专利名称：高速逆流色谱法制备异戊酰螺旋霉素Ⅲ的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种异戊酰螺旋霉素III的制备方法，具体地说，涉及一种采用高 速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography, HSCCC)由必特螺旋霉素 (Bitespiramycin)中分离制备异戊酰螺旋霉素III的方法。
背景技术：
必特螺旋霉素(Bitespiramycin)是由转基因的螺旋霉素(Spiramycin，SPM)产生 菌发酵得到的全新型抗生素，是一种主要组分为异戊酰螺旋霉素I、II、III的多组分抗生 素，其结构见如式1所示
福洛氨糖
内酯环
CH3
\
CH,
碳霉糖
CH/
H3CCv,Z、0^^
O‘
OCOCH2CH (CH3) 2
1式1中，R = H(异戊酰螺旋霉素I)，R = COCH3(异戊酰螺旋霉素II)，R = COCH2CH3(异戊酰螺旋霉素III)。与螺旋霉素(SPM)相比，异戊酰螺旋霉素在4"位具有异戊酰基侧链，且其理化性 质与SPM也不同，具有了更好的体内抗菌活性。作为一类新药，获得必特螺旋霉素的主要组 分和活性组分，即异戊酰螺旋霉素I、II、III的高纯度样品对于药理研究和质量控制具有
重要意义。由于必特螺旋霉素的组分复杂，且分子结构差别很小，用传统分离方法很难得到 异戊酰螺旋霉素III的高纯度样品。高速逆流色谱是一种基于液-液分配原理的新型分 离技术，可以提供相当于上千理论塔板数的分离效果，为必特螺旋霉素主要组分的分离提 供了手段。近年来，有关采用高速逆流色谱(HSCCC)技术分离抗生素组分在国内外有一些研 究，其中，大环内酯类抗生素的分离主要集中于红霉素组分、螺旋霉素组分、他克莫斯和子
3囊霉素等的分离研究。例如，Hisao Oka等利用高速逆流色谱分离螺旋霉素组分，所用体 系为正己烷乙酸乙酯甲醇水(体积比)=3:6:5: 5，得到的螺旋霉素I、II、 III 纯度分别 98. 2%、92· 3%、97. 4% (Hisao Oka, Ken-ichi Harada, Masanao Suzuki, et al. Separation of spiramycin componentsusing high-speed counter-current chromatography Journal of Chromatography A. 2000，903 :93-98)。其中，特定的溶齐[J系 统及其溶剂配比是获得良好分离效果的关键之一。目前尚未见采用高速逆流色谱分离制备高纯度必特螺旋霉素的主要组分的研究 报道，国内外也尚未有高纯度的异戊酰螺旋霉素III的样品提供。酰化螺旋霉素虽然与螺 旋霉素具有相似的母核，但不同的侧链基团使它们具有不同的理化性质，尤其是异戊酰螺 旋霉素的C5侧链基团对其影响很大，可以作为分离螺旋霉素和异戊酰螺旋霉素的依据。但 同时，螺旋霉素的分离方法也不能直接适用于异戊酰螺旋霉素中不同组分的分离。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种采用高速逆流色谱(HSCCC)法从必特螺旋霉素原料 中分离得到异戊酰螺旋霉素III的方法，从而获得异戊酰螺旋霉素III的高纯品样品。本发明所述的方法，其包括如下步骤(1)通过包括过滤、萃取、反萃取、洗涤和结晶等操作，从必特螺旋霉素发酵液中提 取纯化必特螺旋霉素，经高效液相色谱分析，获得的必特螺旋霉素原料中异戊酰螺旋霉素 III含量彡25% ；(2)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按比例配制构成固定相和流动相的溶剂体系；(3)向高速逆流色谱仪内泵入固定相使其充满整个螺旋管；(4)开启主机，使螺旋管高速运转；(5)以一定流速Qml/min 3ml/min)向高速逆流色谱仪内泵入流动相；(6)平衡建立后，将必特螺旋霉素由进样阀注入体系中，根据检测器谱图收集流出 液，获得异戊酰螺旋霉素III ；其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按的体积比为1.0 (1.0 2.3) (1.2 2. 7) (0. 8 2. 0)。整个分离过程在常压(Iatm)及20°C 25°C条件下进行.根据必特螺旋霉素的结构和理化性质，结合分配系数法筛选出满足要求 的溶剂体系，再用分析型高速逆流色谱进行调整，选择可用于高速逆流色谱法分 离异戊酰螺旋霉素III的溶剂体系主要有正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比 为 1.00 1. 50 2.00 1. 25,1.0 1.0 1.6 1.0,1.0 1.0 1.2 0.8、 1.0 2.3 2.7 1.7等。这些体系满足必特螺旋霉素的pH稳定条件，但用于分离时，检 测到异戊酰螺旋霉素III的峰形不够对称导致收集困难。为使峰形对称，提高收集效率，调 节流动相PH为7. 0-7. 5。用半制备型高速逆流色谱分离制备异戊酰螺旋霉素III，纯度在 97%以上。同时获得异戊酰螺旋霉素I的纯度在40%以上，II的纯度在70%以上，可进一 步进行分离纯化。本发明的优点在于1，本方法在所述的溶剂体系下采用高速逆流色谱分离的方法，从组分复杂的必特 螺旋霉素原料中分离制备异戊酰螺旋霉素III，得到了纯度较高的异戊酰螺旋霉素III的样品。2，采用高速逆流色谱分离后，异戊酰螺旋霉素I和II得到富集，可根据需要进一 步分别制备异戊酰螺旋霉素I和II。3，高速逆流色谱的固定相是液相，避免了因吸附作用引起的样品损失、样品组分 的化学变性。4，本方法采用了高速逆流色谱分离方法，分离高效、快速、分离量大、样品无损失、 回收率高。
图1为由实施例1所得的高速逆流色谱分离图，其中1-异戊酰螺旋霉素I，2-异戊酰螺旋霉素II，3-异戊酰螺旋霉素III。图2为由实施例1所得的异戊酰螺旋霉素III (纯度为97. 8% )及其原料(必特 螺旋霉素)的高效液相色谱(HPLC)图谱；其中A-原料，B-异戊酰螺旋霉素III。图3为由实施例2所得的高速逆流色谱分离图，其中1-异戊酰螺旋霉素I，2-异戊酰螺旋霉素II，3-异戊酰螺旋霉素III。图4为由实施例2所得的异戊酰螺旋霉素III (纯度为98. )及其原料(必特 螺旋霉素)的HPLC图谱；其中A-原料，B-异戊酰螺旋霉素III。具体实施方法下面通过实施例对本发明作进一步说明，但所举的实施例并不限制本发明的保护 范围。所用300-B半制备型高速逆流色谱仪由上海同田生化技术有限公司提供；所用必 特螺旋霉素(发酵液)由上海同联药业有限公司提供。在下列实施例中，除特别说明外，所有操作在常压和20°C 25°C条件下进行，且 所指含量均为高效液相色谱分析所得。实施例1向必特螺旋霉素发酵液的滤液中加入乙酸丁酯进行萃取，萃取液经由磷酸盐缓 冲液洗涤，加碱液结晶、过滤、干燥，获得的必特螺旋霉素原料中异戊酰螺旋霉素I、II和 III的含量分别为21.8%、29. 3%、30. 0%。按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为 1 1.5 2 1.25配制溶剂体系，置于分液漏斗中，分液后，以上相作为固定相、下相作 为流动相，分别置于超声波清洗器中超声脱气。然后，用氨水调节流动相PH值为7. 2。以 30ml/min的流速将固定相泵入高速逆流色谱仪中直至液体充满整个柱体。设定螺旋管转速 为900rpm，开启主机，以2ml/min流速向高速逆流色谱仪中泵入流动相。待流出液由固定相 变为流动相，即建立了动态平衡后，将150mg原料溶于20ml流动相，由进样阀进样，根据紫 外检测器谱图收集流出液，检测谱图见图1。将收集得到1、2、3峰的洗脱液浓缩、在50°C下 真空干燥。经高效液相色谱分析，3峰对应的物质为异戊酰螺旋霉素III，其纯度为97. 8%, 收率为57.8%。发酵液中提取的必特螺旋霉素和高速逆流色谱分离获得的异戊酰螺旋霉 素III产品HPLC分析图见图2。谱图中1、2峰对应的物质分别为异戊酰螺旋霉素I和II，其纯度分别为69. 4%,80. 8%。用高分辨率电子轰击质谱对获得的异戊酰螺旋霉素III产 品进行结构鉴定分析，碎片离子14、m/z881.M验证了该物质的异戊酰基基团(4’ 位)和丙酰基基团(R基团)。实施例2向必特螺旋霉素发酵液的滤液中加入乙酸丁酯进行萃取，萃取液经由磷酸盐缓 冲液洗涤，加碱液结晶、过滤、干燥，获得的必特螺旋霉素原料中异戊酰螺旋霉素I、II和 III的含量分别为12.7^^31.0^^31.8 ^按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为 1 1 1.5 1的比例配制溶剂体系，置于分液漏斗中，分液后，以上相作为固定相、下相 作为流动相，分别置于超声波清洗器中超声脱气。然后，用氨水调节流动相PH为7.0。以 30ml/min的流速将固定相泵入高速逆流色谱仪中直至液体充满整个柱体。设定螺旋管转速 为900rpm，开启主机，以2ml/min流速向高速逆流色谱仪中泵入流动相。待流出液由固定相 变为流动相，即建立了动态平衡后，将IOOmg原料溶于20ml流动相，由进样阀进样，根据检 测器谱图收集流出液，检测谱图见图3。将收集得到1、2、3峰的洗脱液浓缩、在50°C下真空 干燥。经高效液相色谱分析，3峰对应的物质为异戊酰螺旋霉素III，其纯度为98. 1%，收率 为40. 6%。发酵液中提取的必特螺旋霉素和高速逆流色谱分离获得的异戊酰螺旋霉素III 产品HPLC分析图见图4。谱图中1、2峰对应的物质分别为异戊酰螺旋霉素I和II，其纯 度分别为50. 9%,70. 6%。用高分辨率电子轰击质谱对获得的异戊酰螺旋霉素III产品进 行结构鉴定分析，碎片离子14、m/z881.M验证了该物质的异戊酰基基团(4’位) 和丙酰基基团(R基团)。
权利要求
1.一种异戊酰螺旋霉素III的制备方法，其特征在于，所说的制备方法是采用高速逆 流色谱法从必特螺旋霉素原料中分离得到异戊酰螺旋霉素III，包括如下步骤(1)通过包括过滤、萃取、反萃取、洗涤和结晶等操作，从必特螺旋霉素发酵液中提取纯 化必特螺旋霉素，获得异戊酰螺旋霉素III含量大于或等于25%的必特螺旋霉素；(2)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按比例配制构成固定相和流动相的溶剂体系；(3)向高速逆流色谱仪内泵入固定相使其充满整个螺旋管；(4)开启主机，使螺旋管高速运转；(5)以2ml/min 3ml/min向高速逆流色谱仪内泵入流动相；(6)平衡建立后，将由步骤(1)所得的必特螺旋霉素由进样阀注入体系中，根据检测器 谱图收集流出液，获得异戊酰螺旋霉素III ；其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按的体积比为1.0 (1.0 2. 3) (1.2 2. 7) (0. 8 2. 0)。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体 积比为 1. 00 1. 50 2. 00 1. 25。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体 积比为 1.0 1.0 1.5 1.0。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于其中所用流动相的pH值为 7. 0-7. 5。
全文摘要
本发明涉及一种异戊酰螺旋霉素III的制备方法，其主要步骤是采用高速逆流色谱由必特螺旋霉素原料中分离制备异戊酰螺旋霉素III。配制固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按的体积比为1.0∶(1.0～2.3)∶(1.2～2.7)∶(0.8～2.0)，流动相的pH值为7.0-7.5。本发明具有高效、快速和样品无损失等优点，且是一种适合于各种规格的高速逆流色谱仪分离制备异戊酰螺旋霉素III的方法。
文档编号C07H1/08GK102060894SQ201010578139
公开日2011年5月18日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者吴艳阳, 张晓勇, 朱家文, 武斌, 王维娜, 纪利俊, 陈葵, 顾芨芨 申请人:上海同田生化技术有限公司, 华东理工大学