专利名称：微波促进固相合成苦瓜降血糖mc-jj0104多肽类似物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及MC-JJ0104多肽类似物及其微波促进固相合成方法。
背景技术：
糖尿病是当今危害人类健康的重要疾病，目前全世界约有5% -7%的人受糖尿病 困扰，被认为是继心脑血管疾病、恶性肿瘤之后，导致人类伤残、死亡的第三大杀手。糖尿病分为I型和II型，I型糖尿病是一种自身免疫疾病，患者的存活需要注射 胰岛素。II型糖尿病占众多糖尿病患者总数的95%左右。II型糖尿病的原因是胰岛细胞 代谢发生障碍，胰岛素分泌不足，或者产生胰岛素抵抗，是以胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌 相对不足，或者以胰岛素分泌相对不足为主伴胰岛素抵抗导致的代谢性疾病。胰岛素分泌 不足，或者产生胰岛素抵抗都可造成血液中葡萄糖过量，当血糖含量超过肾阈时，葡萄糖就 转移到尿中排出，从而产生葡萄糖尿。目前临床应用的几种药物均不能够治愈糖尿病，主要是通过不同的作用机制，降 低患者的血糖水平。糖尿病患者必须终生服药，药物本身对人体的毒副作用同样威胁着糖 尿病人的健康。在中国，目前使用药物能够控制血糖达到正常标准的，还不到糖尿病患者总 数的20% (邹大进，2型糖尿病的祸首一胰岛素抵抗，大众医学，2002，(6) :17)，直接导 致了许多糖尿病患者的并发症发生早，进展快。显然，除了筛选更加安全有效的新型药物之 外，寻找其它的辅助治疗手段有效控制血糖水平，对于提高糖尿病人的健康水平同样是十 分重要的。苦瓜(Momordica charantia)是一种人类有长期安全食用历史的蔬菜。近二十年 来，人们在苦瓜的果实中发现了许多具有降血糖活性的成分，一些苦瓜果实的提取物，或者 直接用苦瓜果实干燥后制成的茶饮料，已经推荐给糖尿病人使用，某些苦瓜成分已经被申 请作为治疗糖尿病药物的专利。但是，从科技文献中介绍以及已有的专利或产品，主要是基 于对苦瓜诸多降血糖活性成分中对某个已知成分的认识，并没有意识到，苦瓜中具有降血 糖活性的成分已知的就有多种，并且化学性质各不相同，此外，苦瓜中还有某些具有降血糖 的活性成分是未知的。所以，已有的文献、专利或产品，其局限性也是明显的。能开发一套能全面利用苦瓜中理化性质不同的各类降血糖活性物，并且活性成分 含量高，所以对于充分而合理地利用并开发苦瓜资源，也是十分必要的。多肽可以通过基因工程的方法或者化学合成的方法得到。基因工程的方法在获取 长肽(氨基酸残基长度大于50)或蛋白质上比化学方法有优势，但是多肽的化学合成方法 尤其是在固相合成策略出现后，在制备氨基酸残基长度小于40的多肽或小肽上有基因工 程方法难以比拟的灵活性、多样性和高效性等。1963年Merrifield创立并开发了固相合成 多肽的方法。固相多肽合成一般有两种策略即Boc/Bzl正交保护固相合成策略和Fmoc/ tBu正交保护固相合成策略，Merrifield创立的固相合成法即为Boc/Bzl正交保护固相合 成策略。但是，Boc/Bzl正交保护固相合成策略中存在一些缺点，如副反应多、条件苛刻以及
4在延长肽链的过程中多肽链会从固相上丢失等。而随后出现的Fmoc/tBu正交保护固相合 成策略则反应条件温和的多。当近年来微波技术运用于多肽的固相合成中后，使多肽的合 成技术产生了一个飞跃。微波促进化学反应是由于其使极性分子在微波场中快速旋转，使 得一些反应速率较常规加热方法快10到1000倍，而且产率大大提高。1986年Gedye等人 首次报道了将微波应用于有机合成中，微波可以促进许多化学反应，如Diels-Alder反应， 皂化反应等，可以显著地加快反应速率并提高收率。在1992年，Hui-ming Yu等首先报道 了将微波应用于多肽固相合成领域中，他们完成了酰基载体蛋白片断十肽(acyl carrier protein, ACP 65 74)的合成。如何高效的合成长肽在世界上仍然是一个挑战，因为多肽随着肽链的增加其合 成难度成倍增加。用传统的固相方法合成长肽，其收率往往很低杂质较多纯化困难，从而从 实用的角度上说失去了合成的意义。其次合成周期长，在中间不出现困难肽序的情况下10 肽一般需要近一个星期时间才能完成合成周期，如果出现困难肽序，往往就无法合成得到 目标多肽。而使用微波促进固相合成多肽，可以克服困难肽序，合成传统固相方法无法得到 的多肽，而且合成时间大大缩短，且显著提高多肽粗品纯度及收率，使得产品的纯化大大方 便，只要经过一次制备型HPLC就能得到纯度较高的产品；此外还可以非常方便的用D型氨 基酸及非天然氨基酸等对多肽进行定点修饰，去寻找活性更高、生物半衰期更长的多肽，这 更是基因工程技术无法做到的。因此，我们在苦瓜降血糖(MC-JJ0104)多肽类似物的合成 中采用此种方法快速高效的合成得到MC-JJ0104系列类似物。
发明内容
本发明有两个目的第一个目的是从具降血糖活性的药食同源植物苦瓜中得到多 肽进行修饰得到降血糖活性更高的MC-JJ0104多肽类似物。本发明的第二个目的是提供了 MC-JJ0104多肽衍生物的固相制备方法，本发明采 用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到系列MC-JJ0104多肽类 似物。其特征在于采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，于固相载体上先合 成得到载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂，茚三酮法检测为阴性后脱去Fmoc保护基得到 载有第一个氨基酸残基的树脂；再进入下一个偶联循环，按照相应的肽序用不同的保护氨 基酸重复偶联和脱保护的步骤，依次延长所需的氨基酸序列，合成得到载有相应多肽的树 月旨，最后用裂解剂将多肽从树脂上切割下来得到多肽粗品。粗品经制备级高效液相色谱纯 化，冻干得多肽纯品。载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，其特征是通过在微波照射条件 下Fmoc保护氨基酸先经活化剂活化后再与固相载体偶合得到，反应中加入1-羟基_苯并 三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有机碱中和反应的酸性。载有第一个Fmoc保护 氨基酸的树脂所使用的固相载体是Rink树脂、Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。活化剂 是二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)、N, N"-羰基二咪唑(⑶I)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)或使用的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(H0SU)、1_羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羟基-1，2，3-苯并三嗪_4 (3H)-酮(HOOBT)。有机碱 为三乙胺(TEA)、N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)；微波促进条件是微波频率 2450MHz，反应温度20 100°C，反应时间为5 15min。Fmoc保护基的脱除是通过使用含有0. Imol化―1的1_羟基-苯并三氮唑(HOBT)的 六氢吡啶溶液在微波促进下反应，选用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亚砜(DMSO)、或N-甲基 吡咯烷酮(NMP)为反应溶剂。微波促进条件是微波频率2450MHz，反应温度20 100°C， 反应时间为1 IOmin。本发明的优点在于
1.提出的一种MC-JJ0104多肽类似物可以在保留降糖活性的基础上，提高 MC-JJ0104的稳定性，延长作用时间。2.微波促进固相合成MC-JJ0104多肽类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固 相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而 微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟 到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩 短了合成周期。3.微波促进固相合成MC-JJ0104多肽类似物合成得到的粗品的纯度大于60%，较 常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作，只需要经过一次制备液相纯化，冻 干即可得到目标纯品。4.微波促进固相方法合成MC-JJ0104多肽类似物，其成本低，由于偶合效率较高， 所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。5.微波促进固相合成MC-JJ0104多肽类似物方法易于实现自动化、大规模化，这 使其更适合工业化生产。因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的MC-JJ0104多肽类似物，收率 高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的MC-JJ0104 多肽类似物，比天然MC-JJ0104更加稳定，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。
具体实施例方式在本说明书全文中采用以下缩写Et3N 三乙胺；NMM =N-甲基吗啉；DIEA :N，N，- 二异丙基乙胺；DMF 二甲基甲酰胺； DM SO 二甲亚砜；DCM 二氯甲烷；Fmoc :N_9芴甲氧羰基；DIC =N, N’ -二异丙基碳二亚胺； CDI :N，N，-羰基二咪唑；DMAP :4_ 二甲氨基吡啶；HOSU :N_羟基琥珀酰亚胺；EDC. HCl 1-乙 基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU 2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N，，N，-四 甲基脲六氟磷酸酯；HBTU 苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU :6_氯苯 并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT 羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT 羟 基-苯并三氮唑；PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC 高效液相色 谱；ESI-MS 电喷雾质谱；Gly 甘氨酸；Ser 丝氨酸；Ala 丙氨酸；Thr 苏氨酸；Val 缬氨 酸；Ile 异亮氨酸；Leu 亮氨酸；Tyr 酪氨酸；Phe 苯丙氨酸；His 组氨酸；Pro 脯氨酸； Asp 天门冬氨酸；Met 蛋氨酸；Glu 谷氨酸；Trp 色氨酸；Lys 赖氨酸；Arg 精氨酸。Asn 天冬酰胺；Gln 谷氨酰胺。
本发明是通过下列实施列来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。实施例1Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser (SEQ. ID NO 2)的微波促进固相合 成(1)树脂的溶胀称取Fmoc-Ala Resin 50mg (取代量 0. 4mmol/g)，经 7mL DCM 溶胀 30min，抽滤去 DCM,再用10mL NMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM, NMP 7mL冲洗干净。(2)微波促进Fmoc保护基的脱除将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0. 1M H0BT的25%哌啶/NMP (V/V)溶 液，在微波反应器中反应lmin，微波功率为15W，反应温度控制在50°C以内，使用空气压缩 机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0. 1M H0BT的25%哌啶/NMP(V/V)溶 液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50°C，使用空气压缩机压 缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的 树脂。(3)微波促进 Fmoc-Ala-rink amide-MBHA Resin 的合成^ Fmoc-Ala-rink (0. 04mmol) , HBTU (0. 04mmo 1) , H0BT (0. 04mmol)禾口 DIPEA(0. 08mmol)溶于lOmL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应 7min，微波功率为25W，反应温度控制在50°C，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后 滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。(4)偶合效率的检测用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下 一个偶合循环。茚三酮法取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、 KCN吡啶溶液(2ml 0. 001MKCN稀释于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C加 热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。溴酚兰法取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴的 溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。(5)肽链的延长按照Ala3-MC-JJ0104- (1 11) _NH2的序列，重复上述脱保护和偶合的步 骤依次连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间5 20min不等。得到连有 Ala3-MC-JJ0104-(l 11)_NH2 的树脂。(6)树脂上多肽的裂解将上述得到的连有Ala3-MC-JJ0104-(l 11)_NH2的树脂放入反应瓶中，各加入 裂解剂 Reagent K (TFA/苯甲硫醚 / 水 / 苯酚/EDT，82. 5 5 5 5 2. 5, V/V) 10mL, 先在0°C下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次， 合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。 最终得到 Ala3-MC-JJ0104-(l 11)_NH2 粗品 63. 2mg，收率为 94. 3%0(7) Ala3-MC_JJ0104- (1 11) -NH2-NH2 粗品的纯化
将上面得到的Ala3-MC-JJ0104_(1 11)_NH2粗品，溶于少量的水中，用岛津制备型反相HPLC纯化粗品。纯化中采用C18反相制备柱(340mmX28mm，5ym)；流动相A: 0. 1 % TFA/水(V/V)，流动相B 0. 1% TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度流动相B 13 % 15 %， 30min ；流速为6mL/min ；检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品，最终得到纯品29. 7mg。 理论相对分子质量 907. OESI-MSm/z found [M+3H] 3+303. 4，[M+4H]4+227. 7，[M+5H] 5+182. 2 ； calu[M+3H]3+303. 3，[M+4H]4+227. 7，[M+5H] 5+182. 4根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2 38的多肽，通过 电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。实施例2Gly-Pro-(D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser(SEQ. ID NO 3)；理论相 对分子质量 907. OESI-MSm/z :found[M+3H]3+303. 5，[Μ+4Η]4+227· 6，[Μ+5Η] 5+182· 2 ； calu[M+3H]3+303. 3，[M+4H]4+227. 7，[M+5H] 5+182. 4实施例3Gly-Pro-Ala-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser(SEQ. ID NO 4)；理论相 对分子质量 907. OESI-MSm/z :found[M+3H] 3+303· 3，[Μ+4Η]4+227· 5，[Μ+5Η] 5+182· 4 ； calu[M+3H]3+303. 3，[M+4H]4+227. 7，[M+5H] 5+182. 4实施例4Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-(D-Ala)-Ala-Ser(SEQ. ID NO 5)；理论相 对分子质量 907. OESI-MSm/z :found[M+3H] 3+303· 4，[Μ+4Η]4+227· 7，[Μ+5Η] 5+182· 4 ； calu[M+3H]3+303. 3，[M+4H]4+227. 7，[M+5H] 5+182. 4实施例5Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-(D-Ala)-Ser (SEQ. ID NO 6)；理论 相对分子质量 907. OESI-MSm/z found [Μ+3ΗΓ+303. 3 [Μ+4Η]4+227· 7，[Μ+5Η] 5+182· 5 ； calu[M+3H]3+303. 3，[M+4H]4+227. 7，[M+5H] 5+182. 4实施例6Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Gly-Ser (SEQ. ID NO 7)；理论相对分子质量 893. OESI-MSm/z found[M+3H] 3+298. 7 [M+4H] 4+224. 2，[M+5H] 5+179. 6 ；calu [M+3H] 3+298. 7， [M+4H]4+224. 2，[M+5H]5+179. 6实施例7Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Cys-Ser (SEQ. ID NO 8)；理论相对分子质量 939. OESI-MSm/z found[M+3H] 3+314. 1 [M+4H] 4+235. 8，[M+5H] 5+188. 8 ；calu [M+3H] 3+314. 0， [M+4H]4+235. 8，[M+5H]5+188. 8实施例8Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Arg-Ser (SEQ. ID NO 9)；理论相对分子质量 992. lESI-MSm/z found[M+3H] 3+331. 7 [M+4H] 4+249. 1，[M+5H] 5+199. 5 ；calu [M+3H] 3+331· 7， [Μ+4Η]4+249. 0，[Μ+5Η]5+199. 4实施例9Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Met-Ser(SEQ. ID NO 10)；理论相 对分子质量 967. lESI-MSm/z found [M+3H] 3+323. 5 [M+4H] 4+249. 1，[M+5H]5+199. 5 ；calu[M+3H]3+331. 7，[Μ+4Η]4+249· 0，[M+5H] 5+199. 4实施例10Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ser-Ser (SEQ.ID NO 11)；理论相对分子质量 923. OESI-MSm/z :found[M+3H]3+308. 7[Μ+4Η]4+231· 8，[Μ+5Η]5+185· 5 ； calu[M+3H]3+308. 7，[M+4H]4+231. 7，[M+5H] 5+185. 6实施例11Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser (SEQ.ID NO 12)；理论相 对分子质量 964. lESI-MSm/z :found[M+3H]3+322. 4[M+4H]4+242. 1，[M+5H]5+193. 7 ； calu[M+3H]3+322. 4，[M+4H]4+242. 0，[M+5H] 5+193. 8实施例12Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 13)；理论相 对分子质量 1021. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+341. 4[M+4H]4+256. 1，[M+5H]5+205. 2 ； calu[M+3H]3+341. 4，[M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2实施例13Gly-Pro-(D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID N0:14)；理论 相对分子质量 950. . lESI-MSm/z :found[M+3H]3+317. 5[M+4H]4+238. 5，[M+5H]5+191. 2 ； calu[M+3H]3+317. 7，[M+4H]4+238. 5，[M+5H] 5+191. O实施例14Gly-Pro-Ala-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID N0:15)；理论 相对分子质量 1021. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+341. 5[M+4H]4+256. 5，[M+5H]5+205. 2 ； calu[M+3H]3+341. 4，[M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2实施例I5Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Gly-Lys-Ser (SEQ.ID NO 16)；理论相 对分子质量 950. OESI-MSm/z :found[M+3H]3+317. 5[Μ+4Η]4+238· 5，[Μ+5Η]5+191· O ； calu[M+3H]3+317. 7，[Μ+4Η]4+238· 5，[M+5H] 5+191. O实施例16Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Tyr-Lys-Ser (SEQ.ID NO 17)；理论相 对分子质量 1021. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+341. 5[Μ+4Η]4+256· 5，[Μ+5Η]5+205· O ； calu[M+3H]3+341. 4，[M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2实施例17Gly-Pro-Gly-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 18)；理论相 对分子质量 1007. lESI-MSm/z found [M+3H] 3+336· 5 [M+4H] 4+252· 8，[Μ+5Η]5+202· 4 ； calu[M+3H]3+336. 7，[M+4H]4+252. 8，[M+5H] 5+202. 4实施例18Gly-Pro-Ser-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 19)；理论相对 分子质量 1037. 2ESI-MSm/z :foun d[M+3H]3+346. 7[M+4H]4+260. 3，[M+5H]5+208. 3 ； calu[M+3H]3+346. 7，[M+4H]4+260. 3，[M+5H] 5+208. 4实施例19Gly-Pro-Ala-Arg-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 20)；理论相对分子质量 1106. 3ESI-MSm/z :found[M+3H]3+369. 8[Μ+4Η]4+277· 7，[Μ+5Η]5+222· 3 ； calu[M+3H]3+369. 8，[M+4H]4+277. 6，[M+5H] 5+222. 3实施例2OGly-Pro-Ala-Cys-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 21)；理论相 对分子质量 1053. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+352. 1 [Μ+4Η]4+264· 3，[Μ+5Η]5+211· 7 ； calu [Μ+3Η] 3+352· 1，[Μ+4Η]4+264· 3，[Μ+5Η]5+211. 6实施例21Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 22)；理论相 对分子质量 1007. lESI-MSm/z :found[M+3H]3+336. 6[M+4H]4+252. 9，[M+5H]5+202. 4 ； calu [M+3H] 3+336. 7，[M+4H]4+252. 8，[M+5H] 5+202. 4
实施例22Gly-Pro-Ala-His-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 23)；理论相 对分子质量 1087. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+363. 4[M+4H]4+272. 9，[M+5H]5+218. 4 ； calu [M+3H] 3+363. 4，[Μ+4Η]4+272· 8，[Μ+5Η] 5+218. 4实施例23Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 24)；理论相 对分子质量 1113. 3ESI-MSm/z :found[M+3H]3+372. 2[Μ+4Η]4+279· 4，[Μ+5Η]5+223· 5 ； calu [Μ+3Η] 3+372. 1，[Μ+4Η]4+279. 3，[Μ+5Η] 5+223. 7实施例24Gly-Pro-Ala-Ser-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 25)；理论相对 分子质 fi 1037. 2ESI-MSm/z :foun d[M+3H]3+346. 7[M+4H]4+260. 4, [M+5H] 5+208. 5 ； calu [M+3H] 3+346. 7，[M+4H]4+260. 3，[M+5H] 5+208. 4实施例25Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Gly-Ser (SEQ.ID NO 26)；理论相 对分子质量 985. OESI-MSm/z :found[M+3H]3+329. 2[M+4H]4+247. 4，[M+5H]5+198. O ； calu [M+3H] 3+329. 3，[M+4H]4+247. 3，[M+5H] 5+198. O实施例26Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Cys-Ser (SEQ.ID NO 27)；理论相 对分子质量 1031. lESI-MSm/z :found[M+3H]3+344· 7 [M+4H]4+258· 9，[Μ+5Η]5+207· 1 ； calu [Μ+3Η] 3+344. 7，[M+4H]4+258. 8，[M+5H] 5+207. 2实施例27Gly-Pro-Ala-Ty-Tyr-Ile-Ser-Ala-Met-Ser (SEQ. ID NO 28)；理论相对分子质量 1059. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+354. 2[M+4H]4+265. 9，[M+5H] 5+212. 7 ； calu [M+3H] 3+354. 1， [M+4H]4+265. 8，[M+5H]5+212. 8实施例28Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ser-Ser (SEQ.ID NO 29)；理论相 对分子质量 1015. lESI-MSm/z :found[M+3H]3+339. 2 [Μ+4Η]4+254· 9，[Μ+5Η]5+204· 1 ； calu [Μ+3Η] 3+339. 4，[Μ+4Η]4+254. 8，[Μ+5Η] 5+204. O实施例29CN 101830969 A
说明 书8/10页Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser (SEQ.ID NO 30)；理论相 对分子质量 1056. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+353. 2 [M+4H]4+265. 0，[M+5H]5+212. 1 ； calu [M+3H] 3+353. 1，[M+4H]4+265. 0，[M+5H] 5+212. 2实施例30Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO 31)；理论相 对分子质量 1113. 3ESI-MSm/z :found[M+3H]3+372. 2[M+4H]4+279. 4，[M+5H]5+223. 6 ； calu [M+3H] 3+372. 1，[M+4H]4+279. 3，[M+5H] 5+223. 7实施例31Gly-Pro-Gly-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 32)；理论 相对分子质量 1007. lESI-MSm/z found [M+3H] 3+336. 7 [M+4H]4+252. 9, [M+5H] 5+202. 6 ； calu [M+3H] 3+336. 7，[M+4H]4+252. 8，[M+5H] 5+202. 4实施例32Gly-Pro-Ser-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 33)；理论 相对分子质量 1037. 2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+346. 7 [M+4H]4+260. 1，[M+5H] 5+208. 6 ； calu [M+3H] 3+346. 7，[M+4H]4+260. 3，[M+5H] 5+208. 4实施例33Gly-Pro-(D-Ala)-Arg-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 34)；理论 相对分子质量 1106. 3ESI-MSm/z :found[M+3H]3+369. 7[M+4H]4+277, 5[M+5H]5+222. 2 ； calu [M+3H] 3+369. 8，[M+4H]4+277. 6，[M+5H] 5+208. 4实施例34Gly-Pro-(D-Ala)-Cys-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 35)；理论 相对分子质量 1053. 2ESI-MSm/z :found[M+3H] 3+352. 2[M+4H]4+264, 5[M+5H]S+211. 5 ； calu [M+3H] 3+352. 1，[M+4H]4+264. 3，[M+5H]5+211. 6实施例35Gly-Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 36)；理论 相对分子质量 1007. lESI-MSm/z found [M+3H]3+336. 6 [M+4H]4+252. 8 [M+5H]5+202. 5 ； calu [M+3H] 3+336. 7，[M+4H]4+252. 8，[M+5H] 5+202. 4实施例36Gly-Pro-(D-Ala)-His-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 37)；理论 相对分子质 fi 1087. 2ESI-MSm/z :found[M+3H] 3+363. 4 [M+4H]4+272. 8 [M+5H] 5+218. 5 ； calu [M+3H] 3+363. 4，[M+4H]4+272. 8，[M+5H] 5+218. 4实施例37Gly-Pro-(D-Ala)-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 38)；理论 相对分子质量 1087. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+363. 5[M+4H]4+272. 7[M+5H]5+218. 5 ； calu [M+3H] 3+363. 4，[M+4H]4+272. 8，[M+5H] 5+218. 4实施例38Gly-Pro-(D-Ala)-Ser-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 39)；理论 相对分子质 fi 1037. 2ESI-MSm/z :found[M+3H] 3+346. 5 [M+4H]4+260. 4 [M+5H] 5+208. 5 ； calu [M+3H] 3+346. 7，[M+4H]4+260. 3，[M+5H] 5+208. 4
11
实施例39MC-JJO104及其类似物体内降糖活性实验取10周龄雄性昆明小鼠(体重18 22g)，随机分组，每组6只。尾静脉注射四氧嘧啶给药建模，给药剂量为60mg/kg，72小时后，小鼠禁食5 6小时测血糖挑选血糖值 范围在13 23的小鼠随机分组，每组6只。成模后的小鼠lmg/kg连续给药IOd腹腔注射 MC-JJO104多肽及其类似物。在0，30，60，90，120用血糖仪测定血糖值。如表1所示，MC-JJ0104多肽及其类似物的降血糖活性强于二甲双胍。表1MC-JJ0104及其类似物降血糖的效应β 寸，T—I+IT—ILOIcd__9Z d+ls.卜__06 ·0+ι8ε 卜__Ζ9 .o+lg06__85d+ιε 寸，卜__gfflti医
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31 2 -0权利要求
一种具有降血糖活性的含有式I(SEQ.ID NO1)结构的苦瓜MC-JJ0104多肽类似物，得到的苦瓜MC-JJ0104多肽类似物；其特征在于其结构具有以下形式Gly-Pro-Xaa1-Xaa2-Tyr-Ile-Ser-Xaa3-Xaa4-Ser(SEQ.ID NO1)Xaa1Ala，D-Ala，Gly或SerXaa2Ala，D-Ala，Arg，Cys，Gly，His，Lys，Met，Tyr或SerXaa3Ala，D-Ala，Gly，Lys，Tyr或SerXaa4Ala，D-Ala，Gly，Cys，Arg，Lys，Met或Ser
2.根据权利要求1所述的多肽，具有如下序列 Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser Gly-Pro- (D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser Gly-Pro-Ala-(D_Ala)-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Serle-Ser-(D_Ala)-Ala-Ser le-Ser-Ala-(D_Ala)-Ser le—Ser—Ala—Gly—Ser le-Ser—Ala—Cys—Ser le—Ser—Ala—Arg—Ser le-Ser—Ala—Met—Ser le-Ser—Ala—Ser—Ser le—Ser—Ala—Lys—Ser le-Ser-Lys-Lys-SerGly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-(D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser Gly-Pro-Ala-(D_Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-SerGly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ala-Tyr-Gly-Pro-Gly-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ser-Ala-Tyr-Gly-Pro-Ala-Arg-Tyr-Gly-Pro-Ala-Cys-Tyr-Gly-Pro-Ala-Gly-Tyr-Gly-Pro-Ala-His-Tyr-Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Ala-Ser-Tyr-Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Ala-Tyr-Tyr-le-Ser-Gly-Lys-Ser le-Ser-Tyr-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser le—Ser—Ala—Gly—Ser le-Ser—Ala—Cys—Ser le-Ser—Ala—Met—Ser le-Ser—Ala—Ser—Ser le—Ser—Ala—Lys—Ser le-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ, (SEQ,ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID ID (SEQ.ID (SEQ.ID (SEQ.ID (SEQ.ID (SEQ.ID (SEQ.ID (SEQ.ID (SEQ.ID (SEQ.IDNO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO2 3 4 5 6 7 8 9 10) 11) 12)13)14)15)16)17)18)19)20) 21) 22)NO NO NO NO NO NO NO NO NO23) 24) 25) 26) 27) 28) 29) 30) 31)Gly-Pro-Gly-(D_Ala)-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO32)Gly-Pro-Ser-(D-Ala)-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO33)Gly-Pro-(D-Ala)-Arg-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO34)Gly-Pro-(D-Ala)-Cys-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO35)Gly-Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO36)Gly-Pro-(D-Ala)-His-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO37)Gly-Pro-(D-Ala)-Tyr-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO38)Gly-Pro-(D-Ala)-Ser-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO39)
3.—种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中所述的MC-JJ0104多肽类似物或 者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。
4.权利要求1中所述的MC-JJ0104多肽类似物或者其药学上可接受的盐和药学上可接 受的载体或稀释剂在制备用于治疗糖尿病的药物中的运用。
5.权利要求1中所述的MC-JJ0104多肽类似物的制备方法，其特征在于采用微波促 进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，于固相载体上先合成得到载有第一个Fmoc保护氨基 酸的树脂，茚三酮法检测为阴性后脱去Fmoc保护基得到载有第一个氨基酸残基的树脂；再 进入下一个偶联循环，按照相应的肽序用不同的保护氨基酸重复偶联和脱保护的步骤，依 次延长所需的氨基酸序列，合成得到载有相应多肽的树脂，最后用裂解剂将多肽从树脂上 切割下来得到多肽粗品。粗品经制备级高效液相色谱纯化，冻干得多肽纯品。
6.根据权利要求5中所述微波促进固相合成MC-JJ0104多肽类似物方法，其特征是载 有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，是通过在微波照射条件下Fmoc保护氨基酸 先经活化剂活化后再与固相载体偶合得到，反应中加入1-羟基-苯并三氮唑(H0BT)或其 衍生物抑制消旋，并使用有机碱中和反应的酸性。
7.根据权利要求6所述的载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，其特征在 于使用的固相载体是Rink树脂、Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂；使用的活化剂是二环 己基碳二亚胺(DCC)、N，N' - 二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N"-羰基二咪唑(⑶I)、1_乙 基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)或6-氯苯并三氮唑_1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)；使用的1_羟基-苯并 三氮唑(H0BT)衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(H0SU)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(H0AT)或 3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)_酮(H00BT)；使用的有机碱为三乙胺(TEA)、N-甲基吗 啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)；微波促进条件是磁控管频率2450MHz，反应温度20 100°C，反应时间为5 15min。
8.根据权利要求5中所述微波促进固相合成MC-JJ0104多肽类似物合成方法，其特征 是Fmoc保护基的脱除是通过使用含有0. lmol. L—1的1-羟基-苯并三氮唑(H0BT)的六氢 吡啶溶液在微波促进下反应，选用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亚砜(DM SO)、或N-甲基吡咯 烷酮(NMP)为反应溶剂；微波促进条件是磁控管频率2450MHz，反应温度20 100°C，反 应时间为1 lOmin。
全文摘要
本发明涉及新型高效降血糖苦瓜MC-JJ0104多肽类似物及其微波促进固相合成方法。通过对天然苦瓜多肽的3，4，8或9位点进行改造得到具有更长药理作用时间的MC-JJ0104多肽类似物；其化学合成是通过微波促进固相合成方法而得以高效快速实现，粗品经制备级高效液相纯化，最后冻干得到MC-JJ0104多肽类似物。
文档编号C07K7/06GK101830969SQ20101017810
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者华杰, 张惠斌, 朱孝云, 杜阔, 王敬杰, 金晶, 钱海, 陈巍, 黄文龙 申请人:中国药科大学