专利名称：：亲和纯化方法
技术领域：
：本发明涉及亲和纯化方法和用于此方法的结合剂。
背景技术：
：从EP-A-434317知道在亲和纯化中使用结合剂。此文献揭示，将小的特异性结合剂固定化在固相载体上是有可能的。所述结合剂主要由相应的VH和VL结构域蛋白通过其间的自然相互作用保持在一起而组成。这些小的结合剂在固定化时保持与其目标配体的亲和力。该公开技术的一个实例为抗溶菌酶Fv在琼脂糖上的固定化和其作为免疫吸附剂的用途。在柱内装填包含固定化抗溶菌酶Fv的免疫吸附剂，并在此柱上荷载溶菌酶和其它蛋白质的混合物。洗涤此柱以除去未结合的蛋白质，接着洗脱出结合的蛋白质。在这种类型的免疫亲和系统中，免疫吸附剂的结合强度、特异性和容量是重要的参数。结合强度和特异性指的是结合剂与目标之间的结合。结合剂尤其为抗体或其片段，且结合对目标具有高度特异性。理想的是，使与目标的特异性结合最大化且使非特异性结合最小化。只以非常狭窄的特异性进行结合，是基于蛋白质A和蛋白质L的商业纯化系统的基础。已知这些蛋白质能结合多种免疫球蛋白分子，例如来自人、小鼠和大鼠的免疫球蛋白。应该使结合的强度在良好的结合与使用温和洗脱条件的愿望之间达到平衡，良好的结合使得柱容易荷载上目标材料且在洗脱之前无目标材料被洗脱，而使用温和洗脱条件可避免对目标分子造成不必要的损害。极为严格的洗脱条件是不合需要的，因为这些条件可能导致目标材料的变性、断裂或其它缺陷。另外，温和的条件对柱内材料有益，可延长其寿命。免疫吸附剂的容量表示免疫吸附材料在结合条件下可结合的目标材料的量。一旦达到免疫吸附材料的最大容量，再荷载目标材料也不引起结合，反而将导致目标材料泄漏在洗脱液中。此种情况将导致蛋白质纯化的产量受损，或需要包括(重复进行的)其它加工步骤。在EP-A-434317中，这些目标中有些是例如通过使用对抗原的亲和力减小的可变结构域，以便可以在较温和的条件下进行洗脱或解吸附来实现的。通过将结合剂的尺寸减小到结合所要求的最小尺寸来减少非特异结合。虽然这些措施在某种程度上可以改进免疫吸附剂的容量、特异性和亲和力特征，但是仍然需要进一步改进的免疫吸附材料。
发明内容已惊人地发现，包含能与目标上至少两个表位结合的特异性结合剂(优选为抗体或其片段)的免疫吸附材料具有理想的高亲和力，同时仍可在温和的条件下进行洗脱。发现当它用作柱色谱的材料时，可导致柱具有高容量。因此，本发明涉及通过免疫亲和纯化目标分子的方法，所述方法包括使用包含对在目标分子中至少出现两处的表位具有结合亲和力的结合剂的免疫吸附材料。另一方面，本发明涉及通过免疫亲和纯化目标分子的方法，所述方法包括使用包含至少两种不同结合剂的免疫吸附材料，其中所述结合剂包括对目标分子上的表位(一)具有结合亲和力的结合剂和对目标分子上的另一表位(二)具有结合亲和力的结合剂。又一方面，本发明涉及包含对在目标分子上至少出现两处的表位具有结合亲和力的特异性结合剂的免疫吸附材料。图1人κ和人λ轻链结合VHH的比对和CDR区域的共有序列。图2Biacore亲和力测量的传感图；VHHHu-κ-1包覆的传感器芯片上的BiacoreFab和IgG结合曲线(A结合和解离；B只有解离)表明了由亲合力所引起的对解离速率(kdiss)的作用。图3人κ轻链结合VHH分子的CDR氨基酸序列。图4人λ轻链结合VHH分子的CDR氨基酸序列。具体实施例方式目标分子定义为应能与结合剂(例如抗体)结合的分子。目标分子的实例有需要纯化的蛋白质、待鉴定的蛋白质。结合亲和力(KD)是就特异性结合而言来定义的，代表性的亲和力是至少1×106M-1。优选的是，结合亲和力(在分离的结合剂和目标上测量)为至少1×107M-1，更优选为至少1×108M-1。免疫吸附材料在本发明中应理解为意思是载体与固定化在载体上的结合剂的组合。载体可以是可用于结合剂的固定化的任何材料。合适实例为包载结合剂的基质材料、展示结合剂的细胞表面和可与结合剂共价连接的聚合物。亲和色谱领域的技术人员熟知例如琼脂糖(Sepharose)的合适载体。结合剂优选通过共价键固定化在载体上。表位定义为目标分子中被结合剂结合的部分。如果结合剂是抗体，那么表位就是用目标分子对某物种进行免疫时目标分子中引发免疫学反应的部分。通常表位是目标分子中发生与抗体的结合的位点。表位优选为自然存在于目标分子中。表位任选为被人工包括在目标分子中的序列。优选将多个相同或不同的表位包括在在目标分子中，以便于目标分子的纯化和检测。结合剂是能以所要的结合亲和力与目标分子发生特异性结合的组分。结合剂优选为单特异性结合剂。包含单特异性结合剂的组合物，例如本发明的免疫吸附材料，应理解为意思是具有同种结合剂群体的组合物。顾名思义，单特异性结合剂对单一表位或配体具有特异性。不过本发明中明确包括以下这一点，即免疫吸附材料可包含一种以上类型的单特异性结合剂，每一类型都由同种群体组成。但是，通常在本发明的情况下，免疫吸附材料将不包含4、6、8、10或20种以上的不同单特异性结合剂。非常优选的是，结合剂为抗体或其片段。在这种情况下，单特异性结合剂因此为单克隆抗体或其片段，其可由杂交瘤获得或由克隆编码序列表达。因此，本文所用的术语单特异性结合剂排除了多克隆抗体和抗血清。可使用的合适片段的实例为抗体的被称作CDR(互补决定区)的结合部分。这些片段可合适地插入天然或合成的支架分子(例如合成肽)上。本发明涉及免疫亲和纯化方法，所述方法包括使用在至少两个位置与目标分子结合的结合剂。这被称作多价结合。在一实施方案中，结合剂与在目标分子上至少出现两处的表位结合。在另一实施方案中，此方法使用至少两种不同的结合剂，每一种结合剂与目标分子上的不同表位结合。因此，本发明涉及通过免疫亲和纯化目标分子的方法，所述方法包括使用包含结合剂的免疫吸附材料，所述免疫吸附材料包含a)对目标分子中至少出现两处的表位具有结合亲和力的结合剂；b)或包含对目标分子上的表位(一)具有结合亲和力的结合剂和对目标分子上的另一表位(二)具有结合亲和力的另一结合剂。下文介绍此方法的优选的其它步骤。在一替代实施方案中，本发明涉及通过免疫亲和纯化目标分子的方法，所述方法包括使用根据上述(a)或(b)的结合剂以及至少一种显示与目标分子的单价结合的结合剂。如果单个结合剂对目标的结合亲和力低于1×108M-1，那么所述多重结合剂组合就尤其适用。本发明的方法优选为上述(a)与(b)的组合。在一优选实施方案中，本发明涉及纯化目标分子的方法，其中所述方法包括使目标分子与包含至少一种单特异性结合剂的免疫吸附材料结合的步骤，其中所述结合剂对目标分子上至少两个空间上隔离的表位具有亲和力。优选地，目标分子上至少两个表位的空间隔离使得目标分子上第一表位与结合剂的结合基本上不影响第二表位或另外的表位与结合剂的结合。这意思是目标分子上第一表位与结合剂的结合基本上不减少或“阻碍”第二表位或另外的表位与结合剂的结合。基本上不存在阻碍在本文中应理解为意思是目标分子上第一表位与结合剂的结合不会使第二表位或另外的表位与结合剂的结合减少50％、40％、30％、20％、10％或5％以上。基本上不存在阻碍可通过标准的交叉阻碍测定(例如参考“UsingAntibodies”E.HarlowandD.Lane，ColdSpringHarborLaboratoryPressNY，1999)或按本文实例5所述来判定。因此，目标分子上至少两个表位的空间隔离优选使得目标分子上的至少两个表位可供与免疫吸附材料上的结合剂结合。因此，至少两个表位的空间隔离其结果导致多价结合。多价结合导致目标分子对包含结合剂的免疫吸附材料的解离速率(k-diss)显著降低，而KD值显著升高。优选地，目标分子上存在至少两个空间上隔离的表位，会使得其对包含结合剂的免疫吸附材料的亲和力或KD值与只包含单一拷贝的相同表位的目标分子的亲和力或KD值相比，至少增加5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。本文认为120fM是比(例如)6.3nM高的亲和力或KD值。因此，与只包含单一拷贝的相同表位的目标分子相比，目标分子上存在至少两个空间上隔离的表位，会产生从而引起(producesthusinduces)对包含结合剂的免疫吸附材料的亲合力(avidity)。亲合力在本文中应理解为指较大的结合剂复合体对具有多个结合位点的目标分子的结合的强度，即多价结合的结合强度。另一方面，亲和力(affinity)所指的是简单的单价受体配体系统。因此，在一优选实施方案中，免疫吸附材料对目标分子的亲合力比结合剂对目标分子上的单个表位的最低亲和力至少高5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。最低亲和力在本文中指的是这样的情况，其中免疫吸附材料包含一种以上类型的针对目标分子上的免疫学上不同表位的结合剂，且其中每一类型的结合剂对其表位可以具有不同亲和力。在某单一类型的结合剂结合重复出现在目标分子上的表位的情况下，最低亲和力为该结合剂对只包含单一拷贝的所述表位的测试分子的亲和力。因此，目标分子上至少两个表位的空间隔离，进一步优选地使得包含结合剂的免疫吸附材料对该目标分子的动态结合容量，与该材料对只包含单一拷贝的所述表位的目标分子的动态结合容量相比，增加至少10％、20％、50％、100％或200％。动态结合容量(DBC)在本文中定义为洗脱峰面积除以总峰面积(直流(flowthrough)+洗脱)再乘以目标分子的量(参考实施例3)。本发明的另一重要特征在于，虽然目标分子与免疫吸附材料的多价结合导致对目标分子的高结合亲和力或亲合力，但仍然可以在温和洗脱条件下释放出所述分子。因此，在一优选实施方案中，包含结合剂的免疫吸附材料对目标分子的亲合力至少为1×109M-1、1×1010M-1、1×1011M-1或1×1012M-1。同时优选地，在2.5、2.75、3.0、3.25、3.5或更高的pH值下，可从免疫吸附材料洗脱出至少90％的目标分子。但是，结合剂对目标分子上的表位的单个亲和力优选为小于1×1010M-1、1×1011M-1或1×1012M-1。当目标分子上的至少两个表位在空间上隔开至少10、20、25、30、40、50或60埃时，可获得上文定义的目标分子与免疫吸附材料的结合特征。在本发明的方法中，目标分子上的至少两个表位可为至少两个免疫学上不同的表位。在这种情况下，在免疫吸附材料中需要至少两种不同结合剂，优选为每一个免疫学上不同的表位需要一种结合剂。或者，在本发明的方法中，目标分子上的至少两个表位可为至少两个在该目标分子上重复存在的免疫学上相同的表位。在这种情况下，在免疫吸附材料中只需要单一类型的结合剂。具有重复表位的目标分子例如是同型多聚蛋白质，例如包含2个轻链和2个重链的免疫球蛋白。所述方法优选包括选择结合剂的步骤。此选择优选在模拟荷载和洗脱条件的条件下进行，以找出在荷载时能以充分的亲和力结合目标分子且也容易被洗脱的结合剂。在本发明的一个实施方案中，结合剂应对在目标分子上至少出现两处的表位具有结合亲和力。通过所述选择，就选择出可与目标分子进行多价结合的结合剂，尤其是抗体或其片段。在使用中，两种单独的结合剂，尤其是抗体分子，可与相同目标分子的不同表位结合，从而导致目标分子的多价结合。此多价性使得免疫吸附剂的结合亲和力和容量以令人吃惊的高水平增加。虽然不希望受任何理论的限制，但仍然认为多价结合对于获得高亲和力(更确切的是亲合力)、高动态结合容量和温和洗脱(这些是本发明的目标)来说是必需的。所述抗体或其片段的实例是能特异性识别人抗体的κ或λ轻链上存在的表位的抗体。在此实例中，人抗体是目标分子。人抗体包含两条包含有表位的κ轻链。在本发明的另一实施方案中，在选择步骤中选择出至少两种结合剂，包括一种对目标分子上的表位(一)具有结合亲和力的结合剂和一种对目标分子上的另一表位(二)具有结合亲和力的结合剂。在使用中，吸附剂材料将包含可同时与相同目标分子结合的所述两种不同的结合剂，尤其是抗体或其片段，这同样导致对目标分子的多价结合。如上文所述，目标分子的多价结合，即每个目标分子通过至少两个结合剂-表位键与免疫吸附材料结合，是本发明的优选方面。应了解，如果目标分子的3维结构使得它允许此多价结合出现，那么这一多重结合就会最理想地发生。实际上，这意味着目标分子上的两个表位之间优选存在一定距离。目标分子的多价结合适宜性可从其3D晶体结构推导出。在选择抗体或片段后优选进行大量生产。合适的生产系统包括酿酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)或其它酵母、霉菌或细菌表达系统。优选在这之后接着是使结合剂与免疫吸附材料接触的步骤。免疫吸附剂和结合剂可共价连接或通过其它相互作用连接。优选结合剂与免疫吸附材料共价偶联。已知有多种用于在吸附剂材料上固定化蛋白质或片段的方案。应了解，当提到免疫吸附剂包含“一种”或“某种”结合剂时，意思是也指免疫吸附材料荷载有许多单个结合剂分子的情况。合适免疫吸附材料的实例包括多孔固相载体材料，例如琼脂糖、聚苯乙烯、可控孔径玻璃、纤维素、右旋糖苷、硅藻土、合成聚合物(例如SepharoseTM)、多孔无定形二氧化硅。载体材料可以是任何合适的形式，例如颗粒、粉末、薄片、珠粒、过滤料等。关于合适载体材料的更多清单例如揭示于EP-A-434317中。有多种方法可供通过选定的官能团来快速、容易并安全地固定化配体。偶联方法的正确选择取决于待固定化的物质。例如，下列商业上公知的SepharoseTM衍生物使得可便利地将蛋白质固定化于其上CnBr活化的SepharoseTM4B可使含有伯氨基的配体能够通过自发反应被快速固定化。AH-SepharoseTM4B和CH-SepharoseTM4B两者都具有六碳长度的间隔臂，且允许分别通过羧基和氨基进行偶联。柔性间隔物适用于目标分子的柔性有限的情况，或目标的3维结构需要结合剂有某种程度的柔性以使最佳结合得以发生的情况。活化的CH-SepharoseTM4B提供六碳长度的间隔臂和用于通过氨基自发偶联的活性酯。这些只是合适的固定化途径的几个实例。任选地，将免疫吸附材料放入柱中以有助于容易进行色谱分离。在优选的下一步骤中，使免疫吸附材料与包含目标的组合物接触。所述组合物通常是除待纯化的目标以外还包含许多其它蛋白质的含水组合物。此接触步骤的条件是使得结合剂与目标分子发生结合的条件。在此步骤中，优选使用pH值约6.5至8的荷载缓冲液。合适的缓冲液是PBS缓冲液。优选的是冲洗所荷载的材料直到洗脱出非特异性的结合剂。下一步是目标分子的解吸附。优选通过改变条件使得抗体或片段不再结合目标分子来进行此解吸附。可以通过改变涉及pH值、盐、温度或任何其它合适量度的条件来实现洗脱。优选的进行解吸附的洗脱方法是用pH低于3的缓冲液洗脱。更具体来说，本发明涉及通过免疫亲和纯化目标分子的方法，所述方法包括以下步骤a)选择能与目标分子上至少出现两处的表位结合的抗体或其片段；b)使所述抗体或其片段与免疫吸附材料结合；c)使所述免疫吸附材料荷载以包含目标分子的组合物，优选在会发生结合剂与目标分子的多价结合的条件下荷载；d)洗涤受荷载的免疫吸附剂以除去非特异性结合剂；和e)通过施加洗脱条件来洗脱目标分子。结合剂可衍生自任何合适的源生物，或者可通过合成法制备或通过遗传修饰的生物来制备。重要的是，所述片段保持本发明上下文中所定义的结合亲和力。合适片段的实例是Fab片段、Fv片段。在一个优选实施方案中，结合剂是抗体，更优选的是所述抗体或其片段衍生自天然无轻链的抗体。例如，通过对骆驼或鲨鱼进行免疫并纯化由此产生的抗体来获得所述抗体。这些抗体只包含重链而无轻链。使用这些抗体的优势在于它们即使在较高温度下仍异常稳定，它们较小且容易在宿主生物(例如酿酒酵母)中生产。这些抗体更详细描述于EP-A-656946中。更具体说来，结合剂优选包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，所述可变结构域在单一多肽链中包含针对目标分子上的表位的完整抗原结合位点。因此，所述结合剂特别包括但不限于1)可从骆驼和鲨鱼体内获得的、只由重链组成而天然无轻链的抗体；2)1)中所定义的抗体的可变结构域，通常被称作VHH结构域；3)工程改造形式的1)中所定义抗体，例如“骆驼化(camelidised)”抗体，其中骆驼(或鲨鱼)VHH结构域的构架序列用从其它来源获得的CDR接枝；4)工程改造形式的免疫球蛋白样可变结构域，其中来自多种免疫球蛋白样分子的构架序列与对给定目标分子具有特异性的CDR组合在一起，例如WO04/108749中所述。下文给出CDR和构架序列的定义。另外应了解到，在单一多肽链中包含针对目标分子上的表位的完整抗原结合位点的免疫球蛋白衍生可变结构域，其构架氨基酸序列优选与SEQIDNo1-33中任一个的构架氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的氨基酸一致性。免疫球蛋白衍生的可变结构域优选具有如上文所定义的对表位的亲和力。优选的结合剂是衍生自骆驼抗体的单一结构域抗体片段。衍生自骆驼抗体在本文中只意味着所述片段的构架氨基酸序列如上文所定义，但所述片段可以是设计并合成出来的，而并非直接获自或形成于骆驼生物体。已发现，本发明的包含能与人抗体κ轻链特异性结合的结合剂的免疫吸附材料，显示出极好的亲和力、容量，而且只需要温和的洗脱条件。因此，在一具体实施方案中，本发明涉及包含对人抗体κ轻链具有结合亲和力的结合剂的免疫吸附材料。本发明进一步涉及所述材料在纯化人抗体中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及选自以下的结合剂选自SEQIDNo1-15的κ轻链结合VHH分子或包含免疫球蛋白衍生的可变结构域的结合剂，所述可变结构域包含的互补决定区(CDR)1、2和/或3显示与SEQIDNo1-15的VHH分子的CDR有至少80％、85％、90％、95％、98％氨基酸一致性。优选地，免疫球蛋白衍生的可变结构域对人抗体的κ轻链具有至少106M-1、107M-1或108M-1的亲和力。CDR1、2和3可各自分别显示上文定义的一致性，或者这些CDR可共同显示上文定义的一致性。VHH分子的互补决定区(CDR)1、2和/或3在本文中如图3和4中的描述所定义。更一般来说，在本文中如Vu等人所述(1997，MolImmunol.34(16-17)1121-31)来定义骆驼可变重链结构域的CDR。SEQIDNo1-33中除CDR序列以外的VHH序列或如Vu等人(1997，见上)所定义的VHH序列在本文中定义为VHH构架序列。在另一更具体的实施方案中，本发明涉及包含具有下文指定为序列ID1的氨基酸序列的抗体或其活性片段的免疫吸附材料。序列ID1QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTISRYAMSWFRQAPGKEREFVAVARRSGDGAFYADSVQGRFTVSRDDAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAIDSDTFYSGSYDYWGQGTQVTVSS在另一实施方案中，本发明涉及对人抗体具有结合亲和力的抗体或片段，其中它们的序列包含根据序列ID1的序列或基本上与其同源。在本发明的上下文中，基本上同源意思是同源分子显示出至少106M-1的所需结合亲和力。同源序列的实例是在构架中被修饰而不是在根据序列ID1的抗体抗原结合部分中被修饰的序列。在另一实施方案中，本发明涉及选自以下的结合剂选自SEQIDNo16-33的λ轻链结合VHH分子或包含免疫球蛋白衍生的可变结构域的结合剂，所述可变结构域包含的互补决定区(CDR)1、2和/或3显示与SEQIDNo16-33的VHH分子的CDR有至少80％、85％、90％、95％、98％氨基酸一致性。优选地，免疫球蛋白衍生的可变结构域对人抗体的λ轻链具有至少106M-1、107M-1或108M-1的亲和力。CDR1、2和3可各自分别显示上文定义的一致性，或者这些CDR可共同显示上文定义的一致性。在另一实施方案中，免疫吸附材料包含至少两种不同的结合剂，每一种结合剂可结合人IgGFc结构域的免疫学上不同的表位，所述人IgGFc结构域的免疫学上不同的表位如上文所定义是空间上隔离的。在又一实施方案中，免疫吸附材料包含至少两种不同的结合剂，每一种结合剂可结合人血清白蛋白的免疫学上不同的表位，所述白蛋白的免疫学上不同的表位如上文所定义是空间上隔离的。在另一实施方案中，本发明提供非常适用于从粗制品吸附或分离和/或纯化免疫球蛋白(尤其是IgM、IgA、IgE型，最尤其是IgG同种型的人免疫球蛋白)的方法和免疫吸附材料。免疫吸附材料包含天然无轻链的重链作为免疫球蛋白结合剂，所述重链对在目标免疫球蛋白(可为相同或不同目标)上至少出现两处的表位具有特异性，优选为骆驼VHH。在一个优选实施方案中，目标表位可包括出现在κ或λ同种型轻链上的表位，所述目标总是双重出现在完整免疫球蛋白上。在另一实施方案中，表位可能是在免疫球蛋白的Fc部分上出现两处的表位，或者是出现在Fc部分上且同时可易于与VHH结合分子相互作用的两个不同的表位。在又一实施方案中，免疫吸附材料可包含κ或λ结合抗体与Fc结合抗体的组合，优选为通常无轻链的骆驼VHH抗体。如实施例部分对κ结合抗体所证明，使用对在目标免疫球蛋白上至少出现两处的表位具有特异性的免疫球蛋白结合剂，在某些情况下可导致解离速率惊人地降低10倍到1000倍以上。解离速率的降低对于分离和纯化方法是有用的，因为免疫吸附材料的动态结合容量(或保留率)随解离的降低而急剧提高。其次，免疫球蛋白仍然可以在温和条件下洗脱，这对于保留其结构完整性和抗原结合性质而言是至关重要的。在本说明书及其权利要求书中，动词“包含”及其对应的词性变化词语(如“包含的”)以其非限制性意义使用，意思是跟在此词后面的项目被包括在内，但并不排除未具体提到的项目。另外，某要素如以名词单数形式提及，并不排除存在一种以上此要素的可能性，除非上下文中明确要求有且仅有一个此要素。因此，以名词单数形式提及的要素通常意味着“至少一个”该要素。通过下列实施例说明本发明。实施例实施例1针对人抗体κ轻链的骆驼VHH配体的产生以下方案认为是特异性VHH片段如何得以分离、克隆、表达然后偶联到所需基质上的实例。虽然本实施例中所述的特定VHH片段是衍生自免疫细胞库(immunerepertoire)的，但也本该可以选自非免疫化VHH文库(参考EP1051493，Unilever)或合成/半合成的非免疫化VHH文库(参考WO00/43507，Unilever)。用通过沉淀和凝胶过滤技术从人血清制备并在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4，PBS)中稀释的多克隆IgM对骆驼进行免疫。为了提高免疫反应的特异性，在初始免疫后，用250μg稀释于specol(ID-DLO，Lelystad，TheNetherlands)中的上文提到的抗原对骆驼加强免疫数次(第0、28和49天)(Boersma等人，1992)。在最后一次免疫后6天，采集约150ml的肝素血样。通过Ficoll-Paque离心法获得外周血细胞。基本上如Chomczynnski和Sacchi(1987)所述从约2×108个淋巴细胞分离总RNA。接着可使用类似于WO94/04678(Casterman等人)中所述的方法分离编码特异性VHH片段的DNA，并如之前Frenken等人(2000)所述连接到(例如)附加型酿酒酵母表达载体中。可以通过直接筛选各个酿酒酵母菌落的培养上清液，从这些VHH表达文库中选择出具有所需的抗原结合特异性(对人抗体的κ或λ轻链)的VHH片段(Frenken等人，2000)。或者，可以使用基于展示技术(例如噬菌体展示和酵母展示)的选择方法，来从免疫细胞库中分离出能产生抗κ轻链VHH的克隆。为了进行筛选，将NuncMaxisorp结合平板包覆以人抗体抗原，接着用4％(w/v，PBS中)奶粉封闭。结合的VHH片段通过小鼠抗HismAb联合多克隆山羊抗小鼠HRP缀合物(Bio-Rad，172-1011)或多克隆兔抗骆驼VHH血清联合多克隆猪抗兔IgG-HPO缀合物(Dako，P217)来检测。在包覆以具有κ轻链的人IgG1单克隆抗体或具有λ轻链的人IgG1单克隆抗体的Maxisorp平板上进行最初的筛选。将显示只结合IgG1κ的骆驼VHH片段进一步通过ELISA对不同的人单克隆抗体(例如IgG、IgA、IgM)进行测试，以证实对人κ轻链的结合特异性。在筛选过程中，可以对显示对人λ轻链的结合特异性的其它VHH片段进行鉴定。通过ELISA确定的一个抗人κVHH片段(VHHHu-κ-1)的结合特异性在表1中给出，并在本文中与能特异性结合人IgG抗体Fc部分的两种其它VHH片段(分别是VHHsHu-Fc-1和Hu-Fc-2)相比较。这些VHH片段从来源于用由来自人血清的多克隆IgG制备的人Fc片段免疫的骆驼的免疫VHH文库获得。如表1中所表明，VHHHu-κ-1能识别在人抗体κ轻链上出现的表位，因此能与在目标分子上出现两处(例如IgG、IgA和IgE抗体的情况下)或十次(在IgM抗体的情况下)的表位结合。Hu-Fc-1和Hu-Fc-2这两种VHH片段都显示对在所有4种人IgG亚类的Fc结构域上出现的表位具有特异性，所述表位在IgG目标分子中只出现一次。对于这些抗体的序列，κ轻链结合VHH在序列ID1-15中给出，λ轻链结合VHH在序列ID16-31中给出。图1显示κ和λ结合VHH的共有序列。表1通过ELISA确定的抗人κ轻链和抗人TgGFcVHH片段的结合特异性抗体生产和固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化使用遗传修饰的酿酒酵母菌株以1升或10升(摇瓶)的发酵规模生产VHH抗体片段，并使用SP琼脂糖凝胶FF(AmershamBiosciences)离子交换层析进行纯化。纯化的抗体用截断分子量为3.5kDa的管子(Spectra/Por3；SpectrumMedicalIndustries)在4℃下进行48小时透析，期间三次更换PBS缓冲液(pH7.4)或所要求的偶联缓冲液。纯化样本的浓度以OD280来测定。所有纯化样本在不使用时都保存在-20℃下。实施例2亲和力测量在BiaCore3000上用表面等离振子共振分析(SPR)测定VHH片段Hu-κ-1、Hu-Fc-1和Hu-Fc-2的结合亲和力常数。为此目的，将已纯化的VHH片段固定化在CM5传感器芯片表面上，接着与HBS-EP缓冲液中(0.01MHEPES，pH7,4；0.15MNaCl；3mMEDTA；0.005％表面活性剂P20)的不同浓度的人Fab和/或人IgG抗体一起温育。以30μl/min进行结合3分钟，接着以30μl/min进行15分钟解离步骤。使用Biacore软件，根据1∶1的朗缪尔结合模型(Langmuirbindingmodel)对结合曲线进行拟合。表2中总结了计算出的亲和力数据。对于抗Hu-κ-1片段，Fab分子与IgG分子之间解离速率的较大差异明确证明了亲合力的作用。由于抗Hu-κ-1片段固定化在传感器芯片的表面上，因此所述表面可以同时与一个IgG分子上存在的两个相同表位发生相互作用。相比于与人Fab片段的单价相互作用，对IgG的解离速率(kdiss)显著较低(＞1000倍)，结果对IgG的KD值约为120fM，相比之下对Fab片段的KD值为6.3nM。后一值与两种抗Hu-FcVHH的KD值(对IgG分别是6.4和2.2nM)在同一范围内，表明是单价相互作用。表2抗Hu-κ-1和抗Hu-FcVHH(固定化在传感器芯片上的VHH)的Biacore亲和力数据由亲合力引起的这一对解离速率(kdiss)的作用通过图2进一步说明，图2比较了Fab和IgGBiacore结合曲线(传感图)。实施例3偶联和色谱试验的通用材料和方法与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化的琼脂糖4FF偶联抗体纯化之后透析到NHS偶联缓冲液中。所述缓冲液含有0.1MHEPES(pH8.3)。为获得最优的偶联效率，偶联溶液/NHS琼脂糖的推荐体积比为0.5∶1。抗体具有不同的浓度(0.5-15mg/ml)，抗体/NHS琼脂糖的比率在1∶1与10∶1之间变动。当将2种配体的混合物固定化在基质上时，使用1∶1的配体比率。使用以下程序来使抗体与NHS活化的琼脂糖4FF(GeneralElectricHealthcare)偶联。随后将基质用NHS偶联缓冲液洗涤两次。将NHS琼脂糖凝胶与抗体溶液混合，并在4℃下颠倒(headoverhead)静置过夜，或在室温下静置1小时。温育后，通过烧结玻璃过滤器过滤凝胶材料，并将凝胶材料的未反应基团在室温下用Tris(0.1M，pH8.0)封闭1小时。交替使用低pH值和高pH值(3×10cvPBSpH2和3×10cvPBSpH7.4)洗涤偶联介质。使用未结合的流分来测定偶联效率。这是通过测量偶联溶液在偶联前后的OD280值来测定的。还通过观察偶联溶液在偶联前后的SDS-PAGE蛋白质图谱来确定偶联效率。色谱实验用HR5/5柱(GEhealth)与偶联的抗体基质构成色谱柱。使用400μl的柱体积。所有色谱实验都在Aktaexplorer100上进行。使用两缓冲液系统，缓冲液A1即荷载缓冲液是PBSpH7.4，缓冲液B即洗脱缓冲液例如是添加有8MHCl以使pH为2.1的PBS，或pH值为2或3的0.1M甘氨酸-HCl。使用不同的程序。通过监测OD214和OD280的信号在线进行蛋白质检测。收集各流分，体积为1ml。立即用20μlTris(2M)中和这些流分。抗体偶联基质的动态结合容量的测定为测定动态结合容量，对柱荷载以目标分子。使用150cm/h的流速。通过对直流和洗脱峰面积的积分来计算直流液和洗脱液中目标分子的量。动态容量是洗脱峰面积除以总峰面积(直流+洗脱)再乘以目标分子的量。实施例4针对人IgG的不同VHH基质的动态结合容量如早前文献所述，将VHH片段(配体)Hu-κ-1、Hu-Fc-1和Hu-Fc-2固定化到NHS琼脂糖上。配体密度是每毫升基质20毫克配体。使用上文所述的程序测定动态结合容量。使柱荷载以人IgG，荷载量高于预期动态结合容量。使用pH值在2与4之间的0.1M甘氨酸缓冲液进行洗脱。发现Hu-κ-1基质对人IgG的动态结合容量(DBC)最高，与Hu-Fc-1基质和Hu-Fc-2基质两者相比高近乎2倍，这由表3可看出。亲和力测量显示，此抗体对人IgG分子(含有2条相同的κ轻链)的结合亲和力(KD)是约120fM。此值显著高于就单价结合Fab片段所测出的Hu-κ-1对其在κ轻链上所存在的表位的实际结合亲和力(6.3nM)。后一数字较多地在所测试的两种人Fc特异性VHH片段和本领域公知的组合物的范围内。这表明与不包括多价结合特征的系统相比，使用本发明的免疫吸附材料导致结合容量增加。本发明的另一重要特征在于，虽然多价结合配体导致对目标分子的高结合亲和力，但仍然可以在温和洗脱条件下释放出所述分子。如表3所显示，Hu-Fc-2基质的最佳洗脱pH值(pH2)低于Hu-κ-1和Hu-Fc-1基质(两者都是pH3)。Hu-Fc-2片段对人IgG上的其表位的结合强度比Hu-Fc-1和Hu-κ-1几乎高3倍(2.2nM对6.4nM和6.3nM)。虽然Hu-κ-1基质的多价结合使得对人IgG的动态结合容量与例如Hu-Fc-1基质相比得以增加，但这一亲合力特征显然不影响据以获得结合IgG的有效释放的条件。所述条件与不包括多价结合特征的系统(例如Hu-Fc-1基质)的条件相当。本实施例中提到的结果是按低的床高度和短的停留时间来测量的。较高的床高度将增加停留时间和动态容量。所述的Hu-κ-1柱在15cm床高度和150cm/hr线性流速下的动态容量是每毫升基质30到40毫克人IgG。此值与不包括多价结合特征(此特征为本发明所特有)的已知系统的容量相比高约2倍。本实施例此外还证明，本发明的多价原则使高结合容量这一方面与温和洗脱条件这另一方面得以独特地组合在一起。表3抗人IgG基质的动态结合容量(DBC)的比较。实施例5包含能结合目标分子中存在的不同表位的VHH的、针对人IgG的基质的动态结合容量本实施例证明使用至少两种不同VHH配体进行的多价结合所引起的结合容量增加这一特征，每一种配体识别目标分子上的不同表位，在本实施例情况下目标分子为人IgG抗体。为此目的，使用两种抗人IgGFc配体(Hu-Fc-1和Hu-Fc-2)，如Biacore结合分析(参考表4)所证实，每一种配体结合人IgG抗体的Fc结构域上存在的不同表位。在此Biacore实验中，将纯化的抗人IgGFc配体固定化在CM5传感器芯片表面上，接着与人Fc片段一起温育。在这一人Fc捕捉步骤后，接着是与VHH配体Hu-Fc-1或Hu-Fc-2一起温育。表4显示，在由固定化的VHH配体Hu-Fc-1进行捕捉时，VHH配体Hu-Fc-2可与人Fc片段结合，反之亦然(分别是51RU和181RU)，这证明每一种配体结合人IgG抗体的Fc结构域上存在的不同表位。在此装置中使用相同的配体对，未获得显著的结合信号，表明各个配体结合的表位在人IgG抗体的Fc结构域上只存在一处或可利用一次。表4Biacore中抗Hu-FcVHH对所捕捉的人Fc片段的结合信号这进一步说明，虽然IgG抗体由两种相同的重链和轻链组成，但是针对抗体的配体可识别由相同链组合形成的表位，例如所述抗体Fc结构域中存在的表位。可能出现的另一特征是，配体与Fc结构域的重链的一部分相结合，结合方式使得它由于位阻的缘故而阻碍另一相同配体的结合。就此而言，已证明实施例4所示的抗体的轻链结构域(例如抗人κ轻链)，是产生如下特异性配体的理想表位，所述特异性配体使得与在抗体的情况下出现两处的表位的多价结合得以发生。所述配体显然不受此位阻特征的影响。使用前述方法将三批不同的抗人IgGFc基质(Hu-Fc-1、Hu-Fc-2和Hu-Fc-1/2)构造在NHS琼脂糖上。对于每一种基质来说，最终的配体密度是每毫升基质2毫克配体。使用前述程序测定动态结合容量。使柱荷载以人IgG，荷载量高于预期的动态结合容量。由表5可见，混合基质Hu-Fc-1/2的动态结合容量高于每一单独基质。混合基质的动态结合容量(2.45mg人IgG/ml基质)比各单独基质的平均值(1.65mg人IgG/ml基质)高1.5倍，此平均值是要是在混合基质上没有发生多价结合时最大可能预期到的。基于本发明的多价结合原则，这些结果证明，使用不同配体的组合可以获得高结合容量基质，每一种配体与目标分子上所存在的不同表位结合。表5混合抗人IgG基质的动态结合容量(DBC)的比较实施例6包含能结合目标分子中存在的不同表位的VHH的、针对人血清白蛋白的基质的动态结合容量本实施例证明通过使用至少两种不同VHH配体进行的多价结合所引起的结合容量增加这一特征，每一种配体识别目标分子上的不同表位，在本实施例情况下为人血清白蛋白。为此目的，使用三种不同的抗人血清白蛋白(HSA)特异性VHH配体(HSA-1、HSA-2和HSA-3)。这些VHH配体从来源于用人血清白蛋白免疫的骆驼的免疫VHH文库获得。根据前述方法进行的Biacore结合分析揭示，配体HSA-2和HSA-3与HSA上存在的同一表位结合，而配体HSA-1与另一表位结合，这使得当将VHH配体HSA-1与VHH配体HSA-2或HSA-3组合使用时HSA的多价结合得以发生。使用前述方法将五批不同的抗HSA基质(HSA-1、HSA-2、HSA-3、HSA-1/2和HSA-2/3)构造在NHS琼脂糖上。对于每一种基质来说，最终的配体密度是每毫升基质2毫克配体。使用前述程序测定动态结合容量。使柱荷载以HAS，荷载量高于预期动态结合容量。由表6可见，混合基质HSA-1/2的动态结合容量高于每一单独基质和混合基质HSA-1/3的动态结合容量。混合HSA-1/2基质的动态结合容量是2.14mgHSA/ml基质，此值与要是混合基质上不发生多价结合时的1.48mgHSA/ml基质这一预期平均值(1.72+1.23)/2＝1.48)相比高约1.5倍。混合基质HSA-2/3的HSA动态结合容量是0.83mgHSA/ml基质。此值与0.85mgHSA/ml基质这一预期平均值一致，这是因为两种配体与HSA上存在的同一表位结合，因此不能引起如本发明所示的导致结合容量增加的多价结合。表6混合抗HSA基质的动态结合容量(DBC)的比较参考文献Boersma，W.J.A.，Bogaerts，W.J.C.，Bianchi，A.T.J.，Claassen，R，1992.Adjuvantpropertiesofstablewater-in-oilemulsionsevaluationoftheexperiencewithspecol.Res.Immunol.143，503-512.Chomczynnski，P.，Sacchi，N.，1987.SinglestepmethodofRNAisolationbyacidguanidiumthiocyanate-phenolchloroformextraction.Anal.Biochem.162，156-159.FrenkenG.J.，RichardH.J.vanderLinden，PirnWJJ.Hermans，J.WilBosa，RobinC.Ruuls，BernarddeGeus，C.TheoVerrips，2000，JournalofBiotechnology78，11-21.序列表<110>UnileverN.V./BACUnileverN.V.<120>亲和纯化方法<130>P6004885pct/T7116<160>33<170>PatentInversion3.3<210>1<211>121<212>PRT<213>Lamaglama<400>1GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgThrIleSerArgTyr202530AlaMetSerTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheVal354045AlaValAlaArgArgSerGlyAspGlyAlaPheTyrAlaAspSerVal505560GlnGl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20权利要求1.一种纯化目标分子的方法，其中所述方法包括使所述目标分子与包含至少一种单特异性结合剂的免疫吸附材料结合的步骤，且其中所述结合剂对所述目标分子上的空间上隔离的至少两个表位具有亲和力。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子上的所述至少两个表位的空间隔离使得所述目标分子上的第一表位与结合剂的结合基本上不会阻碍第二或另外的表位与结合剂的结合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述免疫吸附材料对所述目标分子的亲合力比结合剂对单个表位的最低亲和力高至少50倍。4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中所述至少两个表位是至少两个免疫学上不同的表位。5.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中所述至少两个表位是重复出现在所述目标分子上的至少两个免疫学上相同的表位。6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述结合剂包含免疫球蛋白衍生的可变结构域，所述可变结构域在单一多肽链中包含针对所述目标分子上的表位的完整抗原结合位点，且由此所述可变结构域的构架氨基酸序列与SEQIDNo1-33中任一个的构架氨基酸序列具有至少50％氨基酸一致性。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述结合剂是衍生自骆驼抗体的单一结构域抗体片段。8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述目标分子是免疫球蛋白或其片段。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少两个表位位于所述免疫球蛋白或其片段的CDR之外。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中至少一个表位存在于所述免疫球蛋白的轻链上。11.根据权利要求8-10中任一权利要求所述的方法，其中所述至少两个表位是人免疫球蛋白的表位。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述表位是κ或λ同种型人免疫球蛋白轻链的表位。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合剂选自以下选自SEQIDNo1-15的κ轻链结合VHH分子或包含免疫球蛋白衍生的可变结构域的结合剂，所述可变结构域包含的互补决定区(CDR)1、2和/或3显示与所述SEQIDNo1-15VHH分子的CDR有至少80％、85％、90％、95％、98％氨基酸一致性。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合剂选自以下选自SEQIDNo16-33的λ轻链结合VHH分子或包含免疫球蛋白衍生的可变结构域的结合剂，所述可变结构域包含的互补决定区(CDR)1、2和/或3显示与所述SEQIDNo16-33VHH分子的CDR有至少80％、85％、90％、95％、98％氨基酸一致性。15.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少两个表位是人IgGFc结构域的至少两个免疫学上不同的表位。16.一种免疫吸附材料，所述免疫吸附材料包含一种或一种以上根据前述权利要求中任一权利要求所述的结合剂。全文摘要本发明涉及免疫亲和纯化方法，所述免疫亲和纯化方法包括使用能与在目标分子上至少出现两处的表位结合的结合剂。在另一实施例中，所述方法使用至少两种不同的结合剂，每一种结合剂与目标分子上的不同表位结合。文档编号C07K1/22GK101072794SQ200580041511公开日2007年11月14日申请日期2005年12月2日优先权日2004年12月2日发明者威莱姆斯·约瑟夫·约翰娜·赫尔曼,马克·罗纳德·滕赫特,安佳·欧维尔申请人:联合利华公司