专利名称：抗岩沙海葵毒素单克隆抗体及其试剂盒、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞系以及它们的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学和免疫学领域，特别涉及一种特异性的单克隆抗体 以及产生该抗体的杂交瘤细胞系，以及含有该单克隆抗体的试剂盒及它们在
冲企测PTX中的用途。
背景技术：
岩沙海葵毒素(Palytoxin, PTX)是从腔肠动物皮沙海葵科沙群海葵属毒 沙群海葵Palythoatoxica中分离得来的一种非蛋白毒素，其是由129个碳原子组 成的聚醚化合物，分子量为2677，含有40个羟基和8个曱基。有极强的神经系 统、心血管系统或细胞系统活性，皮摩尔级浓度的分子即可损伤细胞，而且 PTX的作用速度极快，动物从中毒到死亡的时间仅3 5分钟，是迄今为止在非 蛋白毒素中毒性最强的化合物之一。
岩沙海葵是一种海洋腔肠动物类，它生长在海滨岩石上或半截身子埋在 海沙里或吸附在曱壳类生物的壳上，人类多由误食或不慎接触其触手而中毒。 岩沙海葵毒素属于聚醚类水溶性神经毒素，作用于Na+-K+-ATP酶，阻断钠离 子通道；它是最强烈的血管收缩剂，对冠状动脉的收缩强度比血管紧张素强 IOO倍。中毒症状主要表现为呼吸困难、呼吸衰竭、惊厥、痉挛、运动失调、 嗜睡、四肢无力、虚脱、呕吐、消化道广泛出血、休克、死亡等。由于人类 愈来愈热衷于海鲜产品，使得误食这种毒素造成食物中毒的可能性越来越大， 但是目前对该类毒素中毒尚无特效治疗药物，因此，建立起一种灵敏性高、 特异性强的检测方法用于鉴别高致中毒性海葵种群以及测定供人类食用的海 产品里PTX的分布含量，以减轻或避免PTX中毒事件的发生实为必要。国内外对PTX的研究主要都是围绕PTX对Na-K泵或Ca泵的毒理影响方 面。由于PTX分子量小，不能直接免疫小鼠，甚至是不能直接与载体蛋白连接， 其研究难度较大，研究进程比较緩慢。1988年Levine L等通过使用1125的放射 免疫测定法(RIA)来4全测PTX ( Levine L, Fujiki H， Gjika HB, Van Vunakis H. A radioimmunoassay for palytoxin. Toxicon. 1988; 26(12): 1115-21 ) ， 1992年 Bignami GS等制备出PTX的单克隆抗体，并发展到5种有关PTX免疫检测方法 的报道，包括'间接竟争抑制法(CIEIA)、两种直接竟争抑制法以及直接和 间才矣夹心法(Bignami GS ， Raybould TJ等.Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunoassays for the measurement of palytoxin in biological samples. Toxicon. 1992 Jul; 30(7): 687-700 )。通过比较发现，ELISA的敏感度 是RIA的3倍，检测范围在6-250 ng/ml之间(Frolova GM, Kuznetsova TA, Mikhalov VV， Eliakov GB, Immunoenzyme method for detecting microbial producers of palytoxin. Bioorg Khim. 2000 Apr; 26(4): 315-20),但是该ELISA 实验是采用碱性磷酸酶(AP)作为标记，而且过程过于繁瑣，对实验的环境要求 较高。在我国，最相关的报道只涉及焦红、刘必勇等人制备出PTX多克隆抗体 (焦红，刘必勇,郭素珍,席静,林峰,王家骥.海洋生物岩沙海葵毒素血清免疫抗 体的制备.检验检疫科学.2005(2))以及对岩沙海葵毒素直接酶联免疫吸附检 测方法的研究(焦红，刘必勇，王家骥，林峰.岩沙海葵毒素直接酶联免疫吸 附检测方法的研究)，未见其他更详尽的报道。
发明内容
本发明提供一种抗岩沙海葵毒素(PTX)的单克隆抗体及其试剂盒、产生 该单克隆抗体的杂交瘤细胞系以及它们的用途。
本发明的目的之一是"t是供一种抗岩沙海葵毒素(PTX)单克隆抗体的杂 交瘤细胞系，其保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保
4藏号为CCTCC No. C200922,保藏日为2009-5-19,命名为抗岩沙海葵 毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明的第二个目的是提供所述抗岩沙海葵毒素单克隆抗体的杂交瘤细 胞系分泌的单克隆抗体。
本发明的第三个目的是提供一种能准确方便的检测岩沙海葵毒素的试剂 盒，所述试剂盒含有所述抗岩沙海葵毒素的单克隆抗体。
本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体、含有该单克隆抗体的试剂 盒、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞系在检测PTX中的应用。
本发明建立了一种快速、准确、重复性好、特异性强、灵敏度高的检测 的方法，用于鉴别高致中毒性海葵种群以及测定供人类使用的海产品里PTX 的含量分布，可以有效地减轻或避免PTX中毒事件的发生。
下面将详细介绍本发明的抗岩沙海葵毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞系、 单克隆抗体及其试剂盒和用途。
本发明提供的杂交瘤细胞系，其保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNo.C200922，保藏日为2009-5-19， 命名为抗岩沙海葵毒素单克隆抗体杂交瘤细胞抹，本发明的抗岩沙海葵毒 素单克隆抗体杂交瘤细胞抹，为半悬浮细胞，在安静情况下生长时能轻轻贴 壁于培养瓶上，经吹打能脱落下来，形成细胞悬液。该细胞呈圆形，在光学
显微镜下发亮而透明。
图l为本发明的杂交瘤细胞林在光学显微镜下的图片。如图所示，在光学 显微镜下观察可以杂交瘤细胞成群生长，与图中箭头所指的死细月包所呈现出 的棕色或黑色及其不透明性，有明显的不同。
具体实施方式
本发明先将PTX与异型双功能试剂SPDP反应，然后再偶联载体蛋白KLH 制备完全抗原，免疫Balb/c小鼠，并制备PTX-PDP-BSA偶联物作为检测抗原。 取小鼠脾细胞与NS-1细胞融合，间接ELISA筛选分泌PTX单克隆抗体的杂交瘤 细胞株并制备腹水型单克隆抗体。利用该单克隆抗体初步建立并比较检测PTX 的直接和间接竟争酶免疫学^f企测方法。
实施例一、杂交瘤细胞系的制备
1. PTX与栽体蛋白的偶联
在PH7.5， 0.1M PBS:DMSO19:l的混合液中加入20pg PTX和12iig的 SPDP, 4。C冰箱过夜。混合物加入等量CH2CL2萃取3次，取水层部分过5ml SephadexG-25预装柱，用含0.1MNaCl的PH7.0， O.IMPBS洗脱，收集最大吸 收波长在263nm下的洗脱液。
在0.025M, pH9.0硼酸盐緩沖液中加入45 pg KLH蛋白和50倍摩尔浓度 (2隱iminothiolate: KLH)的2-亚氨基硫醇盐(2-iminothiolate) ， 4。C冰箱过夜。 混合物过截留分子量为30K的超滤管，取上层管液体，在分光光度计下检测 KLH-SH最大吸收波长278nm下的洗脱液，并冻干。BSA-SH的制备跟KLH-SH 相同，收集在279nm下的洗脱液，并冻千。
免疫抗原将PTX-PDP、 BSA-SH和KLH-SH均溶解于PH7.5, 0.1MPBS 中，体积分别为lml、 0.5ml、 0.5ml。然后BSA-SH和KLH-SH都分别加入到等 体积的PTX-PDP溶液中，4。C过夜。然后再过5mlSephadexG-25预装柱，用含 O.lMNaCl的PH7.0, O.IMPBS洗脱，收集分光光度计4全测下收集最大吸收波 长为267nm的PTX-PDP-KLH和最大吸收波长为273歸的PTX-PDP-BSA。
2. 动物免疫以及免疫后血清的检测
将100ng、 150ng、 200ng、 300ng PTX-PDP-KLH分别溶于0.2ml生理盐水， 并用等体积的弗氏完全佐剂充分混合；选用雌性6 8周龄BALB/C小鼠作为免 疫动物多点免疫；2周后取同样体积抗原与弗氏不完全佐剂混合，免疫方法同上；免疫3周后开始检测小鼠血清中抗体效价以PTX-PDP-BSA为包被抗原， 采用间接ELISA法检测；免疫6次后直接取PTX-PDP-KLH 0.2ml腹腔注射加强免疫。
3.细胞融合以及融合后筛选 3.1饲养细胞的培养
处死2 3只8 12周龄的健康BALB/C小鼠，消毒；无菌条件下在小鼠腹腔 注入3ml4。C的基础培养液冲洗腹腔，收集各小鼠腹腔冲洗液，连续操作3次； 1000rpm离心10min,弃上清；用HAT培养液稀释离心沉淀细胞，进行细胞计 数，调整细胞密度为2xl05个/ml，经细胞悬液加入到96孔培养板中，每孑U).lml， 放置到37。C、 5。/。C02的培养箱内培养。 3.2免疫脾细胞悬液的制备
① 取已经免疫的、效价高的BALB/C小鼠，摘除眼^求放血，并分离血清 供抗体检测用，同时将小鼠处死，浸泡于75 。/。酒精中5min,随即方欠入超净台 内。无菌手术打开腹部，取出脾脏，放入己盛有8ml不完全培养基的平皿中 轻轻洗一次，并细心剥去周围结締组织。
② 将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养基的平亚内，置于钢丝网上。用 注射器内芯挤压研磨脾脏，并用平皿内的不完全培养基轻轻沖洗钢丝网，使 脾细胞全部通过钢丝网孔挤压到溶液中。
③ 将脾细胞溶液转至50ml离心管中，加不完全培养基至30ml，混匀。
1000 rpm离心5 min,弃去上清。
⑤ 沉淀细胞再用不完全培养基同法离心洗涤一次，然后将细胞重悬至 10ml,混匀。
⑥ 取脾细胞悬液，加台盼蓝染液作活细胞计数后备用。 3,3 NS-1骨髓瘤细胞悬液的制备① 在融合前2 3天将NS-l骨髓瘤细胞扩大培养于75ml细胞培养瓶中， 每瓶加12 15ml培养液，置37。C， 5 %C02的培养箱内培养。
② 融合时，收集细胞于50ml离心管中。
③ 1000rpm离心5min ,弃上清。
④ 沉淀细胞中加入30ml不完全培养基，同上离心洗涤一次。然后将细 胞重悬至10ml ，混匀。
⑤ 取骨髓瘤细胞悬液，加台盼蓝染液作活细胞计数后备用 3.4脾细月包与NS-1细月包融合
① 将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，按8:1的比例加入到一支50ml离心 管中，补加完全培养基至20ml ，充分混匀；
② 100rpm离心7min ,弃上清；轻叩管底使细胞松散；加入相对分子量 为4000的50。/。的PEG0.7ml ,边摇边加，lmin内加完；
③ 再用吸管吸取细胞，静置30sec ,然后30sec内将细胞吹入离心管中； 在5min内加入20ml完全培养基稀释PEG;⑤800rpm离心7min ，弃上清； 加入10mlHAT培养基，轻轻混匀细胞；
⑥ 将细胞悬液加入含有飼养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml。共加有 两块96孔培养板，将此两块板放入37。C ， 5。/。C02培养箱内培养。
4.融合后筛选
融合后18天用间接ELISA检测细胞培养上清，同时用BSA、 KLH包被抗原 对照以排除与载体蛋白之间的交叉反应，检测方法同小鼠免疫血清的检测。 三天后重复检测一次。
将检测到的阳性孔细胞A6、 B8用有限稀释法克隆化，同时将细胞从96孔 板转移到24孔板中扩大培养，待细胞达到要求数量并处于对数生长期时收集 细胞冻存。以后每次克隆化的细胞用同样的方法检测，并及时将阳性杂交瘤 细胞扩大培养和冻存一批。实施例二、腹水型单克隆抗体的生产与纯化
1. 腹水型单克隆抗体的制备
(1) 小鼠预处理每只BALB/C小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂；
(2) 接种杂交瘤细胞24h后将杂交瘤细胞收集，1000rpm离心7min，弃 上清，用不完全培养基悬浮细胞细胞悬起并计数，每只小鼠注射0.5ml细胞悬 液(约7xl05个/ml)。同时以相同数量的NS-1细胞注射小鼠，制备腹水作为 阴性对照。
(3) 接种杂交瘤细胞后18天后，用注射器抽取腹水。将抽取的腹水经 3000rpm离心15min,弃去沉淀，收集上清，分装并置于-20。C水箱保存。
2. 腹水型单克隆抗体的纯化
2.1硫酸铵盐析法初提单克隆抗体
(1) 饱和碌u酸铵的配制于100ml蒸馏水中加90g硫酸铵，80。C溶解过滤， 降至室温后即有结晶析出，任其留在瓶中，用时取所需要量，用氨水调PH至 7.2;
(2) 在冰浴中将处理好的腹水用0.02M PH7.4的PBS稀释4倍。然后在4。C 搅拌下，逐滴加入8倍腹水量的饱和硫酸铵，然后在水箱放置2h以上，使其形 成沉淀物；
(3) 10000rpm， 4。C离心15min，弃上清，将沉淀物溶解于0.02M PH7.4的 PBS中，透析过夜，冻存。
2.2 rProteinA FF纯化分离抗体 2.2.1 rProteinAFF纯化分离腹水器材与试剂 rProteinA FF预装柱 GE公司
0.1MPH8.0PBS: Na2HP04'12H20 33g， KH2P04 0.76g, NaCl 8g,加蒸 馏水至1000ml。0.1MPH6.0柠檬酸緩冲液0.1M柠檬酸9.5ml 0.1M柠檬酸钠40.5ml。 0.1MPH5.0柠檬酸緩冲液0.1M柠檬酸20.5ml 0.1M柠檬酸钠29.5ml。 0.1MPH4.2柠檬酸緩沖液0.1M柠檬酸31.5ml 0.1M柠檬酸钠18.5ml。 0.1MPH3.0杼檬酸緩冲液0.1M柠檬酸46,5ml 0.1M柠檬酸钠3.5ml。 lMPH9.0Tris-HCl緩冲液12.1gTris， 5mllMHCl ,加蒸馏水至100ml。 0.2MPH2.2Gly陽HCl緩冲液50ml 0.2MGly, 44.0ml 0.2M HC1,加蒸馏 水至100ml。
2.2.2 rProteinA FF纯化分离腹水方法
(1) 用2 ~3倍体积的O . 2M PH2.2 Gly-HCl緩冲液洗rProteinA FF预装 柱，然后用0.1MPH8.0PBS平衡。
(2) 样品处理1体积预处理过的腹水加3体积量0.1MPH8.0PBS，20000g 4°C离心30min，取上清用1M PH9.0 Tris-HC1緩冲液调至PH8.0。
(3) 上样1柱床体积加样0.2体积样品，静置15min。
(4) 洗脱依次用0.1MPH6.0柠檬酸緩沖液、0.1MPH5.0柠檬酸緩冲液、
0. 1MPH4.2柠檬酸緩冲液、0.1MPH3.0柠檬酸緩沖液、0.2M PH2.2 Gly-HCl 緩冲液洗脱，收集样品。
3.纯化结果
收集的样品在280nm下检测吸光值，发现在PH4.2处出现一个主峰，说明 此腹水较纯，成分为IgG3。纯化后的抗体进行SDS-PAGE检测，发现在50KD 和25KD处各出现一条较强和较弱的条带，分别与抗体重、轻链实际大小相符， 说明纯化得到的蛋白是抗体蛋白。
实施例三、酶联免疫检测方法的建立(试剂盒组成及操作方法)
1. 4金测方法的原理基于竟争性酶联反应原理，相关的岩沙海葵毒素PTX包被于微孔板上，吸 附在孔内的抗原与被测试的样品中的抗原竟争性与PTX单克隆抗体相结合。当 样品抗原相结合的抗体被洗涂去除后，只剩下与《鼓孔内抗原相结合的抗体， 与经酶标记的二抗相结合，酶底物在酶作用下产生蓝色产物，加酸乡冬止反应， 在450nm波长测定其OD值。OD值的大小与样品中PTX的含量成反比。
2. ;险测方法的材料
2.1仪器酶标仪、水浴箱、酶标《敬孔板。
2.2主要试剂岩沙海葵毒素标准品、抗PTX-KLH的单克隆抗体、包被液 (PH7.4 0.01MPBS )、封闭液(5%BSA/0.01MPBS )、洗涤液(0.01MPBS/0.05% Tween20,PBS-T)、抗体稀释液(1%BSA/PBS-T) 、 TMB显色液、2MH2S04、 HRP-羊抗鼠IgG
3. 操作程序
(1) 包被用PH7.4 PBS緩冲液按需稀释PTX，以100jul/孔的PTX加入到96 孔酶标板中，置4。C冰箱过夜；
(2) 甩干板孔中液体，然后向孔中加入PBS-T洗涤緩冲液,每孔300nl，放 置摇床上轻轻晃动3min,弃去洗液，拍干，重复洗板4次；
(3) 用封闭液300pl/孔，37。C水浴封闭2h;
(4) 洗板4次，操作同(2),加样品提取液(或标准液)50nl/孔和已稀 释的单抗50iil/孔，37。C水浴放置lh;
(5) 洗板3次，操作同(2);
(6) 加入已稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG，每孔100ial， 37。C水浴;^文置lh, 洗板3次；
(7) 加入TMB显色液，每孔100pl， 37。C显色30min; (8 ) 2M H2SO4终止液终止显色反应,每孔50^il;
(9)酶标仪测定OD450值。
ii4.结果计算
岩沙海葵毒素的浓度按下面的公式计算
岩沙海葵毒素PTX浓度(ng/g) = " m
式中
c一PTX含量，单位为纳克(ng)，对应标准曲线按数值插入法求； Vl—样品提取液的体积，单位为毫升(mL); V2—滴加样液的体积，单位为毫升(mL); D一稀释倍数；
m—试样质量，单位为克(g) 实施例四、单克隆、多克隆抗体ELISA间接法测定岩沙海葵毒素的比较 1.材料与方法
1.1 PTX免疫抗原与检测抗原的制备
在PH7.5, 0.1M PBS: DMS0=19: 1的混合液中加入20pg PTX和12pg 的SPDP, 4。C水箱过夜。混合物加入等量CH2CL2萃取3次，取水层部分过 5mlSephadexG-25预装柱，用含0.1MNaCl的PH7.0, O.IMPBS洗脱，收集 最大吸收波长在263nm下的洗脱液。
在0.025M, PH9.0硼酸盐緩冲液中加入45叫KLH蛋白和50倍摩尔浓度 (2画iminothiolate: KLH)的2-亚氨基硫醇盐(2-iminothiolate )， 4。C冰箱过夜。 混合物过截留分子量为30K的超滤管，取上层管液体，在分光光度计下检测 KLH-SH最大吸收波长278nm下的洗脱液，并冻干。BSA-SH的制备跟KLH-SH 相同，收集在279nm下的洗脱液，并冻干。
免疫抗原将PTX-PDP、 BSA-SH和KLH-SH均溶解于PH7.5,0.1MPBS 中，体积分别为lml、 0.5ml、 0.5ml。然后BSA-SH和KLH-SH都分别加入到 等体积的PTX-PDP溶液中，4。过夜。然后再过5ml Sephadex G-25预装柱， 用含0.1MNaCl的PH7.0， O.IMPBS洗脱，收集分光光度计检测下收集最大吸收波长为267nm的PTX-PDP-KLH和最大吸收波长为273nm的
PTX-PDP-BSA。
1.2抗PTX多克隆抗体的制备
将PTX-PDP-KLH按常规方法免疫雌性6 8周龄BALB/C小鼠。经亲和层 析处理得到与KLH和BSA无交叉反应性的抗血清。 1.3抗PTX单克隆抗体的制备按常规方法制备。 1.4多克隆、单克隆抗体EUSA间接测定方法
(1) 用浓度梯度的PTX检测抗原加入到96孔酶标板中，每个浓度做2个 孔，置4'C冰箱过夜；
(2) 甩干板孔中液体，然后向孔中加入PBS-T洗涤緩冲液,每孔 放置摇床上轻轻晃动3min,弃去洗液，拍干，重复洗板4次；
(3 )用封闭液300ixl/孔,37 °C水浴封闭2h;
(4) 洗板4次，操作同(2)，在同样浓度的孔中分别加入单克隆抗体和 多克隆抗体，在37t水浴放置lh;
(5) 洗板3次,操作同(2);
(6) 加入已稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG，每孔100nl， 37。C水浴放 置lh,洗板3次；
(7 )加入TMB显色液，每孔100|li1， 37。C显色30min;
(8) 2MH2SCM冬止液终止显色反应，每孔50ixl;
(9) 酶标仪测定OD450值。 2结果与讨论
结果显示PTX浓度0.5mg/L时单抗法结果高于多抗法。出现这样的原 因主要是因为单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一 B淋巴细月包的群体 合成并分泌的，因此所有的抗体识别的是同一个抗原决定簇。
此外，由于单克隆抗体是针对抗原某一抗原决定簇分泌的，不同于多克隆抗体，是多个不同克隆的B细胞产生的，是多种抗体的混合物，因此能够
避免了因动物之间的同源性而导致的交叉反应，从而确保了结果的真实可靠。 另外，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞能够在体外"永久"地存活并传代， 只要不发生细胞林的基因突变，就可以不断的生产高特异性、高均一性的抗 体，而不同于多克隆抗体，每次必须要对小鼠进行免疫后才能得到。岩沙海 葵毒素样品价格昂贵，供货来源少，其免疫抗原的制备工序复杂，可重复性
不高。使得多克隆抗体的方法不适合用于岩沙海葵毒素的实际;险测中，而更
凸现单克隆抗体技术在PTX检验中的重要性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在 本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种产生抗岩沙海葵毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CCTCC No.C200922。
2、 一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体，所述单克 隆抗体特异性地抗岩沙海葵毒素。
3、 一种岩沙海葵毒素检测试剂盒，其包含权利要求2所述的单克隆抗体。
4、 权利要求1所述的杂交瘤细胞系在检测岩沙海葵毒素中的应用。
5、 权利要求2所述的单克隆抗体在检测岩沙海葵毒素中的应用。
6、 权利要求3所述的试剂盒在检测岩沙海葵毒素中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医学和免疫学领域，特别涉及一种特异性的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系，及含有该单克隆抗体的试剂盒和在检测PTX毒素检测中的用途。本发明涉及的杂交瘤细胞系，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC No.C200922。本发明建立了一种快速、准确、重复性好、特异性强、灵敏度高的检测的方法，用于鉴别高致中毒性海葵种群以及测定供人类使用的海产品里PTX的含量分布，可以有效地减轻或避免PTX中毒事件的发生。
文档编号C07K16/44GK101597596SQ20091003986
公开日2009年12月9日 申请日期2009年5月31日 优先权日2009年5月31日
发明者戴悦婵, 红 焦, 王家骥, 陈思强 申请人:焦 红;王家骥;陈思强;戴悦婵