起溶液向茧腔中的逐渐渗透。此后，从真空容器中的溶液取出茧，并以此状态创建真空条件以使茧腔中的溶液脱水。这使得溶液渗透茧层茧丝的格子结构，从而使得导致茧丝胶着的丝胶蛋白得以膨胀和软化。然后，再次将茧放进溶液中，再次创造真空条件，并将溶液渗透入茧腔中，并在完成后，使用正常温度的水来收敛丝胶蛋白。图2中显示了上文所提及的步骤。1. 3缫丝步骤通常，为了从茧引出索绪废料，将茧放置在85°C至90°C的热水中，并当膨胀并软化茧层表面上的丝胶蛋白的同时使用索绪帚来实施抽出茧丝的处理。此外，在缫丝中，自 40°C的缫丝槽(reeling basin)中的煮熟茧分离茧丝，并在大约60°C的气氛下将生丝缠绕在卷轴上。在本发明中，在进行索绪和缫丝时，索绪温度和缫丝槽温度是50°C，而卷轴部分的温度是40°C。2.结果表1显示了使用丝腺中表达外来基因的蚕茧来实施缫丝的结果。常规地，通过于60°C或更低的低温缫丝来实施缫丝是不可能的，但是通过使用本发明的方法使其变得可能。
表 权利要求
1.一种从转基因蚕所结的茧产生生丝的方法，其中该方法包括使用包含碱剂、表面活性剂、酶等中的至少一种的低温溶液来进行真空渗透。
2.权利要求1的方法，其中该方法包括下列步骤(a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中浸泡步骤(a)的茧；(c)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(b)的茧；(d)使步骤(c)的茧真空脱水；(e)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(d)的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；以及(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。
3.权利要求2的方法，其中在步骤(a)中，在大约80°C或更低的条件下干燥所述茧。
4.权利要求2的方法，其中在步骤(a)中，在真空条件下干燥所述茧。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述碱剂选自下组碳酸钠和碳酸氢钠；所述表面活性剂选自下组非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、 和两性表面活性剂；而所述酶是蛋白酶。
6.一种从在丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧产生生丝的方法，其中该方法包括下列步骤(a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在低温温水(大约80°C或更低)中浸泡步骤(a)的茧；(c)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(b)的茧；(d)使步骤(c)的茧真空脱水；(e)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(d)的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。
7.权利要求6的方法，其中在步骤(a)中，在大约80°C或更低的条件下干燥所述茧。
8.权利要求6的方法，其中在步骤(a)中，在真空条件下干燥所述茧。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述外来蛋白质选自下组荧光蛋白质、具有细胞附着活性的蛋白质、主要包含酸性和碱性氨基酸的肽、和源自非蚕生物的丝心蛋白蛋白质和丝胶蛋白蛋白质。
10.可以通过权利要求1至9中任一项的方法获得的生丝。
11.可以自权利要求10的生丝获得的针织或梭织织物。
12.可以自权利要求10的生丝获得的三维结构。
13.自权利要求10的生丝制成的医学材料。
14.权利要求13的医学材料，其选自下组手术缝合线、人工血管、人工皮肤、人工腱、 人工骨、和角膜培养的薄膜。
15.一种产生经遗传工程化改造的生丝的方法，其中该方法包括下列步骤 (a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中浸泡步骤(a)的茧；(c)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(b)的茧；(d)使步骤(c)的茧真空脱水；(e)在包含碱剂和表面活性剂或包含酶和表面活性剂的溶液中真空渗透步骤(d)的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。
16.一种产生经遗传工程化改造的生丝的方法，其中该方法包括下列步骤(a)干燥由丝腺中包含外来蛋白质的转基因蚕所结的茧；(b)在低温温水(大约80°C或更低)中浸泡步骤(a)的茧；(c)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(b)的茧；(d)使步骤(c)的茧真空脱水；(e)在低温温水(大约80°C或更低)中真空渗透步骤(d)的茧；(f)在水中浸泡步骤(e)的茧；并(g)在低温(大约50°C或更低)条件下自步骤(f)的茧缫丝。
17.权利要求15或16的方法，其中在步骤(a)中在大约80°C或更低的条件下干燥所述苗。
18.权利要求15或16的方法，其中在步骤(a)中在真空条件下干燥所述茧。
全文摘要
在低温(60℃或更低)条件下，而不是在从茧生成生丝时常规采用的高于100℃的温度的条件下干燥茧。此外，通过于低温进行真空渗透处理(减压处理)，而不是常规采用的100℃以上的高温处理或者用接近沸点的热水处理来实施煮茧。作为一种替代的煮茧方法，实施组合处理，其包括用碱使丝胶蛋白膨胀，并利用表面活性剂、酶等使热水渗透入茧层中。此外，在比常规采用的温度更低的温度进行缫丝。结果发现，可以从表达外来基因的蚕茧生成生丝而不损害该蚕茧中所含的外来蛋白质的特性。
文档编号D01F9/18GK102257192SQ20098015079
公开日2011年11月23日 申请日期2009年10月19日 优先权日2008年10月20日
发明者中村敬, 吉井圭, 唐泽智司, 宫崎荣子, 宫胁敦史, 山口纯次, 山田胜成, 朝仓哲郎, 木下晴夫, 栗原宏征, 桑原伸夫, 瀬筒秀树, 田村俊树, 町井博明, 立松谦一郎, 青木里步, 饭塚哲也, 高林千幸 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所