专利名称：：人或人源化免疫球蛋白在非人转基因动物中增强的表达的制作方法
技术领域：
：本发明涉及通过促进正常B细胞发育和通过维持携带有人(或人源化)免疫球蛋白基因座的非人动物中人(或人源化)抗体的表达而改善非人转基因动物中人(或人源化)免疫球蛋白的表达的方法。特别地，本发明涉及同时表达编码人(或人源化)Iga和/或IgP(B细胞受体的组分)的转基因以及编码人(或人源化)免疫球蛋白基因座的转基因。本方法允许人(或人源化)抗体例如在转基因非人动物的血液、乳液或卵中的显著表达。_4]相关技术的i兑明抗体是已经成功用于治疗多种人类疾病和病症(例如癌症、过敏性疾病)、预防移植排斥和宿主抗移植物疾病的一类重要的药学产品。获得自非人动物的抗体制剂的主要问题在于非人免疫球蛋白在人类患者中的固有免疫原性。为了降低非人抗体的免疫原性，已表明可以通过将动物可变区(V)外显子与人类恒定区(C)外显子融合而获得嵌合抗体基因。该嵌合或人源化的抗体具有对人类最小的免疫原性并且适合用于人类受试者的治疗性治疗。已经研发了人源化单克隆抗体并且将其用于临床应用。然而，总体上，无论是嵌合、人源化还是人单克隆抗体在治疗诸如癌症或烈性病原体感染等破坏性疾病上的应用由于这些疾病的复杂性、多因子病因学和适应性而受到限制。针对于单一限定靶标的单克隆抗体通常在这些靶标改变、进化和突变时失效。例如，恶性肿瘤可获得对标准单克隆抗体治疗的抗性。这一问题的解决方案是使用具有靶向多个进化靶标能力的多克隆抗体。多克隆抗体可以中和细菌或病毒毒素，并引导免疫应答以杀死和消除病原体。因此，对于大规模生产高效价、高亲和性、人源化多克隆和单克隆抗体的适合方法存在巨大的临床需求。此外，由于从抗体产量的角度讲偏爱在如兔、鸡、绵羊和牛等较大型转基因动物中生产抗体，因此也高度需要表达较大量转基因编码的产物的较大型建立者动物的产生。人源化单克隆抗体通常是这样的人类抗体，其中一些⑶R残基，以及可能一些FR残基由来自非人动物(如啮齿类)的抗体的同功位点残基所取代。基本上可以按照Winter及其同事的方法(Jones等人，Nature,321:522(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323(1988);Verhoeyen等人，Science,239:1534(1988))，通过用非人动物(例如啮齿类)CDR或CDR序列取代人类单克隆抗体的相应序列而进行人源化。在动物中制造人源化抗体时遇到的一个问题是宿主抗体的内源性生产高于转基因抗体，而需要抑制该内源性抗体的生产。已经描述了抗体(嵌合和种系突变鼠中的重链连接区(JH)基因)的纯合缺失，导致内源性抗体生产的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到该种系突变鼠中将导致在抗原攻击时人抗体的生产。参见例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362:255(1993)；Bruggemann等人，YearinImmunol.,7:33(1993);2006年6月20日授权的美国专利No.7，064,244;其公开内容在此通过整体引用作为参考。将人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组导致这些遗传改造的小鼠中多样化的人抗体谱的表达。Pluschke等人，JournalofImmunologicalMethods215:27-37(1998)已经描述了表达人-鼠嵌合抗体的小鼠的产生。Neuberger等人,Nature338:350-2(1989)；Lonberg等人，Int.Rev.Immunol.13(I):65-93(1995);和Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8(4):455-8(1997);1996年8月授权的美国专利No.5，545，806；1996年8月授权的美国专利No.5，545，807和1996年10月授权的美国专利No.5，569，825中已经描述了表达人免疫球蛋白多肽的小鼠的产生，其公开内容在此通过整体引用作为参考。Kuroiwa等人，NatureBiotech20(9):889-894(2002)已经描述了表达人抗体的牛的产生。PCT公开号No.WO92/03918、WO02/12437，以及美国专利No.5，814，318和5，570，429也已经描述了表达人(或人源化)免疫球蛋白转基因座(transloci)的非人转基因动物的生产以及从该转基因动物生产抗体，其公开内容在此明确地通过整体引用作为参考。所获得的人源化抗体具有对人最小的免疫原性并且适合用于人类受试者的治疗性治疗。尽管上面引述的遗传改造方法导致人免疫球蛋白多肽在遗传改造小鼠中表达，但是人免疫球蛋白的表达水平低于正常水平。这可能由于在免疫球蛋白基因座中免疫球蛋白的有效表达所需的物种特异性调控元件。如在转染的细胞系中所显示的人免疫球蛋白基因中存在的调控元件在非人动物中可能不能适当地发挥作用。已经描述了若干免疫球蛋白基因中的调控元件。尤其重要的是重链恒定区下游(3’)的增强子和轻链基因内部(intronic)的增强子。此外，其它(仍待鉴定的)控制元件可能存在于免疫球蛋白基因中。在小鼠中的研究显示了膜结合形式的免疫球蛋白分子的膜和胞质尾部分对于人CyI基因为纯合的小鼠血清中人-鼠嵌合抗体的表达水平起重要作用。因此，对于动物中异源性免疫球蛋白基因的表达，需要用通常在动物的类似位置中发现的序列来代替含有增强子元件和编码跨膜部分的外显子(Ml外显子)和胞质尾的外显子(M2外显子)的序列。这些遗传改造的动物中的人免疫球蛋白表达也可受到携带人或人源化免疫球蛋白基因座的非人的B细胞发育的影响。已经在小鼠中广泛地研究了B细胞受体(BCR)对B细胞发育的影响。然而，还并不清楚人或部分人抗体如何组合以形成功能性BCR，以及是否该BCR将有效地影响表达人(或人源化)Ig的非人B细胞在转基因动物中的发育和存活，其反过来将影响抗体的产量。附图简述图I示出人Iga多肽序列(SEQIDNO:1)与其它非人Iga序列(SEQIDNO:2-6)的氨基酸比对。图2示出人IgP多肽序列(SEQIDNO:7)与其它非人IgP序列(SEQIDNO:8-12)的氨基酸比对。发明概述一方面，本发明提供编码BCR的嵌合Iga亚基的转基因构建体，其中该嵌合Iga亚基包括非人Iga多肽序列的细胞内结构域序列和跨膜结构域序列；以及与SEQIDNO.I的人Iga的胞外结构域具有至少85%序列同一性的多肽。第二方面，本发明提供编码BCR的嵌合IgP亚基的转基因构建体，其中该嵌合Ig^亚基包括非人IgP多肽序列的细胞内结构域序列和跨膜结构域序列；以及与SEQIDNO.:7的人IgP的胞外结构域具有至少85%序列同一性的多肽。本发明的某实施方式中，非人Iga多肽序列的类型包括但不限于牛(SEQIDNO:2)uH(SEQIDNO3)IDNO4);灵长类(SEQIDNO5);*(SEQIDNO6)或其它非人序列。本发明另一个实施方式中，非人Ig^多肽序列的类型包括但不限于犬(SEQIDNO:8);大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDN0:10);鼠(SEQIDN0:11);鸡(SEQIDNO:12)或其它非人序列。第三方面，非人转基因动物包括(a)编码SEQIDNO.:1的全长人Iga亚基，或如上所限定的嵌合Iga亚基的转基因构建体，和/或(b)编码SEQIDNO.:7的全长人Ig^亚基，或如上所限定的嵌合Ig3亚基的转基因构建体，和(c)编码人(或人源化)免疫球蛋白基因座的转基因构建体，其中生成的转基因产物组合以形成人(或人源化)B细胞受体复合物。这方面的一个实施方式中，充分地降低非人转基因动物的任何内源性Ig产物的表达，和/或内源性Iga和/或内源性IgP亚基的表达。另一个实施方式中，非人转基因动物选自兔、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、鸟类、马、驴和牛。优选实施方式中，非人转基因动物是兔。第四方面，本发明还提供来自上述限定的非人转基因动物的分离的人(或人源化)免疫球蛋白，其是抗体或抗体片段。这一方面的某实施方式中，分离的人(或人源化)免疫球蛋白是多克隆或单克隆抗体，或者是抗体片段。该抗体片段可以来自多克隆或单克隆抗体。另外，可以标记该抗体或抗体片段，或者将其与毒素融合以形成免疫毒素，或者与治疗剂偶联，或者与任何本领域充分定义及使用的异源氨基酸序列融合。一些实施方式中，该抗体片段是Fe、Fv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段。第五方面，本发明提供来自上述限定的非人转基因动物的分离的B细胞，其中B细胞表达天然的人Iga亚基或嵌合Iga亚基和/或表达天然的人Ig3亚基或嵌合Ig@亚基，此外还表达人(或人源化)免疫球蛋白基因座。某些实施方式中，该B细胞是永生化的，且在优选的实施方式中其源自兔。第六方面，本发明提供包含如上所述的抗体或抗体片段的抗体制剂。第七方面，本发明提供包含与可药用成分混合的如上所述抗体或抗体片段的药物组合物。该药物组合物可以包含单克隆抗体或其片段，或者包含一或多种多克隆抗体或其片段。第八方面，本发明提供在非人动物中生产人(或人源化)抗体的方法，包括(a)将编码天然人Iga亚基或嵌合Iga亚基的转基因构建体，和/或编码天然的人Ig3亚基或嵌合IgP亚基的转基因构建体导入非人动物中并在其中表达；和6)将编码人(或人源化)免疫球蛋白基因座的转基因构建体导入非人动物中并在其中表达；(C)使该动物接受抗原刺激；和((1)从该动物中分离人(或人源化)抗体。该方面的某实施方式中，抗体是多克隆或单克隆抗体，或是多克隆或单克隆抗体的片段。此外，该抗体或抗体片段可以被标记，或者可以与毒素融合以形成免疫毒素，或者与治疗剂偶联，或者可以与任何异源性氨基酸序列融合。第九方面，本发明提供生产表达人(或人源化)抗体的非人动物的方法，包括(a)将编码天然人Iga亚基或嵌合Iga亚基的转基因构建体，和/或编码天然人Ig3亚基或嵌合IgP亚基的转基因构建体导入非人动物的B细胞中并在其中表达jP(b)将编码人(或人源化)免疫球蛋白基因座的转基因构建体导入非人动物中并在其中表达；其中，生成的转基因产物组合以形成人(或人源化)B细胞受体复合物。一个实施方式中，表达人(或人源化)抗体的非人动物是通过基因转换和/或体细胞高变而产生抗体多样性的动物。优选实施方式中，该动物是兔。发明详述定义除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的常规理解相同的含义。Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第二版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994),以及March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure,第四版，JohnWiley&Sons(NewYork,NY1992)为本领域技术人员提供了许多本申请所使用术语的总体指导。本领域技术人员将认识到许多可用于实现本发明的，与本文所述那些相似或等效的方法和材料。事实上，本发明并不限于所述方法和材料。出于本发明的目的，在下面限定下述术语。本文定义的“转基因构建体或表达构建体”指DNA分子，其含有至少一种目的转基因的编码序列以及该目的转基因在非人转基因动物的靶细胞中时间性、细胞特异性和/或增强的表达所需的适当的调控序列。“B细胞”定义为能够在其生命周期的某阶段进行免疫球蛋白基因片段重排并表达免疫球蛋白基因的B谱系细胞。这些细胞包括但不限于，早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞等。本文定义的“B细胞受体(BCR)复合物”指B细胞上表达的多亚基免疫识别受体，其包括下述亚基抗原(Ag)受体、膜结合的免疫球蛋白(mlg)、Iga亚基和Ig3亚基。Wienands等人，EMBOJ.9(2):449-455(1990)，Venkitaraman等人，Nature352:777-781(1991),Herren等人，ImmunologicRes.26(1-3):35-43(2002)已经描述了B细胞受体、其组分及其与五类免疫球蛋白的缔合。此外，还有若干已经被克隆并测序的BCR相关蛋白质(BAP)，但它们的功能仍未知，且其作为BCR组分的作用尚存疑问。Adachi等人，EMBOJ15(7):1534-1541(1996)和Schamel等人，PNAS100(17):9861-9866(2003)描述了BCR相关蛋白质。“天然Iga或IgP亚基”指天然存在的Iga或IgP多肽序列，其包括在给定动物类型或相关物种中发现的Iga或Ig3亚基的天然存在的等位基因。这也指“全长Iga或IgP序列”。Flaswinkel等人，Immunogenetics36(4):266-69(1992)克隆了人Iga多肽序列，其检索号为M74721(图1，SEQIDNO:1)。Mueller等人，Eur.J.Biochem.22，1621-25(1992)克隆了人IgP多肽序列，其检索号为M80461(图2，SEQIDNO:7)。术语“人(或人源化)”指完全的人序列或含有一或多条人序列的序列。因此，如本文所使用，该术语包括人和人源化序列。“嵌合Iga”亚基或蛋白质或多肽指来自诸如大鼠、小鼠、人、兔、鸡等的动物的Iga多肽序列，其中，Iga多肽的一或多个结构域由来自另一动物或物种的不同Iga多肽的相应结构域所代替，或者由来自不同等位基因的Iga类型或来自具有一或多个氨基酸取代的变体Iga序列或来自与给定Iga序列的相应结构域具有至少85%序列同一性的变体Iga序列的相应结构域所代替。术语“嵌合Iga”和“人(或人源化)Iga”在整个说明书中互换使用。图I也定义了来自一些非人动物的Iga多肽序列(SEQIDN0:2_6)。“嵌合IgP”亚基或蛋白质或多肽指来自诸如大鼠、小鼠、人、兔、鸡等动物的Ig^多肽序列，其中，IgP多肽的一或多个结构域由来自另一动物或物种的不同IgP多肽的相应结构域所代替，或者由来自不同等位基因的Ig3类型或来自具有一或多个氨基酸取代的变体IgP序列或来自与给定IgP序列的相应结构域具有至少85%序列同一丨丨生的变体Ig^序列的相应结构域所代替。术语“嵌合IgP”和“人(或人源化)IgP”在整个说明书中互换使用。图2也定义了来自一些非人动物的IgP多肽序列(SEQIDN0:8-12)。“胞内多肽或结构域”或“胞质尾”指给定膜结合蛋白质或亚基的存在于细胞内的那部分多肽序列。通常，蛋白质的胞内结构域负责信号转导。Iga或IgP亚基的“胞内结构域序列”指Iga或IgP多肽通常存在于细胞内的多肽序列或其片段。Iga或IgP亚基的“跨膜结构域序列”指Iga或IgP多肽跨越生物膜(例如质膜、细胞器膜或脂双层)的多肽序列或其片段。本文定义的“跨膜结构域序列”包括天然存在的跨膜多肽，或者可以是非天然存在的共有序列，或它们的片段。“胞外多肽或结构域”指给定膜结合蛋白质或亚基通常存在于细胞外的那部分多肽序列。“Iga或IgP的胞外结构域”指Iga或IgP多肽存在于细胞外的多肽序列或其片段。本文所用的术语“人(或人源化)免疫球蛋白基因座”包括人免疫球蛋白或Ig基因座或其片段的天然存在的序列，人Ig基因座或其片段的天然存在的序列的简并形式，以及编码与由人Ig基因座或其片段天然存在的序列所编码的多肽基本上相同的多肽序列的合成序列。具体实施方式中，人Ig基因片段赋予免疫球蛋白分子在人中的非免疫原性。此处，术语“人(或人源化)或人源化免疫球蛋白(Ig)重和/或轻链基因座”或“人或人(或人源化)免疫球蛋白或Ig基因座”可互换使用。本文所用的术语“人(或人源化)B细胞受体(BCR)复合物”指这样的多亚基BCR复合物，其中Iga亚基为天然的人Iga亚基或具有如上所述的人或人源化Iga序列的嵌合Iga亚基；和/或另外，其中IgP亚基为天然的人IgP亚基或具有如上所述的人或人源化IgP序列的嵌合IgP亚基；以及另外，膜结合免疫球蛋白(mlg)是如上所述的人(或人源化)免疫球蛋白。本文所用的术语“人抗体”和“人免疫球蛋白”指包括完整的人序列的抗体及免疫球蛋白分子。本文所用的术语“人源化抗体”和“人源化免疫球蛋白”指包括人免疫球蛋白多肽序列(或由人免疫球蛋白基因片段编码的多肽序列)的至少一部分的免疫球蛋白分子。本发明的人源化免疫球蛋白分子可以分离自经遗传改造以产生人源化免疫球蛋白分子的转基因非人动物。与由动物所制备的或由源自动物的细胞所制备的非人源化免疫球蛋白分子相比，此类人源化免疫球蛋白分子具有对灵长类动物，尤其是人的较小免疫原性。人源化免疫球蛋白或抗体包括通过在基因转换动物中的基因转换和体细胞高变而进一步多样化的免疫球蛋白(Ig)和抗体。此类人源化Ig或抗体并非“人源”的，这是由于它们并非由人类天然产生(因为人类不通过基因转换而多样化其抗体谱)，但是人源化Ig或抗体因为它们在其结构中具有人Ig序列而对于人是非免疫原性的。术语“充分地降低”内源Ig产物，和/或Iga和/或IgP亚基表达指转基因动物中内源Ig单独生产的程度，或者另外还有内源Iga和/或IgP表达的程度降低优选至少约30%-49%，或更优选至少约50%-79%，或甚至更优选至少约80_89%，或最优选约90_100%。术语“单克隆抗体”用于指由单个B细胞克隆合成的抗体分子。术语“多克隆抗体”指由B细胞群合成的抗体分子群。具有进行基因重排和基因转换能力的“免疫球蛋白(Ig)基因座”在本文也称为“功能性”Ig基因座，且具有由功能性Ig基因座产生的多样性的抗体在本文也称为“功能性”抗体或“功能性”的抗体谱。本文所用的术语“非人(转基因)动物”包括但不限于哺乳动物，例如非人灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)、非啮齿类哺乳动物，例如兔、猪、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴，以及鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅等)。本文使用的术语“非灵长类动物”包括但不限于除灵长类动物以外的哺乳动物，包括但不限于上面具体列举的哺乳动物。迸述本发明至少部分基于这样的认识，即非人转基因动物中的人或人源化免疫球蛋白(包括免疫球蛋白链)的生产可以通过在该动物的B细胞中共表达人或人源化Iga和/或Ig^而显著增加。据认为转基因动物的B细胞中包括人或人源化Iga和/或IgP重组并提高B细胞受体蛋白质之间的相互作用，从而增强携带该转基因的B细胞的抗原识别、B细胞发育和存活。在已经携带了人或人源化Iga和/或IgP转基因的转基因动物中共表达人源化免疫球蛋白将极大地提高人源化免疫球蛋白的生产。另外还希望针对优选内源性Ig以及内源性Iga和/或IgP都敲除的背景，表达人或人源化Iga和/或IgP转基因和人源化免疫球蛋白转基因。B细胞受体及其相关蛋白质B细胞受体由膜结合免疫球蛋白和信号转导异源二聚体所组成，该异源二聚体由两个称作Iga和IgP的二硫键连接的糖蛋白所组成。此外，已经描述了BCR相关蛋白质(BAP)0BCR表达对于B细胞发育、选择和存活很重要。这些过程依赖于经过Iga/Ig^异源二聚体的BCR信号。这些分子的胞质结构域携带含有若干组装成所谓的免疫受体酪氨酸活化模体(ITAM)的酪氨酸残基的序列模体，其在BCR引发下磷酸化。基因靶向实验显示了Iga/IgP异源二聚体的胞质结构域对于B细胞发育是至关重要的。由Iga/IgP异源二聚体转导的信号参与发育中的B细胞的阳性和阴性筛选。膜结合免疫球蛋白(mlg)分子由两条重链(形成同源二聚体)和两条轻链(每条共价结合重链之一)组成。重链的N-末端携带VH结构域，取决于同种型，该结构域后为4(IgM,IgE),3(IgG,IgA)或2(IgD)个C-结构域。通过VH:VL对的高变区形成抗原结合位点。因此，每个mlg分子具有两个抗原结合位点。mlgM分子与分泌型IgM的不同之处在于分泌型IgM形成具有10个潜在抗原结合位点的五聚体。在分泌的US链的C-末端部分中的序列控制五聚化。膜结合Pm链没有这一由22个氨基酸组成的部分，取而代之，其携带由Ml和M2外显子编码的48个C末端氨基酸。序列的Pm特异性部分是整个IgM分子在进化上最保守的部分。其在小鼠、兔和人HlIgM之间几乎相同，且即使将小鼠与鲨鱼的HlIgM相比，该保守性也仍很明显。当将小鼠mlgM的C末端序列与其它mlg同种型的C末端序列相比时，氨基酸的保守性也很明显。这一发现提供了保守的跨膜氨基酸在H链同源二聚体中彼此相互作用或与Iga和IgP亚基相互作用的证据。Iga和Ig3都具有22个氨基酸跨膜片段，其后为含有若干酪氨酸残基的约40-70个氨基酸的C末端胞质尾。在N末端，两种蛋白质都携带前导肽，其后为含半胱氨酸残基、色氨酸、以及若干在Ig超家族蛋白质中发现的其它保守氨基酸的胞外结构域。这表明Iga和IgP亚基的胞外部分形成类Ig结构域。除了形成结构域内二硫键的半胱氨酸，Iga和Ig3序列还含有其它可能在Iga和Ig3亚基之间形成链间二硫键的半胱氨酸。在小鼠和人Iga序列之间的比较显示所有对于Ig结构域和链间键合的信息重要的残基在两物种的Iga之间是保守的。然而，这一比较也显示胞外部分中的序列保守性只达到约56%，而跨膜和胞质尾分别显示100%和87%的保守性。后者反映了分子C末端部分内的残基的重要性。mlgM分子与Iga/IgP异源二聚体的组装对于mlgM的表面表达是必要的。可以通过使Pm链的跨膜部分突变而消除这一需要。例如，用H-2KK分子的跨膜部分代替Pm链的跨膜区导致mlgM的表面表达不依赖于Iga/Ig0。这些数据表明iim链和Iga/Ig^异源二聚体之间的特异相互作用需要Pm跨膜区。此外，B细胞具有防止跨膜蛋白质复合物的单个或不完全组装的组分转运出ER的控制机制。尽管BCR的跨膜部分可能是形成BCR复合物所需的最重要结构，但也提示Iga和Ig^的胞外Ig结构域在mlgM分子的结合上起作用。例如，在不表达小鼠Iga的小鼠细胞系J558LPm中，用Iga转基因进行转染恢复了mlgM的表面表达。引人注意地，用小鼠Iga基因进行转染导致比用人Iga基因进行转染的表达高10倍。此外，这一数据提示Iga的胞外结构域可与mlgM的胞外部分相互作用。另一方面，带有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠确实表达人免疫球蛋白。转基因非人动物中B细胞发育、B细胞存活或人(或人源化)mlgM的表达是否受到携带人(或人源化)mlgM基因的B细胞中人Iga和/或人Ig^的共表达的影响仍旧不清楚。此外，已经克隆并测序了若干BCR相关蛋白质(BAP)，但其功能仍旧未知。尽管这些蛋白质与BCR相关，但它们作为BCR组分的作用尚存疑问。然而，BAP的普遍表达以及强的进化保守性提示它们一定起重要作用，可能在普遍的细胞过程中发挥作用且已提出了若干假设功能。例如，这些蛋白质可参与BCR偶联到细胞骨架，或者参与控制囊泡转运。最后，提出了它们作为分子伴侣起作用，帮助跨膜蛋白质的折叠和组装。相关文献Wienands等人，EMBOJ.9(2)449~455(1990),Venkitaraman等人，Nature352777-781(1991)，Herren等人，ImmunologicRes.26(1-3):35-43(2002)描述了B细胞受体、其组分以及其与五类免疫球蛋白的相关性。Adachi等人，EMBOJ15(7):1534-1541(1996)和Schamel等人，PNAS100(17)=9861-9866(2003)描述了BCR缔合的蛋白质。Reth,AnnualReviewsofImmunology10:97-121(1992),Kraus等人，Cell117(6):787-800(2004),Sayegh等人，ImmunologicalReviews175:187-200(2000),Reichlin等人，JournalofExperimentalMedicine193(1):13-23(2001),Pike等人，JournalofImmunology172:2210-2218(2004),Pelanda等人，JournalofImmunology169:865-872(2002)描述了B细胞受体对B细胞发育和存活的影响。Cronin等人，J.Immunology161252-259(1998)，Muller等人，PNAS97(15):8451-8454(2000)，Cragg等人，Blood1003068-3076(2002)，Wang等人，J.Immunology171:6381-6388(2003)，Fuentes-Panand等人，J.Immunology174:1245-1252(2005)描述了BCR信号调控及其对B细胞发育及凋亡的影响。上面引用文献的公开内容在此通过整体引用作为参考。因此，本发明涉及用于在B细胞中，尤其是在能够产生多样化的人(或人源化)抗体谱的转基因动物的B细胞中共表达人(或人源化)Iga和/或人(或人源化)IgP以提高在该转基因动物中B细胞存活的方法。动物的类型包括较大型非人动物，像兔、鸟、鸡、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴。当这些动物表达Ig转基因座，由于其较大的体型，其抗体产量也将是较大的。因此，本发明旨在产生较大的建立者动物，其通过增强的B细胞发育和存活生产较高量的人(或人源化)免疫球蛋白。因此，本发明涉及编码全长人Iga和IgP多肽的转基因构建体，或编码嵌合或人源化Iga和嵌合或人源化IgP多肽的嵌合转基因构建体，这将在下面进一步限定。“编码人Iga和/或IgP多肽的转基因或转基因构建体”分别指天然的、全长人Iga和/或Ig0DNA序列，以及编码Iga或Ig0的功能性等效多肽的任何变体，密码子优化的DNA序列，但其根据密码子的简并性而具有不同的DNA序列。这一概念将在下面进一步详细讨论。SEQIDN01(图I)定义了天然的、全长人Iga多肽序列。SEQIDNO7(图I)定义了天然的、全长人IgP多肽序列。本文还涉及“编码嵌合或人(或人源化)Iga的核酸分子或转基因或转基因构建体”。“嵌合Iga”亚基或蛋白质或多肽指来自动物(例如大鼠、小鼠、人、兔、鸡等)的Iga多肽序列，其中Iga多肽的一或多个结构域由来自另一动物或物种的不同Iga多肽的相应结构域所替换，或由来自不同等位的Iga类型、或来自具有一或多个氨基酸取代的变体Iga序列、或来自与给定Iga序列的相应结构域具有至少85%序列同一丨丨生的变体Iga序列的相应结构域所替换。术语“嵌合Iga”和“人(或人源化)Iga”在本说明书通篇中互换使用。从其可以获得胞内和/或跨膜结构域序列的非人Iga多肽序列例如包括但不限于牛(SEQIDNO:2);鼠(SEQIDNO:3);犬(SEQIDNO:4);灵长类(SEQIDNO:5);兔(SEQIDNO:6)或其它非人序列。本文还涉及“编码嵌合或人(或人源化)Ig3的核酸分子或转基因或转基因构建体”。“嵌合IgP”亚基或蛋白质或多肽指来自动物(例如大鼠、小鼠、人、兔、鸡等)的Ig^多肽序列，其中IgP多肽的一或多个结构域由来自另一动物或物种的不同IgP多肽的相应结构域所替换，或由来自不同等位的Ig3类型、或来自具有一或多个氨基酸取代的变体Ig^序列、或来自与给定IgP序列的相应结构域具有至少85%序列同一丨丨生的变体Ig@序列的相应结构域所替换。术语“嵌合IgP”和“人(或人源化)IgP”在本说明书通篇中互换使用。从其可以获得胞内和/或跨膜结构域序列的非人IgP多肽序列例如包括但不限于犬(SEQIDNO:8);大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDN0:10);鼠(SEQIDN0:11);鸡(SEQIDNO:12)或其它非人序列。因此，简言之，嵌合Iga或IgP转基因由I)分别编码人Iga或IgP的胞外结构域的核苷酸序列和2)分别编码来自宿主转基因动物的Iga或IgP的跨膜和胞内结构域的核苷酸序列所组成。再一方面，本发明还涉及编码人(或人源化)免疫球蛋白或基因座的转基因构建体，如之前递交的于2003年I月23日公开的美国公开No.2003-0017534,以及于2006年2月2日公开的美国公开No.2006-0026696的美国申请所描述的，所述申请的公开内容通过整体引用作为参考。其中公开的转基因动物、其产生的B细胞或细胞系，以及相关方法也形成本发明的一方面。上述提及方面的替代的方法中，本发明还涉及编码人(或人源化)免疫球蛋白或Ig链或基因座的转基因构建体，如1996年8月授权的美国专利No.5，545，806；1996年8月授权的美国专利No.5，545，807以及1996年10月授权的美国专利No.5，569，825，2006年6月20日授权的美国专利No.7,064,244;或PCT公开No.WO92/03918,WO02/12437，和美国专利No.5,814,318及5，570,429中所述；也参见Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA,90:2551(1993);Jakobovits等人，Nature,362:255(1993);Bruggemann等人，YearinImmunol.,7:33(1993);Pluschke等人，JournalofImmunologicalMethods215:27-37(1998)；Neuberger等人，Nature338:350-2(1989)；Lonberg等人，Int.Rev.Immunol.13(I):65-93(1995);和Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8(4):455-8(1997)；以及Kuroiwa等人,NatureBiotech20(9):889-894(2002),其公开内容在此通过整体引用作为参考。其中公开的转基因动物、其产生的B细胞或细胞系，以及相关方法也形成本发明的一方面。可通过包括前核的微注射、转染、核转移克隆、精子介导的基因转移、睾丸介导的基因转移等多种技术将转基因或转基因构建体导入动物基因组。一个实施方式中，通过免疫特异性启动子，优选B细胞特异性启动子在转基因动物的B细胞中优选表达人Iga和/或IgP基因。此人Iga或IgP基因的表达优选仅在B细胞中发生，导致非人转基因动物的增强的B细胞发育和存活。“B细胞特异性启动子”指任何B细胞特异性基因的启动子/增强子序列，和/或其变体或基因改造的部分，它们通常控制B细胞中表达的基因的表达，其实例包括但不限于⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、⑶23、⑶24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b(也称作829或化3)、mb_l(也称作Iga)、酪氨酸激酶blk，VpreB，免疫球蛋白重链，免疫球蛋白K轻链，免疫球蛋白\轻链，免疫球蛋白J链等的启动子/增强子。优选实施方式中，⑶79a、⑶79b或K轻链启动子/增强子驱动人Iga和/或IgP基因的B细胞特异性表达。又一个实施方式中，包括编码人Iga和/或IgP基因的核酸分子的转基因构建体与包括外源免疫球蛋白或免疫球蛋白(Ig)链转基因基因座的转基因构建体共表达。该实施方式中，Ig转基因基因座和人Iga和/或IgP转基因都可存在于相同的转基因表达载体或两种不同的转基因表达载体中。后者中，两种转基因表达载体可同时或按顺序导入非人转基因动物中。根据本发明，本文包括Iga或IgP的人全长或只是胞外结构域的变体。这指允许遗传密码子简并性的核酸序列，编码包括功能性等效残基的氨基酸取代和/或增强胞外结构域的功能性的突变的多肽序列的核酸序列。“胞外结构域的功能性”包括但不限于形成能够进行信号转导的BCR。对于允许遗传密码子简并性，本发明包括与人Iga和人IgP的胞外多肽序列具有至少约70%、更通常约80-85%，优选至少约90%和最优选约95%序列同一性的序列。术语生物功能等效性是本领域充分知晓的且进一步在本文中详细定义。因此，在氨基酸水平具有约70%至约80%;或更优选约81%至约90%;或甚至更优选约91%至约99%同一性的序列，只要保留了蛋白质的生物活性，就被认为是与人Iga和IgP功能等效的。本文使用的术语功能等效的密码子指编码相同氨基酸的密码子(例如精氨酸或丝氨酸的六种密码子)，且也指编码生物学等效的氨基酸的密码子。下面是基于改变蛋白质的氨基酸以产生等效的，或者甚至是改良的第二代分子的讨论。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可由其它氨基酸取代而不明显丧失与诸如抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点的结构的相互结合能力。由于正是蛋白质的相互作用能力和性质限定该蛋白质的生物功能性活性，可以在蛋白质序列及在其实质的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，然而还产生具有类似特性的蛋白质。因此考虑可对基因的DNA序列进行多种改变而不明显丧失其生物学利用性或活性，如下所述。进行该改变时，也可考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathicindex)。氨基酸的亲水性指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性是本领域普遍知晓的(Kyte&Doolittle,1982)。氨基酸的相关亲水特性对生成的蛋白质的二级结构起作用是可接受的，其反过来限定蛋白质与其它分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。本领域还知晓可以基于亲水性而有效地进行类似氨基酸的取代。引入本文作为参考的美国专利No.4，554，101说明了蛋白质的最大局部平均亲水性(受其相邻氨基酸的亲水性所控制)与该蛋白质的生物特性相关。如在美国专利No.4，554，101中所详述的将下面的亲水值指定给氨基酸残基精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+-.I);谷氨酸(+3.0.+'I);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5.+'I);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解氨基酸可以由具有相似亲水值的另一种氨基酸所取代而仍旧产生生物学等效的及免疫学等效的蛋白质。此类改变中，优选亲水值在+-.2之内，尤其优选在+_.I之内，甚至尤其更优选在+_.0.5之内的氨基酸的取代。如本文所概述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑多种前述特性的示例性取代是本领域技术人员所公知的且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。制备本发明多肽的另一个实施方式是使用肽模拟物。模拟物是模拟蛋白质二级结构组件的含肽分子(Johnson1993)。使用肽模拟物的基本原理在于存在的蛋白质的肽主链主要以促进分子相互作用(例如抗体和抗原的那些相互作用)的方式定向氨基酸侧链。期望肽模拟物允许类似于天然分子的相互作用。这些原理可与上面概述的原理联合用于遗传改造具有人Iga或Ig3的多种天然特征且特性改变并改良的第二代分子。因此，多种编码人Iga或IgP以及人Iga或IgP的功能性等效多肽的核酸序列变体在本发明中是有用的。含有目的基因的转基因载体可导入受体细胞然后通过随机整合或靶向整合而整合到受体细胞的基因组中。对于随机整合，可以通过标准转基因技术将含有人Iga或IgP的转基因载体导入动物受体细胞中。例如，转基因载体可以直接注射到受精卵母细胞的前核中。也可以在卵母细胞受精前通过转基因载体与精子共孵育而导入转基因载体。可以由受精的卵母细胞发育转基因动物。另一种导入转基因载体的方法是通过转染胚胎干细胞并随后将该经遗传修饰的胚胎干细胞注射到发育胚中。或者，可以将转基因载体(裸露的或与促进试剂组合)直接注射到发育的胚中。最终，由该胚产生嵌合转基因动物，其含有整合在该转基因动物的至少一些体细胞基因组中的人(或人源化)Ig转基因。具体实施方式中，含有人Iga或IgP的转基因随机整合到源自内源性Iga或Ig^受损表达的动物品系的受体细胞(例如受精卵母细胞或发育胚)的基因组中。该动物品系的应用允许从人(或人源化)转基因Ig基因座上优先表达免疫球蛋白分子。或者，具有人(或人源化)Iga和/或IgP转基因的转基因动物可以与内源性Iga和/或IgP受损表达的动物品系交配。可以获得受损的Iga和/或IgP及人(或人源化)Iga和/或Ig^的纯合后代。或者，可使用反义技术、细胞内抗Iga和/或IgP表达等来抑制或降低内源性Iga和/或IgP的表达。一个实施方式中，选择用于敲除宿主动物Iga和/或Ig^的内源性生产的方法是RNA干扰(RNAi)法，其将双链RNA(dsRNA)或更优选，短的或小干扰RNA双链(SiRNA)导入具有胞内宿主动物Iga和/或IgP核酸序列的B细胞中。这可以使用市售可得的试剂盒而实现，包括但不限于来自Invitrogen公司的BlockiT或StealthRNA试剂盒。对于靶向整合，可以将转基因载体导入适合的动物受体细胞，例如胚胎干细胞或已经分化的体细胞。此后，可以通过标准方法(参见例如，Kuroiwa等人,NatureGenetics,2004年6月6日)选择通过同源重组而整合到动物基因组且代替了相应的内源基因的转基因的细胞。经选择的细胞然后可与去核的核转移单元细胞(例如卵母细胞或胚胎干细胞)融合，其是全能的且能够形成功能性新生儿。按照成熟的常规技术进行融合。也可以通过使用注射移液管的显微手术进行卵母细胞的核去除及核转移(参见例如，Wakayama等人,Nature(1998)394:369)。然后在适合的培养基中培养生成的卵细胞并将其转移到同步化的受体中以用于产生转基因动物。或者，可以将经选择的遗传修饰的细胞注射到发育的胚中，该胚随后发育成嵌合动物。此外，根据本发明，可以通过下述方法制造能够生产人(或人源化)Iga和/或Ig^的转基因动物将本文上述的一或多种重组载体导入受体细胞，所述载体之一携带人Iga和/或IgP基因片段，该片段相连于与内源性Iga和/或IgP基因片段的侧翼序列同源的5’和3’侧翼序列，然后选择通过同源重组使其内源性Iga和/或IgP基因片段由人Iga和/或IgP基因片段代替的细胞，并从所选的遗传修饰的受体细胞得到动物。与转基因载体的靶向插入类似，适合在本方法中用作受体细胞的细胞包括胚胎干细胞或已经分化的体细胞。可以通过诸如转染的任何可行方法将携带人Iga和/或Ige基因片段的重组载体导入该受体细胞。此后，可以利用标准方法选择通过同源重组由人Iga和/或IgP基因片段代替了相应的内源性Iga和/或IgP基因片段的细胞。这些遗传修饰的细胞可以在用于克隆转基因动物的核转移过程中用作核供体细胞。或者，可以将经选择的遗传修饰的胚胎干细胞注射到发育胚中，该胚随后发育成嵌合动物。具体实施方式中，可通过直接将转基因注射到胚中或间接地将它们注射到受孕母体或产蛋母鸡中而将本发明的转基因构建体导入胚胎期的转基因动物中。由任意前述方法生产的转基因动物形成本发明另一个实施方式。该转基因动物在其基因组中至少具有一个(即一或多个)人(或人源化)Iga和/或IgP基因，可以由该基因生产功能性人(或人源化)Iga和/或IgP蛋白质。此外，优选在针对于内源性Ig以及内源性Iga和/或IgP敲除的任一或更优选两者的敲除背景下，表达本发明的转基因构建体，即人或人源化Iga和/或IgP转基因和人源化免疫球蛋白转基因。从而，本发明的转基因动物能够在具有充分地降低内源性Ig表达和更优选也充分地降低内源性Iga和/或Ig3的背景下，重排人(或人源化)Ig基因座并有效表达功能性人(或人源化)抗体谱。这一上下文中，“充分地”指仅仅是内源性Ig表达或还有内源性Iga和/或IgP表达的内源性生产的程度降低优选至少约30-49%，或更优选至少约50-79%，或甚至更优选至少约80-89%，或最优选约90_100%。本发明提供表达一或多种人(或人源化)Ig基因座和人(或人源化)Igd和/或Ig^的转基因兔，其能够使人(或人源化)Ig基因座进行重排和基因转换，并且表达功能性人(或人源化)抗体谱。优选这些兔还不产生大量的功能性内源兔免疫球蛋白或功能性内源兔Iga和/或Ig^。本发明还提供其它表达一或多种人(或人源化)Ig基因座和人(或人源化)Iga和/或IgP的大型转基因动物，包括但不限于鸟类、啮齿类和家畜像牛、猪、绵羊、山羊、驴、马等。而且优选，这些动物还不产生大量的功能性内源免疫球蛋白或功能性内源Iga和/或Ig^。从而，这些转基因动物能够使人(或人源化)Ig基因座重排并以提高的产量有效表达功能性人(或人源化)抗体谱。本发明还涉及分离自上述不同类型的转基因动物的B细胞，其表达人(或人源化)Iga和/或Ig3基因和人(或人源化)免疫球蛋白基因座。此外，可以使用本领域熟练技术人员公知且使用的常规方法，包括但不限于使用病毒转化等来使此类B细胞永生化。抗原免疫导致在所述转基因动物中产生抗相同抗原的人(或人源化)抗体。尽管本发明的优选实施方式涉及具有人(或人源化)Ig基因座的转基因动物，应理解具有灵长类动物源化的Ig基因座和灵长类动物源化的多克隆抗血清的转基因动物也在本发明的精神内。与人(或人源化)多克隆抗血清组成类似，灵长类动物源化的多克隆抗血清组成可能在人类个体中具有降低的免疫原性。一旦制造了能够产生多样化的人(或人源化)免疫球蛋白分子的转基因非人动物(如下进一步提出)，可以通过用抗原免疫该动物而容易地获得抗该抗原的人(或人源化)免疫球蛋白和人(或人源化)抗体制剂。多种抗原可以用于免疫转基因宿主动物。该抗原包括微生物，例如活的、减毒的或死的病毒和单细胞生物(例如细菌和真菌)、微生物片段，或分离自该微生物的抗原分子。用于免疫动物的优选细菌抗原包括来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的纯化的抗原，例如5型和8型荚膜多糖、毒力因子的重组型，例如a-毒素、粘附素结合蛋白、胶原结合蛋白和纤连蛋白结合蛋白。优选的细菌抗原还包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单抱菌(Pseudomonasaeruginosa)、肠球菌(enterococcus)、肠杆菌属(enterobacter)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的减毒型或来自这些细菌细胞的培养物上清液。可以用于免疫的其它细菌抗原包括来自铜绿假单孢菌、肠球菌、肠杆菌属和肺炎克雷伯氏菌的纯化的脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖和/或外膜蛋白质的重组型、纤连蛋白连接蛋白，内毒素和外毒素。用于制备抗真菌抗体的优选抗原包括真菌的减毒型或其外膜蛋白质，该真菌包括但不限于白假丝酵母(Candidaalbicans)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)。用于免疫以产生抗病毒抗体的优选抗原包括病毒的被膜蛋白质和减毒型，该病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(尤其是F-蛋白)，丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。可以通过用分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系的肿瘤相关抗原免疫转基因动物而产生用于治疗癌症的治疗性抗体，肿瘤相关抗原包括但不限于Her-2-neu抗原(其抗体用于治疗乳腺癌);⑶19、⑶20、⑶22和⑶53抗原(其抗体用于治疗B细胞淋巴瘤)，(3)前列腺特异的膜抗原(PMSA)(其抗体用于治疗前列腺癌)，和17-1A分子(其抗体用于治疗结肠癌)。可以利用或不利用佐剂，通过任何便捷的方式将抗原施用于转基因宿主动物，并且可以按照预定的安排将抗原施用于转基因宿主动物。免疫后，可以将来自经免疫的转基因动物的血清或乳液分级分离用于纯化抗原特异的药物级多克隆抗体。转基因鸟类的情况下，也可以通过分级分离卵黄而制备抗体。可通过色谱(亲和、离子交换、凝胶过滤等)，用诸如硫酸铵的盐，诸如乙醇的有机溶剂或诸如聚乙二醇的聚合物选择性沉淀来获得浓缩的、纯化的免疫球蛋白级分。经分级分离的人(或人源化)抗体可溶解或稀释在适于人静脉内给药的无毒性、无致热原的介质中，例如灭菌的缓冲生理盐水。用于给药的抗体制剂通常特征为具有浓度为0.I至100mg/ml,更通常I至IOmg/ml的免疫球蛋白。抗体制剂可含有多种同种型的免疫球蛋白。或者，抗体制剂可仅含有一种同种型的抗体，或若干经选择的同种型的抗体。为了制造人(或人源化)单克隆抗体，从已排除其表达动物内源性免疫球蛋白的B细胞的已免疫转基因动物中分离脾细胞。分离的脾细胞或者用于与转化的细胞系进行细胞融合以生产杂交瘤，或通过标准分子生物学技术克隆编码抗体的cDNA并在转染的细胞中表达。制造多克隆抗体的方法在本领域是成熟的。参见例如，欧洲专利申请0583980A1(“MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits，，)、美国专利No.4，977，081(“StableRabbit-mouseHybridomasAndSecretionProductsThereof”)、W097/16537(“StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereof”)和EP049105761(^HybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinG”)，其公开内容在此通过引用作为参考。Andris-Widhopf等人，“Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay，，，JImmunolMethods242:159(2000)和Burton,D.R.,“Phagedisplay”，Immunotechnology1:87(1995)描述了由克隆的cDNA分子体外生产单克隆抗体，其公开内容在此通过引用作为参考。多数情况下，抗体制剂由没有(例如通过化学品或酶)修饰的免疫球蛋白组成，即由动物所制备的没有额外修饰的人(或人源化)抗体组成。或者，可对免疫球蛋白级分进行处理，例如酶消化(例如用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶、糖苷酶、核酶等)、加热等和/或进一步分级分离以产生“抗体片段”。本发明还包括药物组合物或抗体制剂,其包括由上面限定的方法所获得的抗体或其片段。本文所用的术语“可药用成分”或“制剂”旨在涵盖包括特定量的所主张的活性成分，即人(或人源化)抗体或抗体片段，以及任何直接或间接由该特定量的特定活性成分的组合得到的产品。该术语旨在涵盖包括该活性成分和组成载体的惰性成分的产品，以及直接或间接从任何两种或更多种成分的组合、络合或聚集得到的、或由一种或多种成分的分解得到的、或由一种或多种成分的反应或相互作用的其他类型得到的产品。因此，本发明的“药物组合物”涵盖由混合任何本发明的活性化合物和可药用载体而制造的任何组合物。术语“给药”和/或“给予”化合物应理解为指向需要治疗的个体提供任何配方的任何本发明的活性化合物。用于给予本发明化合物的药物组合物可方便地以剂量单位形式存在且可通过药学领域公知的方法制备。适合使用的方法和载体是现有技术中充分描述的那些，且例如，见Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro等人编，第20版(2000),当然，免疫学领域的熟练技术人员将容易地理解其它方法是已知的且适于制备本发明的组合物。所有的方法包括使活性成分与组成一或多种辅助成分的载体组合的步骤。一般地，通过使活性成分均一，并立即与液体载体或细粉碎的固体载体或与两者组合，然后(必要时)将该产品成型为期望的制剂而制备药物组合物。该药物组合物中包括上面讨论过的，足以对疾病的病程或症状产生期望效果的有效量的活性成分。此外，美国专利No.6，706，289描述了用于控释、缓释抗体分子的配方，其方法在此通过引用作为参考。因此，转基因构建体、包括该转基因构建体的载体以及使用上面描述的方法产生的转基因动物都是本发明的实施方式。通过下述实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此。实施例I、用人Iga和Ig|3转染兔B细胞系为了证明人Iga和IgP对人mlgM在兔B细胞中表达的影响，用编码人Iga或Ig^或人mlgM的表达载体转染该细胞。将人Iga和人IgP和人mlgM编码基因克隆入表达载体中。用该表达载体转染永生化的兔B细胞系并将该细胞在含有用于筛选稳定转染体的新霉素的培养基中培养。使用对人mlgM和人Iga和/或IgP特异的抗体，通过流式细胞术分析抗性细胞。编码人mlgM的表达载体对兔B细胞的转染导致人mlgM的低细胞表面表达。人Iga和/或IgP的共转染导致人mlgM的高细胞表面表达。这证明人Iga和/或IgP对于人(或人源化)的或嵌合mlgM的高细胞表面表达是必要且足够的。实施例2、使用人Iga和Ig|3转染源自仟何动物的B细胞系为了证明人Iga和IgP对源自动物的B细胞中人mlgM的表达的影响，用编码人Iga或IgP或人mlgM的表达载体转染源自鸡(DT40)、牛和猪的B细胞。用该表达载体转染永生化的B细胞系并将该细胞在含有用于筛选稳定转染体的新霉素的培养基中培养。使用对人mlgM和人Iga和/或IgP特异的抗体，通过流式细胞术分析抗性细胞。编码人mlgM的表达载体对兔B细胞的转染导致人mlgM的低细胞表面表达。人Iga和/或IgP的共转染导致人mlgM的高细胞表面表达。这证明人Iga和/或Ig^对于人(或人源化)的或嵌合mlgM的高细胞表面表达是必要且足够的。实施例3、表达人源化免疫球蛋白轻链和/或重链转基因的转基因兔，其同时表达人Iga和/或Igg或不表达人Iga和/或Igg按Fan等人(Pathol.Int.49:583-594，1999)所述产生转基因兔。简言之，使用标准方法使雌兔超排卵并与雄兔交配。从输卵管收集前核期的受精卵并将其置于适当的培养基中，如补充了20%胎牛血清的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水。在一对操作手的辅助下，将外源DNA(例如含有人(或人源化)免疫球蛋白基因座或人Iga或人IgP的表达载体)微注射到前核中。将形态学上存活的受精卵转移到假孕兔的输卵管中。通过注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导假孕。约0.1-1%的经注射的受精卵发育成活的转基因兔。通过PCR和FISH确认基因组中的转基因整合。使用ELISA检测法来测定转基因建立者兔的血清中含人IgG和/或人K轻链抗原决定簇的抗体的存在。通过流式细胞术分析B细胞表面的抗体表达。具有编码人(或人源化)免疫球蛋白重链基因座的转基因兔表达I-IOiig/ml的人IgM。幼龄动物(6-9周)表达100_4000iig/ml的人IgM。然而,人IgG的表达迅速降至IO-IOOiig/ml的水平。对外周血中B细胞的流式细胞术分析显示存在小量的人mlgM+细胞群(1-2%)。幼龄兔的阑尾中含有至多10%的人mlgM+细胞，而其随着年龄迅速消失。编码人Iga和/或IgP的转基因的导入导致血清中表达100-2000iig/ml的人(或人源化)IgM且稳定表达2000-12000ug/ml的人(或人源化)IgG。阑尾30-70%的淋巴细胞是人(或人源化)mlgM+。外周血中，相等量的B细胞表达兔和人(或人源化)mlgM或mlgG。本公开通篇引用的所有参考文献以及其中引用的所有文献在此明确地通过引用作为参考。虽然通过参考某些实施方式来说明本发明，但其并不限于此。本领域技术人员将理解可轻易得到并进行多种修改而本质上不改变本发明的工作方式。本文主张的发明范围特别旨在包括所有这些修改。权利要求1.一种编码BCR的嵌合Iga亚基的转基因构建体，所述嵌合Iga亚基包括(a)非人Iga多肽序列的胞内结构域序列和跨膜结构域序列；以及(b)与SEQIDNO.:1的人Iga的胞外结构域具有至少85%序列同一性的多肽。2.一种编码BCR的嵌合IgP亚基的转基因构建体，所述嵌合IgP亚基包括(a)非人IgP亚基的胞内结构域序列和跨膜结构域序列；以及(b)与SEQIDNO.:7的人IgP的胞外结构域具有至少85%序列同一性的多肽。3.权利要求I的转基因构建体，其中所述非人Iga多肽序列包括牛(SEQIDNO2)；鼠类(SEQIDNO:3);犬(SEQIDNO:4);灵长类(SEQIDNO:5);兔(SEQIDNO:6)或其它非人序列。4.权利要求2的转基因构建体，其中所述非人IgP多肽序列包括犬(SEQIDNO8)；大鼠(SEQIDNO:9);牛(SEQIDNO:10);鼠类(SEQIDNO:ll);鸡(SEQIDNO:12)或其它非人序列。5.一种非人转基因动物，包括(a)编码SEQIDNO.1的全长人Iga亚基，或权利要求I的嵌合Iga亚基的转基因构建体；和/或(b)编码SEQIDNO.:7的全长人IgP亚基，或权利要求2的嵌合IgP亚基的转基因构建体；和(c)编码人或人源化免疫球蛋白基因座的转基因构建体；其中生成的转基因产物组合以形成人或人源化B细胞受体复合物。6.权利要求5的非人转基因动物，其中充分地降低非人转基因动物的任何内源性Ig产物和/或Iga和/或IgP亚基的表达。7.权利要求5的非人转基因动物，其中所述动物选自兔、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、鸟类、马、驴和牛。8.权利要求5的非人转基因动物，其是兔。9.权利要求5的非人转基因动物，其中通过B细胞特异性启动子在转基因动物的B细胞中表达所述Iga和/或IgP基因。10.权利要求5的非人转基因动物，其中所述Iga或IgP基因的表达仅在B细胞中发生。11.权利要求9的非人转基因动物，其中所述B细胞特异性启动子是⑶19、⑶20、⑶21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-l、CD79b(也称作B29或IgP)、mb_l(也称作Iga)、酪氨酸激酶blk，VpreB，免疫球蛋白重链，免疫球蛋白k轻链，免疫球蛋白\轻链，免疫球蛋白J链的启动子/增强子。12.权利要求9的非人转基因动物，其中所述B细胞特异性启动子是CD79a、CD79b或K轻链启动子/增强子。13.权利要求5的非人转基因动物，其中所述转基因构建体共表达。14.权利要求13的非人转基因动物，其中所述转基因构建体存在于相同的载体或两种不同的载体中。15.权利要求5的非人转基因动物，其中所述转基因构建体通过随机整合而整合到受体细胞的基因组中。16.权利要求5的非人转基因动物，其中所述转基因构建体通过靶向整合而整合到受体细胞的基因组中。17.权利要求5的非人转基因动物，其中所述转基因构建体位于一或多种重组载体中而导入受体细胞，所述载体之一携带人Iga和/或IgP基因片段，该片段相连于与内源性Iga和/或IgP基因片段的侧翼序列同源的5’和3’侧翼序列，然后选择通过同源重组使其内源性Iga和/或IgP基因片段由人Iga和/或IgP基因片段代替的细胞，并从所选的遗传修饰的受体细胞得到动物。18.权利要求5的非人转基因动物，其中通过直接将转基因注射到胚中或间接地将它们注射到受孕母体中而将所述转基因构建体导入胚胎期的转基因动物中。19.权利要求5的非人转基因动物，其中在针对于内源性Ig以及内源性Iga和/或Ig^敲除的任一或更多，优选两者的敲除背景下，表达所述转基因构建体。20.权利要求5的非人转基因动物，其中所述转基因动物具有充分地降低的内源性Ig表达和更优选也充分地降低的内源性Iga和/或IgP表达。21.来自权利要求5的非人转基因动物的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述人或人源化免疫球蛋白是抗体或抗体片段。22.权利要求21的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体是多克隆或单克隆抗体。23.权利要求21的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体片段是多克隆抗体或单克隆抗体的片段。24.权利要求21的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体或抗体片段被标记。25.权利要求21的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体或抗体片段与毒素融合以形成免疫毒素，或者与治疗剂偶联。26.权利要求21的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体或抗体片段与异源氨基酸序列融合。27.权利要求23的分离的人或人源化免疫球蛋白，其中所述抗体片段是Fe、Fv,Fab、Fab，或F(ab’)2片段。全文摘要本发明描述了具有人(或人源化)免疫球蛋白基因座和编码人(或人源化)Igα和/或Igβ序列的转基因的转基因动物。尤其是具有转基因重链和轻链免疫球蛋白基因座的能够产生多样化的人(或人源化)抗体谱的动物，其Ig和/或内源性Igα和/或Igβ序列的内源性生产受到抑制。同时表达人(或人源化)免疫球蛋白和人(或人源化)Igα和/或Igβ使得正常B细胞发育、人(或人源化)抗体亲和力成熟以及高效表达。文档编号C07K16/00GK102719444SQ201210166840公开日2012年10月10日申请日期2007年8月29日优先权日2006年9月1日发明者R·比洛申请人:人类多细胞株治疗学公司