专利名称：免疫亲和沉淀法纯化抗体的制作方法
技术领域：
本发明是一种免疫化学方面的抗体纯化新方法，主要涉及免疫化学的研究和医药卫生的生产领域。
背景技术：
在许多免疫化学的研究和医药卫生的生产过程中，常常需要免疫亲和层析级别的纯化抗体。为了得到亲和力好、特异性强、纯度高的抗体，现在常用的纯化方法是免疫亲和层析法。免疫亲和层析法的过程是一般情况下，先用偶联剂溴化氰(CNBr，有剧毒，操作时需要防护)将抗原连接到固相载体一琼脂糖凝胶(S^harose 4B或6B)上作为免疫吸附齐U，然后将免疫吸附剂装入层析柱中，用淋洗液洗去未被连接的抗原和连接剂后，即可上样待纯化的抗体混合物，当混合物中的抗体与免疫吸附剂上连接的抗原靠近时，抗原抗体会产生特异性结合，形成抗体-免疫吸附剂结合物，从而将需要纯化的抗体暂时地特异固定·在免疫吸附剂上，混合液中的其他组份则游离在液相中，充分反应后，淋洗除去未结合的其他混合物，淋洗完的层析柱上只留下单一的抗体-免疫吸附剂结合物，最后，再通过改变PH值，解离抗原和抗体的结合，从而洗脱下亲和力好、特异性强、纯度高的抗体。免疫亲和层析法用于纯化抗体时存在的缺点①制备免疫吸附剂时，要使用偶联剂溴化氰，该化合物有剧毒，操作时要特殊防护；②经活化的琼脂糖凝胶比较昂贵，生产制备时购置成本高。
发明内容
本发明采用免疫亲和沉淀法纯化抗体首先，采用以丙烯酰胺和丙烯酸为单体的共聚物固相微球(该微球是圆球状，直径为2 5μπι，可悬浮于水溶液中)作为固相载体，这种固相载体上含有羧基(-C00H)，将含有氨基(-NH2)的抗原与固相载体混合，再加入偶联剂——I-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，室温震荡反应过夜，EDC能使羧基和氨基脱水形成酰胺键，从而将抗原连接到固相载体上，形成了抗原-固相载体的免疫吸附剂。通过离心洗涤，除去未被连接上的抗原和其他混合物后，得到单一的免疫吸附齐U。然后，将待纯化的抗体原液与免疫吸附剂混合，2 8°C放置过夜，抗原抗体产生特异性结合，形成抗体-免疫吸附剂结合物，通过离心洗涤，除去未结合的其他混合物，得到单一的抗体-免疫吸附剂结合物，再降低体系中的PH值，则抗体就会被解离到溶液中，通过离心分离上清后立即用碱性溶液调整上清液的PH值到中性，此上清经透析后即为纯化的抗体溶液。免疫吸附剂通过离心洗涤后悬浮于免疫吸附剂保存液中，2 8°C放置，可重复用于纯化抗体。免疫吸附剂保存液的组份为0. 02M PB(磷酸盐缓冲溶液，pH7. 4)、0. 9% NaCl、O. 1% NaN3。本发明所用的固相载体制备成本低。抗原和固相载体的偶联剂是碳二亚胺(EDC)，无毒性。连接过程为室温震荡过夜，非常简便。抗体的纯化过程，采用的是最常用的离心方法，一次可大批量制备。而且，免疫吸附剂经纯化抗体后，还可重复使用，2 8°C下也可长期保存。所以，本发明建立了一种操作简便、不操作剧毒物、制备成本低廉、适合大量生产、可用于制备纯度达到免疫亲和层析级别抗体的方法。本发明操作步骤如下I、抗原的准备用于本发明的抗原需要有氨基(-NH2),—般的蛋白质抗原都有氨基，经过纯化后即可使用。2、固相载体的准备固相载体在偶联前，一般需要先用O. OlMPB (pH7. 4)的缓冲液离心洗涤3次，用以除去悬浮液中的杂物。本发明中的通用离心条件为离心机转速要求不小于每分钟3500转，离心时间不小于10分钟，洗涤时每次用不小于10倍固相载体体积的O. OlMPB (pH7. 4)的缓冲液。3、固相载体与抗原的连接将固相载体和抗原(加入前测抗原的浓度)共同混合于O. OIMPB(pH7. 4)的缓冲液中，再加入EDC的水溶液，于室温下震荡反应过夜。因为固相载体上含有羧基，羧基在EDC的作用下可与抗原上的氨基共价连接，从而使得固相载体 和抗原产生稳定的共价连接形成了免疫吸附剂。固相载体与抗原连接后，离心，测上清抗原浓度，从而可计算免疫吸附剂上连接的抗原量。然后，再对免疫吸附剂离心洗涤至上清A28tol (溶液在280nm紫外光下的光吸收值)< O. 02。洗涤完后，免疫吸附剂用等体积左右的0·01ΜΡΒ(ρΗ7·4)的缓冲液悬浮。4、免疫吸附剂与抗体的结合取一定体积的待纯化抗体原液直接加入到免疫吸附剂悬浮液中，2 8°C放置过夜。次日，离心，沉淀物即为抗体-免疫吸附剂，除去上清，将抗体-免疫吸附剂离心洗涤至上清A28tol < O. 02。5、抗体-免疫吸附剂的解离取抗体-免疫吸附剂沉淀物，加入pH值为2 3的甘氨酸-盐酸缓冲液，混匀，放置5分钟后离心，分离出上清后立即用氢氧化钠溶液调整上清的PH值到7. O左右。此解离的上清即为纯化的抗体溶液。6、抗体纯化后的处理将解离的上清用透析袋对O. OlMPB(pH7. 4)的缓冲液透析，透析后用紫外分光光度仪测蛋白浓度。7、免疫吸附剂的保存和重复使用将纯化抗体后的免疫吸附剂离心洗涤至上清A280nm < O. 02，然后悬浮于免疫吸附剂保存液中，2 8°C保存，可重复用于纯化抗体。8、纯化抗体的检验将纯化的抗体标记上1251，再取少量125I-抗体同含过量抗原的免疫吸附剂混合反应足够时间，通过计算同一次实验中被结合的125I-抗体量占实验体系中加入的总125I-抗体量的比率可间接得出纯化的抗体中有活性的抗体量占纯化抗体总蛋白量的比率。
具体实施例方式实例用免疫亲和沉淀法纯化兔IgG的抗体。①兔IgG的纯化(此时兔IgG被当作抗原，对应的抗体为兔IgG的抗体)^lOml兔血清，用硫酸铵沉淀法粗提，并对O. OlMPB (pH7. 4)的缓冲液透析，4500ml/次，共更换三次透析液，得浓度为13. 54mg/ml的兔IgG13. 3ml。②固相载体与兔IgG的连接取Ig固相载体用O. OlMPB(pH7. 4)的缓冲液离心(3500r/min)洗涤3次，离心时间10分钟，每次用400ml O. OlMPB (pH7. 4)的缓冲液，固相载体离心后沉淀的体积大约为19ml。固相载体用19ml0.01MPB(pH7.4)的缓冲液复悬，取100 μ I此未连接兔IgG的固相载体悬浮液留样，再加入上步粗提的兔IgGlOmlJP 135. 4mg,及300mg EDC (上午11:00加完)，室温震荡反应，下午15:00再补加200mg EDC，继续震荡反应过夜。次日离心，分离出上清为30ml，测上清蛋白浓度为2. 37mg/ml，则上清中含有71. Img未被连接的兔IgG,而固相载体上连接有64. 3mg兔IgG0用400ml O. OlMPB (ρΗ7· 4)的缓冲液离心(3500r/min)洗涤连接有兔IgG的免疫吸附剂，每次离心10分钟，共离心洗涤3次后，测得上清A280nm = O-Oll0③沉淀用20ml O. OlMPB (pH7. 4)的缓冲液悬浮，取100 μ I此免疫吸附剂悬浮液留样，再加40ml兔IgG的抗体血清，混合后2 8 °C放置过夜。④次日，3500r/min离心10分钟，分离上清,取沉淀；用400ml O. OlMPB (pH7. 4)离心洗涤，每次离心10分钟，重复3次，测上清A280nm = 0.017 ;取沉淀，加入O. IM ρΗ2· 4甘氨酸-盐酸缓冲液30ml，混匀，5分钟后离心，分离出上清，上清立即用2M NaOH溶液调整pH到7. O左右，并对O. OlMPB (pH7. 4)的缓冲液透析，4500ml/次，共换三次透析液。最后，将免 疫吸附剂离心洗涤至上清A28tol < O. 02后放于免疫吸附剂保存液中悬浮，2 8°C保存。⑤用紫外分光光度仪测纯化的兔IgG的抗体蛋白浓度为2. 04mg/ml (见表I)，总体积有31ml，所以共收到63. 24mg的纯化抗体。⑥重复一次纯化抗体将纯化抗体后的免疫吸附剂悬浮液离心取沉淀，再重复③ ⑤的操作步骤(第③步中，不需要再取100μ I免疫吸附剂悬浮液留样)，第二次操作得到纯化的兔IgG的抗体31ml,浓度为I. 92mg/ml (见表I),共59. 52mg。将两次纯化的抗体混合，得兔IgG的抗体62ml,浓度为I. 98mg/ml,共122. 76mg。表I纯化抗体的浓度检测表
纯化抗体原液稀释 f布释后蛋白原液蛋白浓 批次倍数__28°nm26°nm 浓度(mg/ml)度(mg/ml)
4 倍0.6180.5170.512.04
的抗体_____
第二次纯化 &
4 倍0.5820.4920.481.92
的抗体 _____注蛋白浓度(mg/ml)= I. 45A280nm-0. 74A260nm⑦纯化抗体的检验(I) 125I-兔IgG的抗体的制备取19. 8 μ g/10 μ I纯化的兔IgG的抗体，加200 μ 10. 2ΜΡΒ (ρΗ7· 4)、500 μ Ci Na125I 溶液，混匀；加入 15 μ g/30 μ I 氯胺-T 水溶液，室温震荡反应I. 5分钟；再加入30 μ g/30 μ I偏重亚硫酸钠水溶液，室温震荡反应I. 5分钟；将反应液上葡聚糖凝胶G-25分离柱，用O. OlMPB (ρΗ7. 4)的缓冲液淋洗，用Y -射线检测仪监测流出液的125I放射性计数，流出液有两个放射性计数峰，第一个峰即为125I-兔IgG的抗体产品峰，收此产品峰约3ml共280 μ Ci，取20 μ I收到的125I-兔IgG的抗体浓溶液加入到50ml实验缓冲液中，该实验缓冲液组份为0. 02MPB(pH7. 4),0.5% BSA(牛血清白蛋白)、
O.1% NaN3。混匀，此配好的溶液即为125I-兔IgG的抗体标记物。如果收到的产品峰回收了 80%投入的兔IgG的抗体，则500 μ I125I-兔IgG的抗体标记物中大约含125I-兔IgG的抗体量如下19. 8μ gXO. 8 + 3000X20 + 50000X500 ^ I. Ing(2)过量兔IgG-免疫吸附剂与125I-兔IgG的抗体标记物的结合用实验缓冲液将留样的未连接兔IgG的固相载体悬浮液(用于做对照实验)和连接了兔IgG的免疫吸附剂悬浮液分别按I : 50、1 IOOU 200稀释，则每IOOy I I 200的免疫吸附剂悬浮液中含有兔 IgG 的量为64. 3mg+(19+20) Χ0. 1 + 200 O. 8 μ g，I 50 和 I : 100 稀释度的免疫吸附剂中含有兔IgG的量则更多。将各稀释度均做如下实验(见表2):表2兔IgG-免疫吸附剂与纯化抗体结合实验操作表
权利要求
1.一种免疫亲和沉淀法用于纯化抗体，其特征包括以下步骤采用含羧基(-COOH)的以丙烯酰胺和丙烯酸为单体的共聚物固相微球作为固相载体，同含有氨基(-NH2)的抗原混合，再加入偶联剂一I-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，室温震荡反应过夜，从而将抗原连接到固相载体上，形成抗原-固相载体的免疫吸附剂；然后，将待纯化的抗体原液与免疫吸附剂混合，2 8°C放置过夜，抗原抗体产生特异性结合，形成抗体-免疫吸附剂结合物，通过离心洗涤，除去未结合的其他混合物，得到单一的抗体-免疫吸附剂结合物；再降低体系中的PH值，则抗体被解离到溶液中，通过离心分离上清后对上清透析，即得到纯化的抗体；免疫吸附剂可通过离心洗涤后悬浮于保存液中，2 8°C放置，可重复用于纯化抗体。
2.根据权利要求I所述的免疫亲和沉淀法，其特征在于，采用以丙烯酰胺和丙烯酸为单体的共聚物固相微球作为免疫亲和沉淀法的固相载体。
3.根据权利要求I所述的免疫亲和沉淀法，其特征在于，固相微球与抗原的连接是通过固相微球上的羧基与抗原的氨基形成的共价键连接。
4.根据权利要求I所述的免疫亲和沉淀法，其特征在于，采用碳二亚胺(EDC)作为固相载体与抗原的偶联剂。
5.根据权利要求I所述的免疫亲和沉淀法，其特征在于，采用离心方法分离纯化过程中的固相和液相，包括用离心方法分离解离后的抗体与固相免疫吸附剂。
6.根据权利要求I所述的免疫亲和沉淀法，其特征在于，免疫吸附剂与抗体的解离是通过降低体系中的PH值到2 3实现的。
全文摘要
本发明公开了一种免疫亲和沉淀法用于纯化抗体，其过程为采用丙烯酰胺和丙烯酸为单体的共聚物固相微球作为固相载体，通过偶联剂——1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)将抗原连接到固相载体上形成免疫吸附剂，将待纯化的抗体原液与免疫吸附剂混合，充分反应后形成抗体-免疫吸附剂结合物，通过离心洗涤除去未结合的其他混合物，得到单一的抗体-免疫吸附剂结合物，再降低体系中的pH值，则抗体被解离到溶液中，通过离心分离上清后对上清透析，即得到纯化的抗体。本发明建立了一种操作简便、适合大量生产、制备纯度达到免疫亲和层析级别抗体的方法。
文档编号C07K16/00GK102942627SQ20121005408
公开日2013年2月27日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者贺佑丰, 袁鹏飞, 吕东川, 谷泽亮, 张庚宽, 王丁泉 申请人:北京北方生物技术研究所