一种用于扩增子测序的建库方法
【专利摘要】本发明涉及高通量测序【技术领域】，公开了一种用于扩增子测序的建库方法，包括以下步骤：(1)PCR扩增富集目标区域：对待测样品基因组DNA，针对目标区域设计引物序列，引物序列在正向引物和反向引物的5’端设有随机碱基序列和接头序列，进行PCR扩增，回收PCR产物；(2)PCR扩增引入测序接头：将上步所得的PCR产物进行混样，设计引物序列，引物序列包含与上步中的接头序列互补的序列，对混样进行PCR扩增，回收PCR产物，即得到用于扩增子测序的DNA文库。本发明的建库方法不但降低了扩增子测序的建库时间和成本，还能够降低对测序结果进行生物信息学分析错误的发生，提高分析结果的准确性和真实性。
【专利说明】一种用于扩增子测序的建库方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，特别涉及一种用于扩增子测序的快速建库方 法。
【背景技术】
[0002] 随着高通量测序技术的发展，测序成本的降低，使测序技术逐渐成为基础生物学 研究和医学检测的常规实验方法。从人类基因组计划构建了第一个基因组图谱开始，新一 代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的高 速发展。但全基因组测序结构复杂，数据量大，周期长，费用高，限制了它的发展。
[0003] 同时，有的研究者只对特定的基因组区域感兴趣，这时就只需对相应区域进行测 序研究，不需要对全基因组进行测序。扩增子测序（Amplicon Sequencing)就是只对目标区 域进行测序研究的一项测序方法。通过设计感兴趣的基因组区域的引物，进行PCR扩增，对 目标区域进行富集，然后针对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行建库，高通量测序， 分析序列中的变异。扩增子测序能根据研究者目的，针对目标区域进行高覆盖度的测序，还 可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重 点研究。这种高针对性的方法可以高效的发现，验证和筛选关注区域的基因组变异。相比 全基因组测序，扩增子测序对目标区域有更准确快速的研究，适用于大量样本的特定基因 组区域研究。
[0004] 目前的扩增子测序都是通过常规的建库方法，在通过PCR扩增富集到目标区域 后，进行混样，然后进行末端修复和加 A，再加接头，纯化样品，跑胶回收目的条带，然后PCR 扩增，最后再跑胶回收主带，该种常规的建库方法步骤繁琐，浪费时间，工作量大，不利于大 量样品的测序建库。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种适用于扩增子测序的快速建库方法，以简化扩增子测 序中建库步骤的操作过程，降低扩增子测序建库的时间和成本，同时保证不影响测序质量。
[0006] 本发明所提供的用于扩增子测序的建库方法包括以下步骤：
[0007] (l)PCR扩增富集目标区域：对待测样品基因组DNA，针对目标区域设计引物序列， 该引物序列在正向引物和反向引物的5'端设有随机碱基序列和接头序列，进行PCR扩增， 回收PCR产物；
[0008] (2)PCR扩增引入测序接头：将步骤⑴所得到的PCR产物进行混样，设计引物序 列，该引物序列包含与步骤（1)中的接头序列互补的序列，对混样进行PCR扩增，回收PCR 产物，即得到用于扩增子测序的DNA文库。
[0009] 本发明的用于扩增子测序的建库方法，在步骤（1)之前还包括提取待测样品基因 组DNA的步骤，该提取步骤可采用本领域内常规方法进行，例如使用Omega公司的SOIL DNA KIT进行提取；此外，在步骤（2)之后还包括测序并对测序数据进行生物信息学分析的步 骤，本发明建库后的上机测序可以通过一代测序平台进行，也可通过高通量测序平台进行， 例如ABI公司的3730XL测序平台或Illumina公司的miseq测序平台等。进行生物信息学 分析的步骤主要是指通过质控和barcode得到优化数据，然后聚OTU，物种注释，α多样性 分析（稀释曲线、shannon曲线、物种累积曲线；chao、simpson等多样性指数），β多样性 分析（pea、pcoa聚类；系统进化树，物种分布、显著性差异、环境因子梯度分析、各种分组比 较等）。
[0010] 本发明所提供的用于扩增子测序的建库方法的流程图如附图1所示。
[0011] 具体来说，本发明的步骤（1)进行了第一次PCR扩增，以完成富集目标区域的操 作。在针对测序目标区域进行引物设计时：引物总长度<59bp，退火温度55°C?75°C。在 正向引物和反向引物的5'端设有随机碱基序列和接头序列，其中随机碱基的个数可设计为 1?10个，在本发明的【具体实施方式】部分采用的是1?5个随机碱基的方案。接头序列是 与测序仪相配套的序列，例如illumina的"Y"字型的序列。随机碱基序列和接头序列的设 计主要达到以下三个方面的目的：（1)引入区分样本标签；（2)引入去除嵌合体序列标签； (3)引入测序接头，方便测序。最后，回收PCR产物时可采用凝胶电泳法切胶回收目的条带。
[0012] 本发明的步骤（2)进行了第二次PCR扩增，以完成引入测序接头、建成文库的操 作。首先，在将上述第一次PCR的产物进行混样后，还包括磁珠纯化的步骤，采用磁珠纯化 比一般的过柱纯化速度快，可节省实验时间。例采用Agencourt AMPure XP进行。磁珠纯化 步骤之后，进行设计第二次PCR引物序列和对混样进行扩增的步骤。在第二次PCR的引物 序列中，在正向引物的5'端带有P5序列；在反向引物的5'端带有Index序列和P7序列， 这样的引物设计为区分每一个文库引入文库标签。在扩增完成之后，进行PCR产物的回收， 回收PCR产物时采用磁珠法或凝胶电泳法，即得到用于扩增子测序的DNA文库。
[0013] 本发明还提供以上述方法所构建的用于扩增子测序的DNA文库。
[0014] 本发明采用了两步法建库的方法构建扩增子测序文库，与现有技术相比，具有如 下两方面的优点：
[0015] 首先，目前现有技术中所采用的扩增子测序的建库方法和普通的全基因组测序的 建库方法类似，不但增加了建库时间和成本，还增加了引入突变的可能。本发明的快速建库 方法将PCR扩增富集到目标区域后的常规建库方法改为一次PCR，然后用磁珠法纯化PCR产 物，即可得到测序文库。相比现有技术方案，本发明的整个建库过程只用了两次PCR，步骤简 单，方便操作，使得扩增子建库的时间由原来的3?4小时，缩短到0. 5小时，同时免去了建 库试剂盒的成本，大大降低了扩增子测序建库的时间和成本，提高了效率；且避开了常规建 库中繁琐的步骤可能引入的突变，与常规建库相比两步法建库不会影响测序质量，其测序 质量更加准确精确。
[0016] 其次，在现有的扩增子测序建库过程中，由于PCR的扩增反应，不可避免地形成了 嵌合体，使得在进行生物信息学分析时，在不能识别嵌合体的情况下，使得得到的UTR数据 中含有嵌合体的数据。采用本发明的两步法建库，在第一次PCR扩增时引入的特异序列为 嵌合体的识别提供了标签，在进行生物信息学分析时，通过简化扩增子测序建库方法中使 用的标签，可以识别出引入接头的PCR扩增过程中产生的嵌合体，排除了由于建库实验的 PCR扩增过程产生的嵌合体对真实数据结果的影响，提高生物信息学分析的结果的准确性， 与现有的建库方法相比，本发明得到的数据能够降低生物信息学分析错误的发生，更加真 实地反应出样品的实际情况，提高了生物信息学分析结果的准确性和真实性。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是本发明的用于扩增子测序的建库方法流程图；
[0018] 图2是【具体实施方式】中PCR扩增富集目标区域步骤的样品电泳图；
[0019] 图3是【具体实施方式】中PCR扩增引入测序接头步骤的样品电泳图；
[0020] 图4是以本发明方法所构建的文库进行测序的结果图；
[0021] 图5是以传统建库方法所构建的文库进行测序的结果图；
[0022] 图6是以本发明的建库方法所得文库的测序结果构建的进化树；
[0023] 图7是以传统建库方法所得文库的测序结果构建的进化树。
【具体实施方式】
[0024] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中， 为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基 于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方 案。
[0025] 实施例1
[0026] 首先按照常规方法使用Omega公司的SOIL DNA KIT，提取10个样品的土壤基因组 DNA，步骤略。
[0027] -、PCR扩增富集目标区域（PCR-1):
[0028] i.引物设计
[0029] 1)测序区域为NF-NR ;
[0030] 2)在引物NF和NR的5'端设计独特的碱基（N代表碱基序列）、Adapter序列；
[0031] 3)具体引物序列信息见表1 :
[0032] 正向引物 NF :SEQ ID No 1 ;
[0033] 反向引物 NR :SEQ ID No 2。
[0034] 表1 PCR-1扩增引物序列
[0035]
【权利要求】
1. 一种用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) PCR扩增富集目标区域：对待测样品基因组DNA，针对目标区域设计引物序列，所述 引物序列在正向引物和反向引物的5'端设有随机碱基序列和接头序列，进行PCR扩增，回 收PCR产物； (2) PCR扩增引入测序接头：将步骤（1)所得到的PCR产物进行混样，设计引物序列，所 述引物序列包含与步骤（1)中的接头序列互补的序列，对混样进行PCR扩增，回收PCR产 物，即得到用于扩增子测序的DNA文库。
2. 根据权利要求1所述的用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，在所述步骤（2)之 后还包括测序并对测序数据进行生物信息学分析的步骤。
3. 根据权利要求1所述的用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，在所述步骤（1)之 前还包括提取待测样品基因组DNA的步骤。
4. 根据权利要求1所述的用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，步骤（1)中回收 PCR产物时采用凝胶电泳法切胶回收目的条带。
5. 根据权利要求1所述的用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，步骤（2)中在将 PCR产物进行混样后还包括磁珠纯化的步骤。
6. 根据权利要求1所述的用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，步骤（2)中的引物 序列中，在正向引物的5'端带有P5序列；在反向引物的5'端带有Index序列和P7序列。
7. 根据权利要求1所述的用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，步骤（2)中回收 PCR产物时采用磁珠法或凝胶电泳法。
8. 根据权利要求2所述的用于扩增子测序的建库方法，其特征在于，所述测序步骤通 过一代测序平台或高通量测序平台进行。
9. 一种用于扩增子测序的DNA文库，其根据权利要求1至8任一项所述的方法构建得 到。
【文档编号】C40B50/06GK104153004SQ201410391037
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】林芹, 于丹, 李胜彬, 陈华, 陶晔, 曾亮 申请人:上海美吉生物医药科技有限公司