专利名称：一种胰高血糖素制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生化药品胰高血糖素的制备方法。
胰高血糖素存在于胰脏兰氏小岛的a一细胞中，是由二十九个氨基酸残基组成的多肽激素。由于分离纯化较困难，在生产胰岛素的过程中胰高血糖素随母液流失。目前多数国家均不能自胰岛素生产工艺中分离纯化胰高血糖素，天津第二生化制药厂与南开大学生物系协作研究了自动物胰脏分离纯化胰高血糖素的方法，目前仍处于试验室阶段，其分离纯化流程为 但该工艺仍属从胰脏中直接提取，胰岛素结晶母液仍然不能得到利用。
本发明的目的是提供一种从废弃的胰岛素钠盐结晶母液中制备胰高血糖素的工艺，变废为宝，提高综合经济效益。
本发明的技术方案如下以生产胰岛素的废弃物胰岛素钠盐结晶母液为原料，将母液用1-3N盐酸调PH3-5，用离心或过滤除去析出的酸性蛋白，然后在滤液中加入0.01-0.1M的醋酸锌或氯化锌，后用1-3N氢氧化钠调PH5-7.5沉淀，将沉淀用稀醋酸或稀盐酸溶解上阳离子交换凝胶柱，然后用稀氨水洗脱，将洗脱液再加Zn++二次沉淀，将Zn沉淀用含盐的稀醋酸溶解，上凝胶过滤柱，将凝胶过滤柱洗出的胰高血糖素蜂经阳离子交换柱浓缩，然后将浓缩液用稀磷酸调PH7-9结晶，再用磷酸缓冲系统重结晶，结晶经收集、脱水、干燥后得12面体胰高血糖素结晶粉，其工艺流程是 上述方法中也可以将胰岛素钠盐结晶母液加水稀释2-10倍体积，再用1-3N盐酸调PH3-5后上阳离子交换扩张床柱代替Zn++沉淀。
实施例一胰岛素钠盐结晶母液，用1-3N盐酸调PH3-5过滤除去酸性蛋白，滤液中加入0.01M醋酸锌(或氯化锌)。3N氢氧化钠调PH4，静置，待沉淀完全后，离心收集Zn沉淀。Zn沉淀用稀醋酸溶解成5％左右的浓度过滤除去不溶物，上Sp sepharose XL阳离子的交换层析柱。柱床事先用0.2M醋酸平衡。样液上柱交换后，用HPLC检测流出液有胰高血糖素穿出时，停止交换。柱床用适量的0.2M稀醋酸平衡，再换水洗至PH6。换0.2M氨水洗脱，洗脱峰只有一个，收集后再按前述的Zn++沉淀法进行二次Zn沉淀。待沉淀完全后，离心收集锌沉淀。取锌沉淀50克，用0.2M醋酸--0.1M氯化钠溶液以最小的体积溶解，过滤除去不溶物。溶液上Sephacryl S-100HR凝胶过滤柱(柱床10×90cm)。控制线流速23cm/h洗脱液同溶解液，洗出的胰高血糖素峰(HPLC检测)经sp SepharoseXL柱床浓缩，用0.2M氨水从柱床上洗脱下来。洗脱液用6N稀磷酸调PH8.5，置5℃左右冷室中放置结晶，2-3天后，离心收集结晶。结晶再用0.01M盐酸溶解，加入2％的尿素，加入1/10体积的PH6.8磷酸缓冲液，加温50C左右过滤除去不溶物，待溶液温度降至室温20℃时，加入10％的丙酮。校正PH6.8，量5℃左右冷室中重结晶，结晶为12面体。3天后离心收集结晶，结晶经冷水洗涤，冷乙醇无水、冷乙醚无水脱水、干燥。即得到胰高血糖素结晶粉，HPLC纯度再95％以上。
实施例二胰岛素钠盐结晶母液，加水稀释8倍体积，用3N盐酸调PH4，溶液上sp Sepharose XL阳离子交换扩张床柱，柱床事先用0.2M醋酸平衡。样液上柱交换后，用PHLC检测流出液，有胰高血糖素穿出时，停止交换。柱床用适量的0.2M醋酸溶液平衡。再换水洗至PH6，换0.2M氨水洗脱，收集后按Zn沉淀法进行Zn沉淀，待沉淀完全后，离心收集锌沉淀。取锌沉淀50克，用0.2M醋酸--0.1M氯化钠溶液以最小的体积溶解，过滤除去不溶物。溶液上Sephacryl S-100HR凝胶过滤柱(柱床10×90cm)。控制线流速23cm/h，洗脱液同溶解液洗出的胰高血糖素峰(HPLC检测)经sp Sepharose XL柱床浓缩。用0.2M氨水从柱床上洗脱下来，洗脱液用6N洗磷酸调PH8.5，置5℃左右冷室中放置结晶，3天后离心收集结晶。结晶再用0.01M盐酸溶解，加入2％的尿素，加入1/10体积的PH6.8磷酸缓冲液，加温50℃左右过滤除去不溶物，待溶液温度降至20℃左右时，加入10％的丙酮，校正PH6.8，置5℃左右冷室中重结晶，结晶为12面体，3天后离心收集结晶，结晶经冷水洗涤，冷乙醇(无水)、冷乙醚(无水)脱水、干燥，即得到胰高血糖素结晶粉。HPLC纯度在95％以上。
用上述工艺制取胰高血糖素，每吨胰脏可得0.3-0.4g胰高血糖素，HPLC纯度在95％以上，按年投胰脏1000吨生产胰岛素计算，可从废弃胰岛素钠盐母液中获胰高血糖素近400g，按每克3万元计，价值900-1200万元。且该工艺便于规模化生产。
权利要求
1.一种胰高血糖素的制备工艺，本发明的特征是以生产胰岛素的废弃物胰岛素钠盐结晶母液为原料。将母液用1-3N盐酸调PH3-5，用离心或过滤除去析出的酸性蛋白，然后在滤液中加入0.01-0.1M的醋酸锌或氧化锌，后用1-3N氢氧化钠调PH5-7.5沉淀，将沉淀用稀醋酸或稀盐酸溶解上阳离子交换凝胶柱，然后用稀氨水洗脱，将洗脱液再加Zn++二次沉淀，将锌沉淀用含盐的稀醋酸溶解，上凝胶过滤柱，将凝胶过滤柱洗出的胰高血糖素蜂经阳离子交换柱浓缩，然后将浓缩液用稀磷酸调PH7-9结晶，再用磷酸缓冲系统重结晶，结晶经收集、脱水、干燥后得12面体胰高血糖素结晶粉，其工艺流程是
2.根据权利要求1所述的胰高血糖素制备工艺，其特征是所说的阳离子交换凝胶柱为离子交换层析柱。
3.根据权利要求1所述的胰高血糖素制备工艺，其特征是也可以将胰岛素钠盐结晶母液加水稀释至2-10倍体积；用1-3N盐酸调PH3-5后将溶液上阳离子交换柱取代一次Zn++沉淀。
4.根据权利要求l和3所述的胰高血糖素制备方法，其特征是所说的离子交换柱为离子交换扩张床柱。
全文摘要
本发明公开了一种胰高血糖素的制备工艺,采用废弃的胰岛素钠盐结晶母液为原料,用Zn
文档编号C07K14/575GK1340549SQ00112488
公开日2002年3月20日 申请日期2000年8月26日 优先权日2000年8月26日
发明者罗桂荣, 孙秀丽, 陈慧 申请人:徐州万邦生化制药有限公司