一种单光子/双光子无定形碳点的制备及生物应用的制造方法与工艺

本发明涉及荧光碳纳米材料的制备，尤其涉及一种单光子/双光子无定形碳点的制备及其生物应用。

背景技术：
双光子荧光技术由于其激发光可选择近红外光，从而大大提高了穿透组织的深度，避免了紫外光对组织的损伤。与显微镜技术相结合，双光子荧光技术可降低组织背景对成像的干扰，提高分辨率，从而可对活体组织进行深层观察。与传统的双光子量子点或有机染料相比，碳点具有良好的荧光性能和生物相容性，光稳定性以及易于官能化等诸多优势，在生物医学领域具有广泛的应用前景。然而，荧光碳点的生物成像多局限于紫外光激发成像，众所周知，紫外光穿透组织的能力有限且光毒性大，从而限制了碳纳米点在生物组织或活体中的应用。因此，碳点的双光子性能一经报道立即引人瞩目。目前有关双光子碳点的研究仍存在诸多问题，如Cao等(L.Cao，X.Wang，M.J.Meziani，F.Lu，H.Wang，P.G.Luo，Y.Lin，B.A.Harruff，L.M.Veca，D.Murray，S.Y.XieandY.P.Sun，J.Am.Chem.Soc.2007，129，11318-11319)通过激光消融法制备碳核，并饰以聚合物提高其量子产率和生物相容性，制备了一种双光子碳点，但工艺条件苛刻而繁琐，所得碳点量子产率较低。Kong等(B.Kong，A.Zhu，C.Ding，X.Zhao，B.LiandY.Tian，Adv.Mater.，2012，24，5844-5848)以电化学法制备碳点，随后表面接枝具有多苯环的有机杂环分子而得到双光子碳点，该方法合成过程复杂，量子产率不高。因此，研发具有较高量子产率，生物毒性更低，制备方法简单的综合性能良好的双光子碳点尤为重要。

技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种制备方法简单，量子产率高，生物毒性小，综合性能良好的单光子/双光子无定形碳点的制备及其生物应用。本发明通过水热法对柠檬酸和聚酰胺-胺混合溶液的处理，得到了量子产率为10％～30％的双光子碳点，且该碳点的生物毒性很小，可很好的应用于细胞的单光子/双光子成像。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本发明涉及一种单光子/双光子无定形碳点的制备方法，所述方法包括如下步骤：以水为溶剂，聚酰胺-胺和柠檬酸在150～200℃下水热反应1～8小时，得到棕黄色的碳点粗产物；所述碳点粗产物经透析和过滤纯化后得到单光子/双光子无定形碳点水溶液，烘干，即得所述单光子/双光子无定形碳点。作为优选方案，所述聚酰胺-胺、柠檬酸和水的质量比为(0.05～2)∶(2～15)∶100。作为优选方案，所述聚酰胺-胺为线性或超支化结构的聚合物。作为优选方案，所述线性或超支化结构的聚酰胺-胺由1-(2-氨乙基)哌嗪(1-(2-aminoethyl)piperazine)和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(N，N’-methylenebisacrylamide)按摩尔比1∶1合成。本发明中具体合成方法参照(SynthesisandGeneDeliveryofPoly(amidoamine)swithDifferentBranchedArchitecture.Biomacromolecules2010，11，489-495)。作为优选方案，所述柠檬酸为无水或含结晶水的柠檬酸。作为优选方案，所述水热反应的温度为180～200℃。作为优选方案，所述水热反应是在水热釜中密封进行的，水与水热釜的体积比为1∶5～1∶2。作为优选方案，所述透析采用的透析袋的截留分子量为1000～10000Da；所述过滤纯化采用的滤膜孔径为0.22μm。第二方面，本发明还涉及一种本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点在细胞标记中的应用。作为优选方案，本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点用于生物成像。作为优选方案，本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点用于癌细胞的单光子和双光子成像。作为优选方案，将所述单光子/双光子无定形碳点与细胞共孵育后得到单光子/双光子细胞图像。作为优选方案，本发明的制备方法制得的单光子/双光子无定形碳点用于药物可视输送系统。在本发明中，所述的碳点粒径约为10nm且主要组成为无定形碳。在本发明中，所述的碳点在320nm左右有一个宽的紫外吸收峰，对应荧光发射峰在400～600nm之间，随激发波长从300～420nm内改变，发射峰最强位置在425～500nm之间逐渐红移。在本发明中，所述的碳点在水溶液中的量子产率为10％～30％，荧光寿命为11.0ns。在本发明中，所述的碳点具有双光子荧光特性，激发波长范围为700～900nm，双光子吸收截面最大为16000±1500GM。在本发明中，所述的碳点具有固体荧光的特性，固体量子产率为5～17％，在不同激发波长下分别得到深蓝、亮绿、亮黄和红色发光。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明采用聚酰胺-胺和柠檬酸在180～200℃条件下经水热反应制备单光子/双光子无定形碳点；制备工艺简单，水溶性好，适合工业化生产；2、本发明的碳点具有较高的量子产率，量子产率在具有双光子性能的碳点中基本属于最高者；3、本发明的碳点细胞毒性小，碳点的浓度达400μg/mL时，细胞存活率仍在80％以上，适合应用于生物医药领域；4、本发明的碳点荧光性能好，不仅在水溶液中具有较强的单光子/双光子荧光性能，且具有固体荧光性能；是一种综合性能较好的碳纳米材料，可在细胞的单/双光子成像方面得到良好的应用。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的透射电镜TEM图(对应实施例1的产物)；图2为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的X射线衍射图(对应实施例1的产物)；图3为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的XPS分析图(对应实施例1的产物)；为碳原子的三种化学键形式C＝C(284.8eV)，C-O(285.7eV)andC＝O(288.8eV)的表征；图4为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的热重分析图，表示N2环境下的TGA分析曲线(对应实施例1的产物)；图5为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的红外光谱图，图中a、b、c分别代表原料柠檬酸、聚酰胺-胺和碳点的红外光谱(对应实施例1的产物)；图6为本发明所述单光子/双光子无定形碳点的单光子荧光发射谱图，其中曲线CA、HPAAs和C-dots分别代表柠檬酸、聚酰胺-胺以及...