专利名称：可代谢己烯雌酚的假单胞菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说是可代谢己烯雌酚的假单胞菌及其应用。
背景技术：
己烯雌酌·(DES, Diethylstilbestrol),化学名为 4,4 (I, 2_ 二乙基-I, 2_ 亚乙烯基)双苯酚，是一种人工合成的非留体雌激素类药物，能促使女性器官及副性征正常发育，促使子宫内膜增生，增强子宫收缩，提高子宫催产素的敏感性；小剂量刺激而大剂量抑制垂体前叶促性腺激素及催乳素的分泌。20世纪70年代后期，由于发现DES具有生殖和遗传毒性(包括致癌和致畸作用)，美国自1959年就开始限制DES应用于畜禽饲养，并于1979年正式禁止作为添加剂应用于畜禽生产中，在动物源性食品中不得检出。1998年，欧盟也禁止使用DES作为牲畜促生长剂，并且在进口动物食品中严格监控其残留。我国也于2002年禁·止己烯雌酚及其酯类在动物源性食品中的应用。但是，目前DES仍然被大量的用于动物饲料添加剂。DES通过药物代谢等途径排出体外，进入到环境中严重污染水源和土壤环境。环境中的DES能通过食物链形式又重新危害人体和污染环境，形成恶性循环。己烯雌酚在环境中的残留易致儿童性早熟、生长发育迟缓、男子女性化，而女性易发生乳腺癌、卵巢癌等。现在关于处理和降解环境中己烯雌酚的研究相对较少，已经发展的关于己烯雌酚的降解有利用铁草酸盐体系对DES进行光氧化、紫外杀菌灯对水中DES进行直接光降解等方法。有关利用环境中的微生物降解己烯雌酚的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用细菌自身的代谢，降低环境中己烯雌酚的浓度的假单胞菌及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种可代谢己烯雌酚的假单胞菌可代谢己烯雌酚的假单胞菌(Pseudomonassp. )J61，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为 2011 年 04 月 28 日；编号为 CGMCC No. 4705。可代谢己烯雌酚的假单胞菌的应用可代谢己烯雌酚的假单胞能够降解己烯雌酚。所述假单胞降解己烯雌酚的降解步骤为(I) J61种子培养将假单胞菌培养在LB培养基中，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min，培养时间为10_16h ；(2) J61降解己烯雌酚将步骤⑴中的J61菌体按起始浓度I. OX 108CFU/ml接种于含有己烯雌酚的最小培养基中进行培养，而后将培养物的上清液通过高效液相色谱(HPLC)检测剩余己烯雌酚的量，即可得到假单胞菌降解己烯雌酚的效率。所述HPLC的检测方法为液相色谱仪skyray LC-310液相色谱系统；色谱柱Waters C18反向柱4· 6X 250mm，粒度5 μ m ;检测条件为流动相，V(甲醇)V(水)=85 15 ;进样量为20 μ L ;温度为25°C ;紫外检测器检测参数为检测波长280nm。所述LB培养基为每升水中加入IOg胰蛋白胨，5g酵母浸膏和IOg氯化钠。所述最小培养基的配方为每升水中加入1360mg磷酸二氢钾，1780mg磷酸氢二钠，500. 08mg硫酸镁，500mg氯化铵,0. Img氢氧化招,O. 05mg 二氧化锡,O. 05mg碘化钾，
O.05mg氯化锂,O. 05mg硼酸,O. Img硫酸锌,O. Olmg氯化钴,O. Olmg硫酸镍,O. 05mg氯化钡和 O. 05mg 钥酸铵，ρΗ，7·2±0· I。在含有己烯雌酚的最小培养基中进行培养的假单胞菌，取其上清液，加入等体积的乙醇，室温静止IOmin,在13，OOOrpm转速下离心5min,上清用O. 22 μ m的滤膜过滤待用。与现有技术相比，本发明的积极效果是·
目前，通过细菌代谢过程降解环境污染物在重金属富集、有机污染的降解和石油降解中均有应用。该假单胞菌降解环境中的己烯雌酚，具有降解速度快、费用低、操作步骤简单等优点，为彻底清除环境中的己烯雌酚残留提供了较好的思路。
图I为本发明实施例提供的利用本发明的假单胞菌CGMCC No. 4705处理前后己烯雌酚浓度的HPLC谱图。图2为本发明实施例提供的假单胞菌J61的16S rDNA的序列。图3为本发明实施例提供的假单胞菌J61降解己烯雌粉后，培养液上清中己烯雌酚的相对残留量随时间的变化。图中，横坐标为天数，纵坐标为己烯雌酚的相对残留量。(■，未接种细菌的溶液中己烯雌酚的相对残留；口，接种假单胞菌J61后培养液中己烯雌酚的相对残留量)。图4为本发明实施例提供的假单胞菌J61降解不同浓度的己烯雌酚的降解效率。图中，横坐标为天数，纵坐标为己烯雌酚的相对降解效率。图5为本发明实施例提供的假单胞菌J61在不同pH环境下降解己烯雌酚的效率。图中，横坐标为pH，纵坐标为己烯雌酚的相对降解效率。图6为本发明实施例提供的己烯雌酚及假单胞菌J61降解后产物的细胞毒性。细胞培养孔中加入PBS(a);未接种细菌的含有己烯雌酚的培养基上清液(b);接种假单胞菌J61后的含有己烯雌酚或/和其代谢产物的上清液(c)。
具体实施例方式实施例I :假单胞菌J61的筛选及16S rDNA的获取将采集的海水样品涂布到含有IOppm己烯雌酚固体培养基中，28°C培养2天。将单克隆细菌接种至无机盐蛋白胨液体培养基中，28°C培养24小时，然后将细菌分别接种至含有己烯雌酚的最小培养基中培养24小时。利用HPLC测定分析细菌降解前后溶液中己烯雌酚含量的变化。J61能够在以乙醇为唯一碳源的情况下降解环境中的己烯雌酚。在平板上生长的假单胞菌J61边缘不剂齐，扁平湿润，不出现单菌落。收集处于稳定期的假单胞菌J61，提取该菌的基因组DNA。具体步骤为(1)30°C过夜培养的J61菌株按I %的体积比接种到含有IOml LB培养基(每升水中加入IOg胰蛋白胨，5g酵母浸膏和IOg氯化钠)的试管中，待细菌的OD_ I. O左右时,取ImL菌液于I. 5mL离心管中10，OOOg离心Imin收集菌体。。(2)向菌体中加ImL O. 9% NaCl洗漆沉淀，10, OOOg离心3min。(3)弃上清，向沉淀中加 450 μ L TE 缓冲液(12mM Tris-HCl, 12mMEDTA,pH 8. O)重新悬浮沉淀，再加入50 μ L 20%的SDS’轻轻的上下颠倒离心管使之混匀，75°C水浴中放置5min，至菌液裂解变澄清。(4)加500 μ L的苯酚-氯仿(体积比3 : I)抽提，轻轻颠倒使之混匀，室温静置5min 后 10, OOOg 离心 5min。(5)将上清转移至一新的1.5mL离心管并用TE缓冲液补足体积到500 μ L，加
500μ L的苯酚-氯仿(体积比3:1)，混匀室温静置5min后10，OOOg离心5min。再将上清转移至一新的离心管中，如此反复，直至看不到中间的蛋白质层为止。·(6)上清转移至一新的1.5ml离心管并用TE缓冲液补足到500yL，加500μ L氯仿，轻轻混勻后10，OOOg离心5min。(7)上清转移至一新的I. 5mL离心管，加入上清液1/10体积的3M NaAc混匀，然后加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒几次，此时应看到有絮状沉淀产生，10, OOOg离心5min。(8)弃上清，加入ImL 70%的乙醇洗涤沉淀，10，OOOg离心5min，尽量吸干液体，室温干燥约IOmin。(9)加入50 μ L含有终浓度为10_20mg/mL RNaseA的TE缓冲液溶解DNA。利用8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(GGTTACCTTGTTACG ACTT)为引物，提取的J61基因组DNA为模板，PCR扩增其16S rDNA并进行鉴定。PCR的条件为94°C变性4min，94°C变性30s，57°C退火lmin，72°C延伸lmin，从第二步开始，30个循环。PCR产物由北京诺赛基因进行测序。DNA测序片段见图2。实施例2 :细菌培养液上清中己烯雌酚的含量随时间变化过程将起始浓度为I. OX 108CFU/mL的假单胞菌J61接种至含有终浓度为IOppm己烯雌酚的最小培养基中。摇瓶装液量30%，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min。每隔24小时取出500 μ L的细菌培养液，并加入500 μ L的乙醇，室温静置10分钟。10，OOOrpm离心弃沉淀,上清液过滤除菌后，利用HPLC分析培养液上清中剩余的己烯雌酹的含量。以未接种J61的含有己烯雌酚的最小培养基作为对照，以己烯雌酚的初始加入量为100%，接种假单胞菌J61后细菌培养液上清中己烯雌酚的相对含量随时间变化的过程见图3。在接种假单胞菌J61，继续培养24小时后，溶液中己烯雌酚的含量降低了 85%，但是随着时间的增加，上清中剩余己烯雌酚的含量变化不是很大。可见，接种假单胞菌J61能够快速降低环境中己烯雌粉的含量。所述HPLC的检测方法为液相色谱仪skyray LC-310液相色谱系统；色谱柱Waters C18反向柱4. 6X250mm，粒度5 μ m ;检测条件为流动相，V(甲醇)V(水)=85 15 ;进样量为20 μ L ;温度为25 V ;紫外检测器检测参数为检测波长280nm。所述最小培养基的配方为每升水中加入1360mg磷酸二氢钾，1780mg磷酸氢二钠,500. 08mg硫酸镁，500mg氯化铵,0. Img氢氧化招,O. 05mg 二氧化锡,0. 05mg碘化钾,0. 05mg氯化锂,0. 05mg硼酸，O. Img硫酸锌，O. Olmg氯化钴,0. Olmg硫酸镍，O. 05mg氯化钡和O. 05mg钥酸铵，pH,7.2±0· I。实施例3 :利用假单胞菌J61处理含有不同浓度己烯雌酚的溶液将起始浓度为I. OX 108CFU/mL的假单胞菌J61分别接种至含有终浓度为5，10，20，40和80ppm己烯雌酚的最小培养基中。摇瓶装液量30%，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min。24小时后取出500 μ L的细菌培养液，并加入500 μ L的乙醇，室温静置10分钟。10，OOOrpm离心弃沉淀，上清液过滤除菌后，利用HPLC分析培养液上清中剩余的己烯雌酚的含量。所述HPLC的检测方法如实施例2。以未接种J61的含有己烯雌酚的最小培养基作为对照。以各种不同的浓度条件下己烯雌酚的初始加入量为100%，接种假单胞菌J61后细菌降解己烯雌酚的效率随不同的己烯雌酚起始浓度变化过程见图4。可见，己烯雌酚的浓度小于40ppm时，随着己烯雌酚浓度的增加，细菌降解效率随着环境中己烯雌粉浓度的增加而增加；而当培养液中己烯雌酹的浓度从40ppm增加到80ppm时，降解效 率并无发生明显变化。实施例4 :不同pH值影响下假单胞菌J61降解己烯雌酚效率的变化将起始浓度为I. OX 108CFU/mL的假单胞菌J61分别接种至含有终浓度为IOppm己烯雌酚的不同pH的最小培养基中。摇瓶装液量30%，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min。24小时后取出500 μ L的细菌培养液，并加入500 μ L的乙醇，室温静置10分钟。10，OOOrpm离心弃沉淀，上清液过滤除菌后，利用HPLC分析培养液上清中剩余的己烯雌酚的含量。所述HPLC的检测方法如实施例2。以未接种J61的含有己烯雌酚的最小培养基作为对照。以各种不同的PH条件下己烯雌酚的初始加入量为100%，接种假单胞菌J61后细菌降解己烯雌酚的效率随不同的pH变化过程见图5。可见，pH 7.0是假单胞菌J61降解己烯雌酚的最佳pH，偏离此pH会引起假单胞菌J61降解己烯雌酚的效率急剧下降。实施例5 己烯雌酚经细菌降解后的产物的细胞毒性将起始浓度为1.0X 108CFU/mL的假单胞菌J61分别接种至含有终浓度为IOppm己烯雌酚的最小培养基中。摇瓶装液量30%，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min,以未接种细菌的含有己烯雌酚的最小培养基上清液作为对照。24小时后取出500 μ L的培养液，加入500 μ L的乙醇，室温静置10分钟。10，OOOrpm离心弃沉淀，上清液过滤除菌后，利用HPLC分析接种细菌和未接种细菌两种条件下己烯雌酚的含量，所述HPLC的检测方法如实施例2。并将过滤除菌的上清分别加入到已经在96孔板上贴壁的Hela细胞中，8小时后在倒置显微镜下观察细菌形态的变化，观察结果如图6所示。结果表明，己烯雌酚能够使Hela细胞生长明显受到抑制，导致其在生长过程中细胞形态发生严重的变形；而经过细菌降解后的己烯雌酚，即含有少量残留的己烯雌酚或/和其降解产物的细菌培养液上清，对Hela细胞的生长无明显作用，其处理后的Hela细胞生长状态和对照，即PBS，基本一致。
权利要求
1.一种可代谢己烯雌酚的假单胞菌，其特征在于可代谢己烯雌酚的假单胞菌(Pseudomonas sp.) J61,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2011年04月28日；编号为CGMCC No. 4705。
2.—种权利要求I所述的可代谢己烯雌酚的假单胞菌的应用，其特征在于可代谢己烯雌酚的假单胞能够降解己烯雌酚。
3.按权利要求2所述的可代谢己烯雌酚的假单胞菌的应用，其特征在于所述假单胞降解己烯雌酚的降解步骤为 (DJ61种子培养将假单胞菌培养在LB培养基中，培养温度为28 30°C，培养转速180 200rpm/min，培养时间为 10_16h ； (2)J61降解己烯雌酚将步骤⑴中的J61菌体按起始浓度I. 0X108CFU/ml接种于含有己烯雌酚的最小培养基中进行培养，而后将培养物的上清液通过高效液相色谱(HPLC)检测剩余己烯雌酚的量，即可得到假单胞菌降解己烯雌酚的效率。
4.按权利要求3所述的可代谢己烯雌酚的假单胞菌的应用，其特征在于所述HPLC的检测方法为液相色谱仪skyray LC-310液相色谱系统；色谱柱=Waters C18反向柱4.6X250mm，粒度5μπι;检测条件为流动相，V(甲醇)V(水)=85 15 ;进样量为20 μ L ;温度为25°C ;紫外检测器检测参数为检测波长280nm。
5.按权利要求3所述的可代谢己烯雌酚的假单胞菌的应用，其特征在于所述LB培养基为每升水中加入IOg胰蛋白胨，5g酵母浸膏和IOg氯化钠。
6.按权利要求3所述的可代谢己烯雌酚的假单胞菌的应用，其特征在于所述最小培养基的配方为每升水中加入1360mg磷酸二氢钾，1780mg磷酸氢二钠,500. 08mg硫酸镁，500mg氯化铵,0. Img氢氧化招，O. 05mg 二氧化锡，O. 05mg碘化钾,0. 05mg氯化锂,0. 05mg硼酸，O. Img硫酸锌，O. Olmg氯化钴,0. Olmg硫酸镍，O. 05mg氯化钡和O. 05mg钥酸铵，pH,7. 2±0· I。
7.按权利要求3所述的可代谢己烯雌酚的假单胞菌的应用，其特征在于在含有己烯雌酚的最小培养基中进行培养的假单胞菌，取其上清液，加入等体积的乙醇，室温静止IOmin,在13，OOOrpm转速下离心5min,上清用O. 22 μ m的滤膜过滤待用。
全文摘要
本发明涉及利用微生物进行环境治理领域，具体地说是可代谢己烯雌酚的假单胞菌及其应用。可代谢己烯雌酚的假单胞菌名为J61，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；保藏日期为2011年04月28日；编号为CGMCC No.4705。可代谢己烯雌酚的假单胞菌能够降解环境中的己烯雌酚。本发明提供的菌株能够高效降解80ppm的己烯雌酚，借此可开发出相应的环保生物制剂，显示出良好的应用前景。
文档编号A62D3/02GK102911890SQ20111022893
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者张卫卫, 陈令新, 牛宗亮, 殷堃, 刘萍, 徐冬雪, 潘婷 申请人:烟台海上传奇生物科技有限公司, 中国科学院烟台海岸带研究所