专利名称：一株碱性类坚强芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株类坚强芽孢杆菌OfeciBm pseudofirmus )，及其在碱性厌氧条件下腐殖质还原和铁还原的应用。
背景技术：
腐殖质呼吸是厌氧环境中普遍存在的微生物呼吸代谢形式。腐殖质呼吸，又称醌呼吸，指微生物以腐殖质作为唯一末端电子受体，接受来自有机酸等物质提供的电子，偶联能量的产生，支持菌体生长的过程。腐殖质呼吸与铁还原关系密切。腐殖质呼吸作用在元素的生物地球化学循环过程中具有重要意义，表现为1)微生物在进行腐殖质呼吸的过程中， 可直接将环境中的有机质或甲苯、氯乙烯等环境有毒物质氧化，产生ω2 ；2)呼吸作用产生的还原态腐殖、质能够还原环境中的一些氧化态物质，如!^e(III)、Mn (IV)、Cr(VI)、U(VI)、 硝基芳香化合物和多卤代污染物。腐殖酸呼吸作用可影响环境中C、N、Fe、Mn以及一些痕量金属元素的生物地球化学循环，并且能够促进重金属以及有机污染物的脱毒，在水体自净、污染土壤原位修复、污水处理等方面具有积极作用，因此近年来腐殖质呼吸有关的研究倍受关注。从上世纪90年代后期以来，多种以腐殖酸或腐殖酸模式物蒽醌_2，6- 二磺酸 (AQDS)为末端电子受体的细菌也相继分离和鉴定。然而，碱性条件相对不利于微生物的生长，在此苛刻的条件下，微生物可能驯化出一套机制，以更好地应对恶劣的环境。目前，尚未发现具有狗(III)还原和腐殖酸还原活性的类坚强芽孢杆菌报道。
发明内容
本发明的目的是发现一株厌氧腐殖质和铁氧化物的碱性高效还原菌。本发明的另一个目的是提供上述类坚强芽孢杆菌在铁氧化物和腐殖质还原中的应用。本发明所得的类坚强芽孢杆菌(Mcillus pseudofirmus )MC02，于2011年4月21 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC: 4772，并于同日鉴定菌种存活。本发明提供了一株新的具有!^e(III)呼吸和腐殖质呼吸能力的菌株，所述菌株与已报道菌株相比，在碱性条件下，具有较强的Fe(III)还原和腐殖酸还原能力，电子利用谱较广，能还原结晶度较高的铁氧化物，例如纤铁矿、赤铁矿，具有广泛的应用前景。
图1是菌株MC02利用不同电子供体还原AQDS的效果图； 图2是菌株MC02利用不同电子供体还原!^e(III)的效果图； 图3是菌株MC02以葡萄糖为底物，还原不同铁氧化物的效果图； 图4是菌株MC02以葡萄糖为底物，在不同电子穿梭体介导下，还原纤铁矿的效果图。
具体实施例方式菌株MC02的富集和分离
1)从PH为9.0的污泥微生物燃料电池中撕取阳极碳毡浸泡于50mL液体富集培养基中，(污泥微生物燃料电池的构型如CN200910041235. 4所述)，液体富集分离培养基的组成是16g AQDS (电子受体)、0.25g NH4Cl、0.678g NaH2PO4 · 2Η20、0· Ig KCl、2.94g NaHCO3, 1.59g Na2CO3,10. OmL维生素溶液、10. OmL微量元素溶液(pH 9.0)。其中，维生素溶液是每升去离子水中含2. Omg生物素、2. Omg叶酸、VB6 10. Omg维生素、5. Omg硫胺素、5. Omg核黄素、5. Omg烟酸、5. Omg泛酸钙、0. Img维生素B12、5. Omg对氨基苯甲酸、5. Omg硫辛酸； 微量元素溶液是每升去离子水中含1.5g氨三乙酸、3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4 · H2O、 1. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoCl2 · 6Η20、0· Ig CaCl2、0. Ig ZnSO4 · 7Η20、0· Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg AlK(SO4)2 · 12Η20、0· Olg H3BO3>0. Olg Na2MoO4 · 2Η20 ；
2)往已接种的富集培养基中充氮气不少于30分钟，鼓气完毕盖橡胶盖加铝盖密封，置于厌氧工作站(队/0)2=80/20)，30°C静置培养，观察培养液的颜色变化情况；
3)当培养液颜色从无色变为橙黄色时，以10%的接种量将培养液转接至另一新鲜的液体分离培养基，厌氧操作及厌氧培养条件同2 )，如此富集培养三次；
4)将第四代反应后的培养液采用稀释平板法进行适当稀释，将稀释后的培养液0.1 mL 均勻涂布于LB固体培养基上，置于厌氧工作站(^/C02=80/20)30°C培养48h，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化，其中，所述LB固体培养基的组成是蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl 10 g/L，琼脂粉 20 g/L，pH 为 9. 0。所得菌株即为类坚强芽孢杆菌UaciB^s pseudofirmus)mQ2,于2011年4月21 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC 4772，并于同日鉴定菌种存活。菌株(^Bacillus pseudofirmus) MC02 的形态特征 1)菌体形态特性
菌株MC02革兰氏阳性，杆状，有芽孢且中生，菌体成对或链状排列。)菌落形态特性
在有氧LB琼脂平板培养4 后，菌落表面光滑不透明，边缘不整齐，菌落直径约2-3mm。菌株(^Bacilluspseudofirmus ) MC02 的生理生化特征
根据《伯杰细菌鉴定鉴定手册》第九版所述的标准程序测试菌株的生理生化特征，其生化特征见表1。
权利要求
1.类坚强芽孢杆菌菌株MC02，其保藏号为CGMCC:4772。
2.权利要求1所述类坚强芽孢杆菌MC02在铁氧化物和腐殖质还原中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株类坚强芽孢杆菌CGMCC4772及其在铁氧化物和腐殖质还原中应用。本发明从运行良好的碱性污泥微生物燃料电池阳极生物膜中分离纯化得到一株类坚强芽孢杆菌(BacilluspseudofirmusMC02)，其在碱性条件下，具有较强的Fe(III)和AQDS还原能力，且电子利用谱较广，应用前景广泛。
文档编号C21B15/00GK102337236SQ20111025679
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者周顺桂, 张隽, 杨贵芹, 马晨 申请人:广东省生态环境与土壤研究所