专利名称：改变植物外形(形态)并增加产量的OsMPT基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及改变植物外形并且增加产量的、来源于水稻(Oryza sativa)的OsMPT基因及其用途，更具体而言，涉及包含OsMPT基因的重组植物表达载体，转化所述重组植物表达载体的植物体，调节所述基因的细胞内水平(level)来改变植物外形(architectures),并增加产量的方法,利用所述基因转化植物从而制备结构改变的植物及增加产量的植物的方法，以及包含所述基因的用于改变植物的外形并增加产量的组合物。
背景技术：
水稻(Oryza sativa)是最重要的粮食作物，世界人ロ的1/3以上将其作为主要的食物来源。由于水稻的消费量急剧增加，要求水稻具有更多的产量。因此，要求具有更高的生产カ及生产更具有稳定性的水稻品种[Khush 1997，植物分子生物学35，25-34 (Khush1997,Plant Mol. Biol. 35，25_34)]。称作植物外形(architectures)的植物体地上部分的结构对生产率带来重要的影响。尤其，分蘖角度是决定水稻外形(architecture)的重要特性，较宽的分蘖角度増加由叶子引起的阴影，相反，较窄的分蘖角度有利于高密度种植。因此，能够相对高效性地进行高产量栽培直立生长型(窄的分蘖角度)成为目标，而由古人持续沿用。但是，至今为止直立生长相关的分子和遗传控制机制仍然不明。虽然植物的外形(architectures)受环境因素的影响，但是基因调控机制对植物的生长调节起到重要的作用。有ー些直接调节水稻分蘖角度相关的基因已经被公开。PROGl (PROSTRATE GR0WTH1)编码ー种C2H2锌指蛋白质，progl变异体由于失去了 progl功能而成为直立生长型，成为具有更多水稻颗粒数及更高产量的水稻。[Tan等2008，自然遗传学 40，1360-1364 (Tan 等 2008，Nat. Genet. 40，1360-1364)]由于 TACl (TillerAngleControl 1，分蘖角度控制I)的基因突变成为具有极端直立分蘖的密集的植物[Yu等2007，植物杂志 52,891-898 (Yu 等 2007，Plant J. 52，891-898) ]。LAZYl，TACl 及 PR0G1 在叶鞘叶枕(leaf sheath pulvinus),分蘖基部及叶片与叶鞘的接合部(laminar joint)中表达強烈。
发明内容
要解决的技术问题本发明是鉴于上述要求所提出的，本发明人等通过从Ds转座子基因突变体库(pool)中鉴定OsMP基因突变体并进行研究，制备OsMPT过表达体，了解OsMPT基因的作用，并提供利用上述基因来改变植物外形的方法及增加产量的方法。技术方案为了解决上述问题，本发明提供了来源于水稻(Oryza sativa)的OsMPT (水稻株型改良(Oryza sativa Modifier of Plant Type))蛋白质。另外，本发明提供编码OsMPT蛋白质的基因。另外，本发明提供包含OsMPT基因的重组植物表达载体。
另外，本发明提供转化所述重组植物表达载体的植物体。另外，本发明提供通过调节OsMPT多肽细胞内水平来改变植物外形的方法。另外，本发明通过用OsMPT基因转化植物，从而提供外形得到改变的植物的制造方法。另外，本发明提供了包含OsMPT基因的用于改变植物外形的组合物。另外，本发明提供用OsMPT基因转化植物，从而使产量增加的植物的制备方法。另外，本发明提供通过方法制备出的产量增加的植物。另外，本发明提供包含OsMPT基因的用于增加植物产量的组合物。有益效果本发明中，提供调节OsMPT蛋白质细胞内水平，或者用OsMPT基因转化植物来改变植物外形的方法，用该方法可制备出分蘖角度或者叶子附着在茎上的角度变形的异形植物，特别是上述异形植物可成为高产量的植物。
图I表示OsMPT及拟南芥SGR5的氨基酸序列的取向排列(Alignment)。相同的氨基酸用黑色框表示，类似的氨基酸用灰色框来表示。推测为核位置信号的序列、锌指结构域及卷曲螺旋(coiled coil)域用下划线表示。OsMPT在氨基酸水平上与SGR5具有42%的一致性及54%的相似性。上述两种基因除了在第一个与第二个锌指之间的22个氨基酸之外具有84%的一致性。图2表示Ds插入等位基因的基因组构造及OsMPT: :Ds与其恢复突变体(rev.)的表达。通过将Ds再次移动到原来部位(Ori. Ds)而获得恢复突变体等位基因。对原来的插入变异体与其恢复突变体检查了 OsMPT表达。图3表示非转化对照系统(WT:左側)、OsMPT: :Ds (中间)及恢复突变体(Rev.:右侦lD的分蘖及叶节(laminar joint,叶片和叶鞘交界处)的角度。分蘖角度从主轴测定到最外侧的分蘖。叶节角度从茎測定到叶片的最下部。图4表示OsMPT过表达体(OX)的直立型植物体。过表达体通过减小分蘖及叶节的角度，从而成为直立型植物体。上述角度的程度依赖于OsMPT mRNA水平。下部的印记杂交(Northern blot)分析显示各OsMPT过表达体(OX)的表达水平。图5表示BR突变体(dll-1，d61-l)及OsMPT过表达体(0X)。BR突变体及OsMPT过表达体表现为类似的直立型植物体。以CYP724B1或DWARF4L命名的dll在BR合成过程中催化(6-脱氧)3-双氢睾酮)一(6_脱氧)香蒲留醇((6-deoxo ) 3-dehydroteasterone )—(6-deoxo) typhasterol)步骤。d61_l为BR-受体激酶的水稻bril同源弱等位基因。图6中对比OsMPT及BR信号(d61-l)或者合成(dll-Ι)突变体之间的双重基因突变体的表现型。成熟的植物体是通过OsMPT及d61-l或者dll-Ι之间的杂交而分离的。图7表示了使用OsMPT的直立型植物体。密植时具有高产量潜在性的植物体在OsMPT过表达系(OX)中被挑选出来。东晋为优良粳稻(Japonica)水稻的变种。图8表示包装中的OsMPT过表达系统(移植后约2个月)。(a)及(C)依次表示以标准种植距离(30x15cm)种植的东晋水稻(WT:非转化对照系统)与OsMPT过表达系统(0X19)。
(c)的红色垂直虚线表示WT与0X19之间的界线。(b)及(d)表示密植(15x15cm)的东晋水稻和OsMPT过表达系统(0X14)。(a)及(b)表示在比作物高的位置所拍摄的照片，(c)及
(d)在同作物相似的高度位置所拍摄的照片。图9表示转化植物的表现型评价結果。用过表达体系的所有数据除以非转化对照系统(WT)，转换为表I中提示的百分率。线(100%)上部表示高于非转化对照系统(WT)的值，下部表示低于非转化对照系统(WT)低的值。
具体实施例方式为了达到本发明目的，提供由SEQ ID No. I的氨基酸序列构成的，来源于水稻(Oryasativa)的 OsMPT (水稻株型改良(Oryza sativa Modifier of Plant Type))蛋白质。根据本发明的OsMPT蛋白质的范围包括从水稻(Oryza sativa)中分离的具有由SEQ ID No. I所示氨基酸序列的蛋白质及上述蛋白质的功能同等物。所谓“功能同等物”是指氨基酸的附加、取代或者结实的结果，与上述由SEQ ID No. I所示的氨基酸序列至少具有70%以上的序列一致性，更优选为80%以上的，更优选为90%以上的，更优选为95%以上的，是指与SEQ ID No. I所示的蛋白质实质上具有相同生理活性的蛋白质。另外，本发明提供编码所述OsMPT蛋白质的基因。本发明的基因包含编码OsMPT蛋白质的基因组DNA和cDNA。优选地，本发明的基因可包含由SEQ ID No. 2所示的cDNA碱基序列及由SEQ ID No. 3所示的基因组DNA碱基序列。另外，所述碱基序列的变异体包含在本发明的范围内。具体而言，所述基因可包含分别与SEQ ID No. 2或者SEQ ID No. 3的碱基序列有70%以上的序列一致性的碱基序列，优选为80%以上，更优选为90%，最优选为95%以上。多核苷酸“序列一致性的％”通过比较两个最优排列的序列和比较区域来确定，比较区域中多核苷酸序列的一部分与两个序列的最优排列的參考序列(不包含添加或删除)相比可包含添加或删除(即，缺ロ)。本发明的OsMPT基因以特异叶枕(pulvinus)方式表达。另外，本发明提供包含本发明的OsMPT基因的重组植物表达载体。在本发明的重组植物表达载体中，所述OsMPT基因可由SEQ ID No. 2的碱基序列构成。术语“重组”是指细胞复制异种核酸，或者表达上述核酸或者表达由肽、异种肽或者异种核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞能够将上述细胞的天然形态中不被发现的基因或者基因片段表达为正义或者反义的形态中的ー个。另外，重组细胞可表达从天然状态的细胞中发现的基因，但是上述基因是变形的即通过人为手段在细胞内重新引入的。术语“载体”在向细胞内传递的DNA片段、核酸分子时使用。载体能够复制DNA，并在宿主细胞中単独再生产。术语“传递体”通常与“载体”互換使用。术语“表达载体”是指包含用于表达目标编码序列和在特定宿主生物中可启动地连接的编码序列所必须的适当的核酸序列的重组DNA分子。真核细胞中可利用的启动子，增强子，終止信号及聚腺苷酸信号是已知的。重组载体的优选例子为如根瘤土壤杆菌一祥存在于适当的宿主中时可将其自身的一部分，即能够将所谓的T-区域向植物细胞转移的Ti-质粒载体。其它类型的Ti-质粒载体(參考EP O 116 718 BI号)目前在以下方面利用。将植物细胞或者杂合DNA适当地转移到植物基因组内的可以生产出新植物的将杂合DNA序列转移到原生质体中。Ti-质粒载体的最优选的形态是EP O 120 516 BI号及美国专利第4，940，838号中请求的所谓双元(binary)载体。本发明中优选的双元载体可以是pGA1611，但不局限于此。根据本发明中可用于将DNA引入到植物宿主中的其它优选的载体是源于双链植物病毒(比如，CaMV)及单链病毒、双粒病毒(Gemini virus)等的病毒载体，例如可以从非完整性植物病毒载体中选择。这样的载体的使用尤其是在难于对植物宿主做适当的转化时有利。优选地，表达载体应该包含ー个以上的选择性标记。上述标记通常是具有可用化学方法选择的特性的核酸序列，相当于可将转化细胞从非转化细胞中区分的所有的基因。例如有像草甘膦(glyphosate)或者草胺膦(phosphinothricin)等抗除草剂基因，如卡那霉素(Kanamycin)、G418、博莱霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等的抗生素基因,但不局限于此。本发明的重组载体中，启动子可以是CaMV35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS或者组蛋白启动子，但不局限于此。术语“启动子”是指构造基因的DNA上游区域，是指为了开始转、录RNA聚合酶结合的DNA分子。“植物启动子”为能够在植物细胞开始转录的启动子。“构成性(constitutive)启动子”是在大部分环境条件及生长状态或者细胞分化下具有活性的启动子。由于转化体的选择可以在各种阶段下由各种组织形成，因此构成性启动子在本发明中是可优选的。因此，构成性启动子不限制选择的可能性。更优选地，可以是泛素启动子，但不局限于此。本发明的重组载体中，可使用通常的終止子，例如有胭脂碱合酶(N0S)、水稻α -淀粉酶、RAmylA终止子、菜豆碱(phaseoline)终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的章鱼碱(Octopine)基因的終止子等，但并不局限于此。关于终止子的必要性，通常被认为在这些领域中可提高植物细胞中转录的确定性及效率。因此，本发明的内容中使用的終止子是非常优选的。另外，本发明提供转化本发明的植物表达重组载体的植物体。能够将本发明的载体稳定在原核细胞并且可连续克隆化及表达的宿主细胞可使用在该行业中被公开的任何宿主细胞，例如，大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776、大肠杆菌W3110、枯草杆菌、苏云金芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌株、和鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及多种假单胞菌种等肠内菌和菌株等。另外，将本发明的载体转化到真核细胞的情况下，作为宿主细胞，可使用酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞、人体细胞(例如，CHO细胞株(中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary))、W138、BHK, C0S-7、293、H印G2、3T3、RIN及MDCK细胞株)及植物细胞等。宿主细胞优选为植物细胞，更优选为水稻(Oryza sativa),最优选为东晋水稻,但并不局限于此。对于本发明的将载体搬运到宿主细胞内的方法而言，如果宿主细胞为原核细胞的情况下，可以用CaCl2方法，Hanahan方法及电穿孔方法等来实施。另外，宿主细胞为真核细胞的情况下，可使用显微注射法、磷酸钙沉淀方法、电穿孔方法、脂质体介导转化法、ニこ氨こ基葡聚糖的处理方法、及基因枪等方法将载体注入到宿主细胞内。另夕卜，本发明提供通过调节OsMPT多肽细胞内水平来改变植物的外形!,architectures；的刀法。本发明的OsMPT多肽在植物的叶枕(pulvinus)组织特异性表达，是与分蘖角度的调节或者叶子附着在茎的角度的调节相关的，且上述OsMPT功能通过本发明人们被初次公开。OsMPT优选为具有SEQ IDNo. I的氨基酸序列的多肽。另ー方面，上述多肽可以是对于具有SEQID No. I所示的氨基酸序列的多肽的功能等同物。对于“功能等同物”，就像上述中提到的那样，是指与本发明的OsMPT实质上具有相同活性的多肽。在此，“实质上具有相同活性”是指与植物结构所决定相关的活性。上述功能同等物，例如包括SEQ ID No. I所示的氨基酸序列的氨基酸中的一部分被取代，缺失或者附加的氨基酸序列变异体。氨基酸取代更优选为保守性取代。自然中存在的氨基酸保守取代的例子如下脂肪族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸)、疏水性氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、酸性氨基酸(天门冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(组氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺)及含硫氨基酸(半胱氨酸、蛋氨酸)。氨基酸的缺失更优选为位干与本发明的OsMPT的活性没有直接关系的位置。另外，上述功能同等物的范围中也包含OsMPT的基本骨架及保持其生理活性并且部分化学结构被变异的多肽衍生体。例如，为了改变本发明中多肽的稳定性，储藏性，挥发性或者溶解度等的结构变更及维持生理活性，并且与其它蛋白质融合后形成的融合蛋白质等也包含于此中。本发明中植物的外形是指植物的外部结构或者形态，表示叶、茎、根、花等植物的组织或者器官所具有的各自的形态及其组合形成的整体的形态，更优选地，表示分蘖角度叶片与叶鞘的连接部的角度或者叶子附着在茎上的角度，但并不局限于此。本发明中根据SEQ ID No. I及其功能同等物的细胞内水平，主要是上述组织及器官的一部分或者整体的长度及幅度会发生变化，因此，本发明中植物外形的变化主要表现为根据叶枕(P u IV i n u s )组织的部分或者整体的变化。上述细胞内水平是指细胞存在的量，本领域技术人员可用多种公开的方法去调节其量。例如，细胞内水平可通过在转录阶段中或者转录后阶段中的调节来进行调节，但是不限定于此。转录阶段中的调节可通过以下方法实施。本领域技术人员已知的为了加强基因的表达的方法，例如，制备出在启动子中对SEQ ID No. I或连接对SEQ ID No. I功能同等物进行编码的基因的重组表达载体，从而加强上述基因的表达的方法或者在SEQ IDNo. I或对SEQ ID No. I的功能同等物进行编码的基因的周围，插入能够加强上述基因的表达调节序列的方法，或者用于抑制基因表达的方法，例如诱导启动子或者基因部位突变，阻碍启动子活性或蛋白质的功能的方法，表达反义基因(antisense)的方法，RNAi或微RNA(microRNA)方法等。转录后阶段中的调节可通过以下方法实施。本领域技术人员已知的用于加强或抑制蛋白质的表达的方法，例如，加强或抑制以编码SEQ ID No. I或SEQ ID No. I的功能同等物的基因作为模型转录的mRNA的稳定性的方法，加强或抑制蛋白质或多肽的稳定性的方法或者加强或抑制蛋白质或多肽的活性的方法。作为上述方法的较具体的例子,可通过转化编码如组I内含子型(group I introntype)、MlRNA型、锤头(hammerhead)型或者发夹(hairpin)型或与转录的mRNA作用的微RNA型的DNA序列，或转化含有与靶基因序列相同或相似序列的DNA来诱导共抑制I cosuppression;ο优选地，可通过增加或减少编码多肽的多核苷酸的表达的方法来调节本发明中 SEQ ID No. I的多肽或者与其为同等物的细胞内水平，优选增加上述多核苷酸的表达。这些増加或減少的方法可分别使用本领域技术人员已知的方法，例如，可通过制备启动子上连接SEQ ID No. I的多肽或编码其同等物的多核苷酸的重组表达载体，从而增强其表达，或者可通过制备启动子上连接对于上述多核苷酸的反义多核苷酸的重组表达载体，从而減少其表达。上述多核苷酸优选由SEQ ID No. 2所示的碱基序列构成。上述植物可以是水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、草皮、竹笋、玉米、甘蔗、粟米、芋头、芦笑、洋葱、大蒜、葱、韭菜、山蒜、山药、生姜、大豆、或者油菜等被子植物、但不局限于此。优选为水稻，更优选为东晋水稻。上述植物中受到OsMPT蛋白质的表达变化影响的组织可以是叶枕。
另外，本发明提供外形得到改变的植物的制备方法及由该方法制备的外形改变的植物。上述方法包括使用OsMPT或者对与其功能同等物进行编码的多核苷酸转化植物的步骤。优选地，上述多核苷酸可由SEQ ID No. 2所示的碱基序列构成。植物的转化可通过本领域技术人员已知的转化技术来实施。优选利用土壤杆菌的转化方法、基因枪转化法(microprojectile bombardment)、电穿孔法(electroporation)、PEG 介导融合法(PEG-mediated fusion)、显微注射法(microinjection)、脂质体介导转化法(liposome-mediated method)、植物体内转化法(In planta transformation)、真空渗透法(Vacuum infiltration method)、花分生组织浸溃法(floral meristem dippingmethod)、农杆菌喷涂方法(Agrobacteria spraying method)、优选利用土壤杆菌的转化方法、最优选利用土壤杆菌株’ LBA4404’转化的方法，但不局限于此。此时，上述多核苷酸可以为可操作地连接在启动子上的状态，以使得能够在转化植物中表达,例如可以是与启动子可操作地连接的重组植物表达载体的形态。‘可操作地连接(operably linked)’是指ー个核酸片段与其它核酸片段结合,其功能或者表达受到其它核酸片段的影响，而上述启动子及重组表达载体如上述所述。转化的植物细胞可以是液体培养物、愈伤组织、原生质培养物，也可以是分化为植物的组织或者植物。植物细胞的培养是通过将植物的一部分从母体分离后在适当的条件下进行无菌培养后培育的，可使用组织片段的液体培养、组织片段的愈伤组织培养、原生质培养等本领域技术人员已知的任何方式，其培养条件及方法可以使用本领域技术人员已知的条件及方法实施。将所述已培养的植物细胞分化为植物是指将愈伤组织、原生质体形态的已培养的植物细胞在适当的条件下诱导分化，从而分化为植物的组织或者植物，其分化条件及方法可以用本领域技术人员已知的条件及方法来实施。上述植物可以是水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、草皮、竹笋、玉米、甘蔗、粟米、芋头、芦笋、洋葱、大蒜、葱、韭菜、山蒜、山药、生姜、大豆或者油菜等被子植物，但不局限于此。优选为水稻，更优选为东晋水稻。另外，本发明提供ー种包含OsMPT基因的用于改变植物外形的组合物。所述OsMPT基因在叶枕中特异表达，从而与调节分蘖角度、调节叶节的角度或调节叶子附着在茎上的角度相关本发明的组合物中，上述OsMPT基因优选地，可以由SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的碱基序列构成。在本发明的组合物中，上述OsMPT基因可以包括在OsMPT基因序列中特定喊基序列被摘入、取代、缺失的基因。另外，本发明提供产量增加的植物的制备方法，其包括利用OsMPT基因转化植物的步骤。
上述术语“产量”是指具有经济价值的可測定的生产量，典型地与特定作物面积及时期相关。每个植物体部分根据直接用大小和或重量来评估产量，或者实际产量为作物每英亩的年产量，这是总生产量(包含已收获的及被评价的生产量)除以种植的英亩来决定的。植物的“产量”可与植物体的营养组织生物量(根和/或者幼茎生物量)，生殖器官，及/或者繁殖体(例如，种子)相关。例如，水稻的产量增加由如下中的ー个以上来表示每公顷或者英亩植物体的数量増加；每植物体穗粒(果实)数的増加；穗数、每穗中的颗粒数、每颗粒的重量、千粒重量、果实长度/直径的増加；种子结实率(饱满的种子数/全部种子数xlOO)的増加。上述术语“增加”可与“提高”或者“加強”互換使用，是指与本发明中定义的对照区植物相比至少提高3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或者10%，优选为至少15%或者20%，更优选的说25%、30%，35%或者40%以上的产量和丨或生长。
另外，本发明提供通过上述方法制备的产量増加的植物。上述植物可以是水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、草皮、竹笋、玉米、甘蔗、粟米、芋头、芦笑、洋葱、大蒜、葱、韭菜、山蒜、山药、生姜、大豆，或者油菜等被子植物，但不局限于此。优选为水稻，更优选为东晋水稻。另外，本发明提供包含OsMPT基因的用于增加植物产量的组合物。本发明的组合物中，上述OsMPT基因优选由SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的碱基序列构成。本发明的组合物中，上述OsMPT基因可包含OsMPT基因序列中特定碱基序列被插入、取代、缺失的基因。以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅仅用于，例示本发明，因此本发明的内容不受下述实施例的限定。实验方法I.植物材料及生长条件东晋水稻用作野生型对照区。Ds转座子基因突变体库(pool)用于OsMPT基因突变体的分离。本发明中使用的BR突变体中d61-l突变体获自日本名古屋大学的松冈(Matsuoka)教授,dll-Ι及d2_2突变体获自首尔大学的Gohuijong教授。植物是从6月到10月在韩国的稻田中培育,在生长箱(growth chamber)的26°C温度下,在16小时照明/8小时黑暗的光周期下培育的。2.突变体及恢复突变体分离水稻叶枕(pulvinus)的特异基因是由OsMPT基因Ds插入体鉴定的。Ds插入部位的侧翼区域的序列分析表明OsMPT的第二个外显子内第三个C2H2锌指结构域中被插入了转座子(图2)。使用了基因特异性引物的RT-PCR表明转录物在基因突变体中不被表达(图2)。为了获得其它基因突变体等位基因及恢复突变体等位基因，包含Ac的OsMPT(OsMPT: Ds )世代通过组织培养用于再分化过程中。OsMPT基因位点的新的11个transposedDs插入基因突变体、恢复突变体从再生植物中被分离(图2)。3. OsMPT cDNA 克隆化全长OsMPT cDNA是通过cDNA末端快速扩增聚合酶链反应(R ace PCR)及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分离的。包含UTR (非翻译区)的5’及3’末端通过Race PCR被克隆化，其它部位通过RT-PCR扩增。使用的引物对如下对5’ Race-PCR为5’ -acctgtccgactccagcagcgtcctcg-3，(SEQ ID No. 4);对 3，Race-PCR为 5，-gtacaacttgtacgttcacgtgtgta-3，(SEQ ID No. 5)；对 RT-PCR 为 5，-cggcatcaagaagcacttc-3，(SEQ ID No. 6)及5，-ggatgatggtgatgatgccgca-3，(SEQ ID No. 7)。Race-PCR cDNA 是使用 BD SMART RACEcDNA Amplifica tion Kit (Clontech,美国)而合成的。RT-PCR cDNA 是通过 SAM 周边组织的RNA使用SuperscriptII逆转录酶(英杰公司，美国)而制备的。4.过表达转化体的生产为了生产OsMPT过表达转化体，构成式泛素(Ubiquitin)启动子由双元载体pGA1611通过克隆化与OsMPT全长cDNA融合。上述构造物转化土壤杆菌(Agrobacterium)菌株‘LBA4404’，并导入到东晋水稻的愈伤组织引入，生成转化体。5. RNA 定量总细胞RNA 是使用 TRIZOL 试剂(TRIZOL reagent) (MRC, http://www. mrcgene.com/)或者植物 RNA 提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kits)(Qiagen,http://www. qiagen.com/)分离的。为了定量RT-PCR，第一条链cDNA使用了莫罗尼鼠白血病病毒(MMLV，Moloneymurine leukemia virus)逆转录酶核糖核酸酶H (RNaseH)(日本东洋纺织，http://www.toyobo. co. jp/e/)按照制造商的指南,在包含脱氧核糖核酸酶(DNase)处理的RNA及Oligo·dT 12-18引物(英杰公司，http://www. invitr-ogen. com/)的25 μ L反应混合物内合成。上述反应物(IuL)用于PCR扩增。ACTl mRNA (肌动蛋白I)用作用于定量cDNA的标准物质。使用的引物对如下^ACTl为[McElroy等1990，植物分子生物学14:163-171 (McElroy等 1990，Plant Mol. Biol. 14:163-171) ]5，-CGAGGCGCAGTCCAAGAG-3’ (SEQ ID No. 8)及5’-CCCAGTTGCTGACGATACCA-3’ (SEQ ID No.9);对 OsMPT 为 5’-CGGCATCAAGAAGCACTTC-3'(SEQ ID No. 10)及 5’-ggatgatggtgatgatgccgca-3’ (SEQ ID No. 11)。反应是在 95°C下进行5分钟的初期改性，接着在94°C下反应15秒，在60°C下反应30秒，及在72°C下反应40秒。各扩增中使用的循环次数如下ACT1，25循环；0sMPT，32或者35循环。扩增的PCR产物在I. 5%琼脂糖凝胶中被分离。6.表现型分析6-1.表现型分析准备调查了 OsMPT过表达体在野外稻田中的性能。选出两个转化系(0X14与0X19)进行増殖。为了现场测试，将两个独立的转化体(0X14与0X19)各自的两个系与非转化对照系统(WT (0X14)与WT (0X19))进行并列裁植。转化后在下一代中会分离为有T-DNA和无T-DNA的系统，有T-DNA的系统表示为0X14或0X19，无T-DNA的系统表示为WT(OXH)或WT(0X19)。总共6个系用两种不同的裁植密度(30X 15cm (23. 3植物/m2)与15X 15cm (46. 7植物/m2)进行裁植实验。在密阳(韩国地名)农村振兴厅GMO实验场中培育植物体。根据农村振兴厅的水稻标准栽培方法进行栽培及管理。各实验区(plot)的大小为2X1. 5m，根据随机区组(randomized blocks)进行2次反复实验。在各实验区中，将总共70以及140个植物个体按照标准密度及高密度进行裁植。除了边缘植物体以外，从各个实验区收获临近的3个个体。按照标准裁植距离种植的0X19非转化对照系统(WT (0X19))因倒伏(lodging)而消失，从而被排除棹。6-2.在稻田观察OsMPT过表达系统的生长型在野外稻田的群落状态下为了验证OsMPT过表达系统的生长型及表现型的表达，在GMO稻田中在两种裁植密度下，即在标准裁植距离(30X 15cm)和密植裁植距离(15X 15cm)下种植后进行观察。6-3.參数测定从标准密度稻田及高密度稻田中，收割了在相邻列中约30个体及60个体的植物体。但是以标准裁植距离种植的0X19的非转化对照系统(WT (0X19))，在上述两个稻田中因倒伏(lodging)而消失。測定了下述收割相关因素茎杆长度(culm length)、穗长(panicle length)、植物体圆锥花序数量(number of panicles per plant)、小穗总数(total number of spikelets)、肥沃种子总数(total number of fertile seeds)、颗粒总直量(total grain weight)。实施例I. OsMPT对具有锌指结构的蛋白质进行编码 OsMPT对具有4个锌指结构(C2H2C2H2C2HC C2HC)的核蛋白质进行编码。该基序类似于已发表的玉米花期调节基因“Idl (Indeterminatel)”所具有的锌指结构(Colasanti等 2006，BMC 基因组学 7，158 (Colasanti 等 2006，BMC Genomics7,158))。实施例2. OsMPT是重力反应相关的拟南芥(Arabidopsis) SGR5的功能同源体lorthologue)据报导，拟南芥SGR5 (射击重力反应5 (Shoot Gravity Response5))与重力反应相关(Morita 等 2006，植物杂志 47,619-628 (Morita 等 2006，Plant J. 47，619-628))。OsMPT在氨基酸水平中与SGR5具有42%的一致性及54%的相似性(图I)。目前，正在为报告OsMPT的重力反应相关的下述数据而做准备=OsMPT的后生木质部，叶枕(禾本科的重力感应器官)及laminar joints (叶片与叶鞘的连接部)中特异地表达。基因突变体的屈地性极度減少。OsMPT的过表达体表现出提高的屈地性反应。实施例3. OsMPT基因突变体及过表达体对分蘖及laminar joint角度起到相反的效果OsMPT调节分蘖及叶片与叶鞘的连接部的角度。基因突变体的分蘖及叶片与叶鞘的连接部(图3)角度变宽。相反，过多生产OsMPT的个体会显示窄的分蘖角度及生长为直立的叶(图4)。OsMPT过表达体的表现型与BR(brassinosteroid)基因突变体类似(图5)。遗传分析表示，OsMPT基因突变体在决定分蘖角度时相对于BR信号基因突变体d61-l及BR缺陷基因突变体dll-Ι,位于下部(epistatic)(图6)。OsMPT显示出在BR作用的下部起作用。实施例4. OsMPT的农业实用性水稻产量受到由分蘖数、分蘖角度、节间伸长、圆锥花序形态、及叶角(leafangle)所定义的植物外形(architectures)的极大影响。上述因素中，分蘖及叶角能够决定叶子表面阳光入射效率因此是重要因素。到目前为止，对水稻来说，BR缺陷是导致直立型植物的唯一的已知因素。已经证明出利用BR-缺陷基因突变体密植直立型水稻植物体水稻时，有更高的产量(Sakamoto等2006，自然生物技术24，105-109 (Sakamoto等2006，Nat.Biotechnol. 24，105-109))。OsMPT在BR作用的下部起作用，因此在OsMPT转化体中不期待BR体内平衡(homeostasis)的变更。另外，相比于BR合成或者抑制信号基因，OsMPT-过表达战略更加容易。实施例5.在稻田中OsMPT过表达系统的表现型分析为了验证群落中生长和表现型表达，在GMO稻田中对两种裁植密度进行栽培观察。如图8所示，OsMPT过表达系统在标准裁植距离(30x15cm)和密植裁植距离(15x15cm)中表现出明显的直立生长。OsMPT系统在密植栽植距离中由于植物间的空间有保障，因此行间距也非常明显。密植栽培的情况下，一般的水稻(东晋水稻)在经过雨季时出现了倒伏现象，但是OsMPT对倒伏显示出抵抗性，因此被认为对密植栽培有着极好的适应能力。将转化植物的表现型评价结果按照各指数的平均值及标准偏差来表示并列于表I中。值为表I的各列中列举的植物体数的平均值。表I收获指数2010年
II iIciii
———f高密豐标准密沒j高密.S
$WT f m J 雜2WT 「#1 *[ #2 WT ] #1 〗Wi [ 01 f #2
~植％总数 H282Tiom 6023 I €0sim~
..............PH...............I..........PmIusiiliWnUiiIoOWsImi Imimli'is,4...............
C咖,—% Μ1sj% %MmmMwm110.2%100%
"TaTM Im 3942 4312893J1479 IiS Μ~
剛 AVteIim12,7711.136.92 7,046.88$.43 9,637.226.676,90
%100%ioa.o%m,mim%101.7%ms%100%sa.4%$s.m
S.D.2.054 2-43 2.61152 1.311.341.47IJO1.291591.68
PL _ 森W__J2.1 _ _ 22.5 __233 __2L2__22S __ ^ 22.4 ___2832§.5IlM__2fi.3 — _ 211 _
%100%101.8%105.4%100%106.1%105.6%%m%12i-S%120.8%
LUUyD」 S.D.137 1,17 1.101.096 UB1.151.29121561.61.5
TNS AVi1278.661328.S7 1227.78632.7767S.18673.201103.78 1203.89 660.05822.718S4.28
%100%103.9%96.0%100%106-7%1064%100%124.6%129.4%
S-D* 23SJ9 2S121 272.04 ISSM 162.08 122.01214,48 218,10 140,60 207.24 212.18
HfG AVi ioss3T %%mm sss.ia m .m M7.m %zi~m 912.13 f 3Ji sbsaI otj siaIF"
iim iai% 100% 3Hi% HO%ios% uat%ns3%
19650 24X52 HS SIS§515189.28 172.32 3 2 ΜΜ 177.S6 ..
TSW AV6 2S.S1 24.04 20.78 11.97 12.63 12.42ITJO 17.94 13.73 133S 13J1
% m% mm% bis% tm% iosj% i03.s%tm% mj% tm.m
j S.D. I 5,45 J 6-34 J 4,46 Γ 3,67 I 358 Γ 2.51 J f 4.40 Γ 3.00 I 156 Γ 3.93 J 430PH,植物高度；PN，穗数；TNS，种子总数；NFG，结实种子总数；TGW，总粒重；AVE，平均标准偏差；％，野生型同胞(sibling)的MPTl比率。穗长(panicle length)在OsMPT系中0X19系长出约5 20%。与非转化对照系统相比，OsMPT系在高密度稻田中比在标准密度稻田中种子总数增加了。种子总数与非转化对照系统相比，在OsMPTOX系中高约6 30%。高密度稻田的OsMPT植物相比标准密度稻田的植物种子的结实率高。OsMPT与非转化对照系统相比生产出了多达6 20%的结实种子。每植物体的粒重(grain weight)在OsMPT系中增加至5%。OsMPT OX系在高密度裁植中表现出了较好的性能。OsMPT OX的穗长(paniclelength)、穗粒数(grain number)、结实种子(filled seeds)及总粒重(grain weight)增加了。
权利要求
1.一种来源于水稻(Oryza sativa)的 OsMPT(水稻株型改良(Oryza sativa Modifierof Plant Type))蛋白质,其由SEQ ID No. I的氨基酸序列构成。
2.根据权利要求I所述的OsMPT蛋白质，其特征在于，所述OsMPT蛋白质与SEQIDNo. I的氨基酸序列具有70%以上的氨基酸序列一致性。
3.ー种编码权利要求I中所述蛋白质的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因是由SEQID No. 2的碱基序列构成。
5.包含权利要求3所述的基因的重组植物表达载体。
6.转化权利要求5所述的重组植物表达载体的植物体。
7.ー种通过调节具有SEQ ID No. I所示的氨基酸序列的多肽细胞内水平(level)来改变植物外形的方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述改变植物的外形是调节分蘖角度或者调节叶附着在茎上的角度。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞内水平的调节是通过增加或者減少编码所述多肽的多核苷酸的表达而实施的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸由SEQID No. 2所示的碱基序列构成。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物选自水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、草皮、竹笋、玉米、甘蔗、粟米、芋头、芦笋、洋葱、大蒜、葱、韭菜、山蒜、山药、生姜、大豆或油菜等被子植物。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞为叶枕(pulvinus)组织细胞。
13.ー种外形得到改变的植物的制备方法，其包括利用权利要求3所述的基因转化植物的步骤。
14.ー种外形改变的植物，其通过权利要求13所述的方法来制备。
15.ー种包含权利要求3所述的基因的用于改变植物外形的组合物。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述改变植物的外形是调节分蘖角度或者调节叶子附着在茎上的角度。
17.一种产量増加的植物的制备方法，其包括利用权利要求3所述的基因转化植物的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,所述植物选自水稻、小麦、大麦、燕麦、黒麦、草皮、竹笋、玉米、甘蔗、粟米、芋头、芦笋、洋葱、大蒜、葱、韭菜、山蒜、山药、生姜、大豆或油菜等被子植物。
19.一种产量増加的植物，其通过权利要求17所述的方法来制备。
20.ー种包含权利要求3所述基因的用于增加植物产量的组合物。
全文摘要
本发明涉及根据调节分蘖角度或者调节叶子附着在茎上的角度的来源于水稻(Oryza sativa)的OsMPT(水稻株型改良(Oryza sativa Modifier of Plant Type))蛋白质、编码上述蛋白质的基因、包含上述基因的重组植物表达载体、转化上述重组植物表达载体的植物体、调节上述基因细胞内水平来改变植物外形(architectures)的方法、用上述基因将植物进行转化而制备外形改变及产量增加的植物的方法、通过上述方法制备的产量增加的植物、以及包含上述基因的用于改变植物的结构并增加产量的组合物。
文档编号C07K14/415GK102725411SQ201080062158
公开日2012年10月10日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年1月22日
发明者崔良焘, 韩昌德 申请人:庆尚大学校产学协力团