专利名称：一种2－萘酸降解菌dna片段的核苷酸序列及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种2-萘酸降解菌DNA片段的核苷酸序列，涉及含有该DNA片段的重组质粒和重组菌株的制备方法。具体地说，本发明涉及2-萘酸降解菌(Burkholderiasp.JT1500)的一段具有降解2-萘酸活性的DNA片段，该DNA片段含有两个关键基因2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，涉及含有该DNA片段的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
背景技术：
偶氮芳香族化合物在自然界中广泛存在，而且每年以数百万吨的数量被制造出来。尤其是印染工业中偶氮染料的广泛使用产生大量的印染废水，对环境构成严重的污染和危害。微生物降解芳香族环境污染物具有投资少、占地小又不需要特殊设备等优点，逐渐成为最有前途的治理环境污染物的方法。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质的化合物，通过研究2-萘酸的微生物代谢途径，确定其代谢过程中的酶系统以及对应的代谢基因，可以为偶氮类化合物的微生物降解提供理论依据，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
在微生物降解芳香族环境污染物的研究中，关于2-萘酸代谢研究的报道很少，仅有1997年Birgit Morawski等报道过2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)降解2-萘酸的代谢途径，其具体的基因和基因调控机理并未有报道。2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因未曾有过报道，他们在2-萘酸降解过程中所起的作用更未曾有报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一段2-萘酸降解菌的具有降解2-萘酸活性的DNA片段的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株。
本发明的再一个目的是提供一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株的制备方法，并将其用于高效降解2-萘酸及其它偶氮类芳香族化合物。
本发明提供了一种2-萘酸降解菌的具有降解活性的DNA片段，其核苷酸序列如SEQNo1所示。
按照本发明的DNA片段，含有两个关键基因2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因序列。其中2-萘酸单加氧酶基因序列为SEQ ID NO1中所示编号为第2793-3951位的核苷酸序列，共1158bp。该基因编码的单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID No2。辅酶A(CoA)连接酶的基因序列为SEQ ID No1所示编号为第4042-5793位的核苷酸序列，共1751bp。该基因编码的辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列为SEQID No3。
本发明还提供了含有如上所述DNA序列的重组表达质粒。
本发明还涉及含有上述的重组表达质粒的重组菌株，如大肠杆菌HB101重组菌株。
本发明还提供了一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株的方法，包括以下步骤从2-萘酸降解菌Burkholderia sp.JT1500菌株中提取总DNA，经限制性内切酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌HB101，获得含2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，总长8050bp的DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株。
图1为含有本发明所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的重组质粒构建模式图。
图2为本发明所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的核苷酸序列。
图3为本发明的2-萘酸单加氧酶基因所编码的氨基酸序列。
图4为本发明的辅酶A(CoA)连接酶基因所编码的氨基酸序列。
下面结合附图对本发明进行详细描述。
本发明首先从2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)菌株提取总DNA，然后用限制性内切酶EcoR I部分水解，经琼脂糖凝胶电泳，得到各酶切片段。将酶切片段与经过EcoR I酶解的pUC18质粒DNA，加入TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系，16℃反应30min后，连接产物转化大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于LB固体培养基上，经过培养，转化子平板上长出了若干蓝色菌落，得到能使大肠杆菌转化子细胞积累靛蓝的重组菌株。挑取其中一个单菌落培养，用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶水解重组质粒，根据电泳结果证实已插入了一段8kb的2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段。该DNA片段经测序，其核苷酸序列如图2所示(SEQ ID No1)。对该序列作进一步研究，通过与国际已有基因库进行序列比对，发现在编号2793-3951处有一1158bp，编码386个氨基酸的序列与基因库中一些单加氧酶基因有较高同源性与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶基因(单加氧酶基因)(bec)3’末端的780bpDNA序列有86％的同源性，与bec的氨基酸序列有64％的同源性。另有一段1751bp(在编号第4042-5793位)的核苷酸序列所编码的氨基酸序列与Amycolatopsis sp.HR167辅酶A连接酶有42％的同源性，与其他辅酶A连接酶也有一定相似性。进一步利用靓蓝生成、酶活分析等试验进一步确认该8050bp的DNA片段上含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因。在2-萘酸降解过程中，单加氧酶基因起羟化底物(2-萘酸)作用，而辅酶A连接酶基因则使底物连上辅酶A，为进一步的降解创造条件。因此本发明提供了一种可能性，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因克隆到大肠杆菌或其它受体菌上，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明，下述实施例仅用于说明而不是限制本发明。
实施例12-萘酸降解菌总DNA的提取过程将2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)接种于5ml LB培养基，30℃，140rpm摇床培养过夜，6000g离心10min，收集菌体。加入2.7ml DNA抽提缓冲液，充分悬浮；加入20μl 20mg/ml蛋白酶K，37℃水浴摇床200rpm摇30min后加入0.3ml 20％SDS，轻轻颠倒几次混匀，置恒温水浴箱静置，65℃温浴2h，期间每隔15-20min上下颠倒几次混匀，直至澄清，6000rpm室温离心10min，上清液转至新的离心管中。加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1 v/v)抽提两次，将上清转至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置1h或更长一点；14000rpm室温离心20min收集粗DNA。DNA用70％的乙醇轻轻溜洗，弃上清后置干净工作台上晾干，最后加入适量含RNA酶的无菌水溶解，转至1.5ml离心管，即得到该菌DNA。
实施例2克隆过程和测序取前面所述的总DNA溶液10μl，用限制性内切酶EcoR I部分水解，经琼脂糖凝胶电泳，得到各酶切片段。取6μl(5μg)酶解DNA片段与3μl(2μg)经EcoRI酶解的pUC18质粒DNA，加入9ml TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系，16℃反应30min；连接产物转化已用氯化钙法制备的大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于含75μg/ml Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基上。经过培养，转化子平板上长出了若干蓝色菌落，得到能使大肠杆菌转化子细胞积累靛蓝的重组菌株。挑取其中一个单菌落培养，用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶水解重组质粒，根据电泳结果证实已插入了一段8kb的2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段。
经过测序，并应用相关软件对该DNA序列进行分析，结果显示，此序列上有一段1158bp(编号第2793-3951位核苷酸)阅读框(ORF)编码386个氨基酸，与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶基因(单加氧酶基因)(bec)3’末端的780bpDNA序列有86％的同源性，与bec的氨基酸序列有64％的同源性。另一段1751bp(编号第4042-5793位核苷酸)编码的氨基酸序列与Amycolatopsis sp.HR167辅酶A连接酶有42％的同源性，与其他辅酶A连接酶也有一定相似性。
实施例3验证试验(1)应用靛蓝生成实验验证基因产物的加氧活性靛蓝溶解在二甲替甲酰胺(DMF)中，在OD610处有特异的吸收峰。观察OD610处光吸收值的升高，可计算出靛蓝的生成量。紫外分光光度计的靛蓝摩尔吸光系数为17200liters/mol.cm。在含0.2％葡萄糖的M9液体培养基中(Amp 100mg/L)，添加吲哚60umol/L为底物，用重组大肠杆菌做靛蓝生成实验。每30min取一定量培养液，将被加氧酶羟化吲哚生成的靛蓝溶解在DMF中，测定在OD610处的光吸收值，即可测定重组细胞中加氧酶的活性。实验证明，含有以上基因的重组菌株在反应8h后，就将大部分的底物转化完全，而阴性对照HB101却无转化活性。
(2)利用氧吸收实验，也可验证加氧酶的活性在加氧酶的酶活测定反应中，NADH浓度的降低表示有加氧反应进行，紫外分光光度计的NADH摩尔吸光系数为3300liters·mol-1·cm-1。酶活以每毫克蛋白每分钟催化1umol NADH的氧化反应表示。该实验结果也证实含目的基因的重组菌株构建的反应体系中，NADH浓度的降低速度明显快于阴性对照HB101大肠杆菌。这一实验结果也验证了加氧酶基因的存在。
(3)利用高效液相色谱仪HPLC检测细胞提取液中的代谢中间产物，检测出辅酶A(CoA)硫酯的形成，从而验证了辅酶A(CoA)连接酶功能。
实施例4大肠杆菌重组菌株降解试验底物转化实验先用液体LB氨苄(100ug/ml)抗性培养基培养重组菌株，离心收集菌株，超声波破碎细胞，超速离心，获取细胞提取液。取反应混合物做适当稀释，在kpi缓冲体系中，用紫外-可见分光光度扫描分析重组大肠杆菌对底物的利用。结果显示，由重组菌株获取的细胞提取液在60min内可使2-萘酸吸收峰值显著降低(约降低50％)；用同样的方法检测该细胞提取液对苯甲酸钠的降解作用，发现该细胞抽提液对苯甲酸钠同样有降解作用(60min后吸收峰值降低1/3)。
权利要求
1.一种2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段，该DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No1。
2.权利要求1所述的2-萘酸降解菌的DNA片段含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因。
3.权利要求2所述的2-萘酸单加氧酶基因序列为SEQ ID No1中所示编号为第2793-3951位的核苷酸序列，共1158bp。
4.权利要求2所述的2-萘酸单加氧酶基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No2。
5.权利要求2所述的辅酶A(CoA)连接酶基因序列为SEQ ID No1中所示编号为第4042-5793位的核苷酸序列，共1751bp。
6.权利要求2所述的辅酶A(CoA)连接酶基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No3。
7.含有权利要求1所述的DNA片段的重组表达质粒。
8.含有权利要求7所述的重组表达质粒的重组菌株。
9.含有如权利要求8所述的重组菌株为大肠杆菌HB101重组菌株。
10.一种制备具有降解2-萘酸活性的DNA片段的方法，包括以下步骤从2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)菌株中提取总DNA，经限制性内切酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌HB101，获得含有一段8050bp，上有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因的DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株。
11.权利要求8所述的重组菌株用于降解偶氮芳香族化合物。
12.权利要求8所述的重组菌株用于2-萘酸的降解。
全文摘要
本发明公开了由2－萘酸降解菌(Burkholderiasp.JT1500)总DNA获得的一段8050bp的DNA片段及其制备方法，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌获得重组菌株，通过核苷酸序列和氨基酸序列比对，证实该DNA片段含有2－萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，所表达的单加氧酶起羟化底物作用，辅酶A(CoA)连接酶基因则使底物连上辅酶A，为进一步的降解创造条件。含有该DNA片段的重组菌株具有高效降解2－奈酸和苯甲酸钠等作用，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。
文档编号C07H21/04GK1618971SQ20031011223
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者孙国萍, 李小波, 郭俊, 方向平, 许玫英, 任随周, 曾国驱 申请人:广东省微生物研究所