专利名称：一种纯化恩夫韦肽的方法
技术领域：
本发明属于反相HPLC技术领域，尤其是涉及ー种规模化纯化恩夫韦肽的方法。
背景技术：
恩夫韦肽是ー种人工合成的由36个氨基酸组成的链状多肽。是白色或灰白色非晶型固体，在纯水中几乎不溶，但在PH7. 5的缓冲液中溶解度达到82 142g/ml。分子式为C 204 H 301N5i O64。分子量为 4492。其结构式为=CH3CO-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2o恩夫韦肽为合成肽类HIV融合抑制药，可与病毒包膜糖蛋白結合，阻止病毒与细胞膜融合所必需的构象变化，从而抑制HIV-I的复制。它是近7年来抗艾滋病治疗药的先鋒，是第一个融合抑制剂。其它抗艾滋病药物是作用于细胞内部，阻止病毒在细胞内部复 制；而这ー药物却是通过阻止病毒与T细胞等免疫细胞的接触融合，干扰HIV-I进入T细胞，防止艾滋病患者的免疫系统遭受病毒破坏来发生作用，因此又称为融合抑制剂。目前涉及关于恩夫韦肽的报道基本都是合成エ艺方面，而在纯化工艺上基本没有，因恩夫韦肽的理化性质，在酸性及中性环境中溶解度极低，因此造成其在HPLC上纯化的困难，使其收率极低，本发明通过在碱性环境中使用的色谱条件有效解决了这个问题，从而达到提闻收率的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一条适于规模化生产恩夫韦肽的纯化方法，主要解决恩夫韦肽在酸性及中性环境中溶解度极低，因此造成其在HPLC上纯化的困难，使其收率极低的技术问题。本发明使用反相高效液相色谱法纯化恩夫韦肽，并用HPLC转盐法交换转盐，效率高，成本低且收率好，达到产业化的要求，解决现有技术分离得到恩夫韦肽的空白。为实现上述目的，本发明的技术方案如下一种纯化恩夫韦肽的方法，包括如下步骤
I)将恩夫,妝粗品以稀氣水完全溶解后，以滤I吴过滤后待用，以固定相为聚合物色谱柱，流动相为两相，磷酸盐缓冲液为A相，色谱こ腈为B相，进行梯度洗脱一次纯化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；
2)以固定相为反相硅胶色谱柱进行二次纯化同时转盐，流动相为两相，醋酸水溶液为A相，色谱こ腈为B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；
3)将最終的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。更为优选的方案是所述聚合物色谱柱是以聚苯こ烯-聚こ烯苯为基质的聚合物树脂填料为固定相的聚合物色谱柱。更为优选的方案是所述磷酸盐缓冲液pH为7. 5-8. O。更为优选的方案是所述步骤I)中梯度洗脱的B相体积百分浓度为30% 50%，检测波长为230nm。更为优选的方案是所述二次纯化及转盐所用制备柱为以十八烷基键合硅胶填料为固定相的反相硅胶色谱柱。更为优选的方案是所述二次纯化及转盐中醋酸水溶液体积百分浓度为2. 0%，梯度洗脱的B相体积百分浓度为5% 20% 25%，检测波长为230nm。本发明的有益效果是本发明提出的一条适于规模化生产恩夫韦肽的纯化工艺方法，先以聚合物制备柱在碱性条件下进行一次纯化得到纯度80%以上的产品，再以C18填料的制备柱进行二次纯化同时转盐，不仅能得到HPLC纯度大于98. 0%的精肽，还有效地提高了产品的收率，降低了成本，同时生产方法简单，易于操作，从而达到大規模エ业化生产的目的。
具体实施方式
实施例I
I.样品处理称取2g恩夫韦肽粗品于烧杯中，边加入体积百分浓度为5%稀氨水边超声至液体澄清，用孔径为O. 45um滤膜过滤后收集滤液备用。2. 一次纯化
纯化条件色谱柱以固定相为聚苯こ烯-聚こ烯基苯为基质的聚合物树脂填料的聚合物色谱柱，柱子直径和长度为3CmX25Cm.流动相A相20mmol/l磷酸氢ニ钠水溶液，以氨水调PH为7. 5-8. O ；B相:色谱こ腈。流速:15-20ml/min。检测波长:230nm。梯度B相体积百分浓度为30-50%，30-50min。进样量为2. 0-2. 5g。纯化过程将色谱柱用体积百分浓度为30%的B相平衡好后上样，进行线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。3. 二次纯化及转盐
纯化条件色谱柱以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱色谱柱，柱子直径和长度为3CmX25Cm.流动相A相体积百分浓度为2. 0%醋酸水溶液；B相色谱こ腈。流速30-35ml/min。检测波长230nm。梯度B相体积百分浓度为5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。进样量为一次纯化两针粗品收集的肽溶液。纯化过程将色谱柱用体积百分浓度为5%的B相平衡好后上样，进行线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。4.将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至lg/100ml，浓缩温度不超过400C，然后冷冻干燥得纯度大于98. 0%的恩夫韦肽，纯化收率52. 3%。实施例2
I.样品处理称取5g恩夫韦肽粗品于烧杯中，边加入体积百分浓度为5%稀氨水边超声至液体澄清，用孔径为O. 45um滤膜过滤后收集滤液备用。2. 一次纯化
纯化条件色谱柱以固定相为聚苯こ烯-聚こ烯基苯为基质的聚合物树脂填料的聚合物色谱柱，柱子直径和长度为5CmX25Cm.流动相A相20mmol/l磷酸氢ニ钠水溶液，以氨水调PH为7. 5-8. O ;B相色谱こ腈。流速35-40ml/min。检测波长230nm。梯度B相质量百分浓度为30-50%，30-50min，上样量为5. 0-5. 5g。
纯化过程将色谱柱用体积百分浓度为30%的B相平衡好后上样，进行线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。3. 二次纯化及转盐
纯化条件色谱柱以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱色谱柱，柱子直径和长度为5CmX25Cm.流动相A相体积百分浓度为2. 0%醋酸水溶液；B相色谱こ腈。流速50-55ml/min。检测波长230nm。梯度B相体积百分浓度为5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。进样量为一次纯化两针粗品收集的肽溶液。纯化过程将色谱柱用体积百分浓度为5%的B相平衡好后上样，进行线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。4.将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至lg/100ml，浓缩温度不超过 400C，然后冷冻干燥得纯度大于98. 0%的恩夫韦肽，纯化收率46. 6%。实施例3
I.样品处理称取15g恩夫韦肽粗品于烧杯中，边加入体积百分浓度为5%稀氨水边超声至液体澄清，用孔径为O. 45um滤膜过滤后收集滤液备用。2. 一次纯化
纯化条件色谱柱以固定相为聚苯こ烯-聚こ烯基苯为基质的聚合物树脂填料的聚合物色谱柱，柱子直径和长度为10CmX25Cm.流动相A相20mmol/l磷酸氢ニ钠水溶液，以氨水调pH为7. 5-8. O ;B相色谱こ腈。流速55_60ml/min。检测波长230nm。梯度B相体积百分浓度为30-50%，30-50min。进样量为15_18g。纯化过程将色谱柱用体积百分浓度为30%的B相平衡好后上样，进行线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。3. 二次纯化及转盐
纯化条件色谱柱以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱色谱柱，柱子直径和长度为10CmX25Cm.流动相A相体积百分浓度为2. 0%醋酸水溶液；B相色谱こ腈。流速:80-85ml/min。检测波长:230nm。梯度B 相体积百分浓度:5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。进样量为一次纯化两针粗品收集的肽溶液。纯化过程将色谱柱用体积百分浓度为5%的B相平衡好后上样，进行线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。4.将转盐后所得的所有肽溶液，进行减压浓缩至lg/100ml，浓缩温度不超过400C，然后冷冻干燥得纯度大于98. 0%的恩夫韦肽，纯化收率42. 7%。
权利要求
1.一种纯化恩夫韦肽的方法，其特征是包括如下步骤 1)将恩夫韦妝粗品以稀氣水完全溶解后，以滤I吴过滤后待用，以固定相为聚合物色谱柱，流动相为两相，磷酸盐缓冲液为A相，色谱乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液； 2)以固定相为反相硅胶色谱柱进行二次纯化同时转盐，流动相为两相，醋酸水溶液为A相，色谱乙腈为B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液； 3)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。
2.根据权利要求I所述纯化恩夫韦肽的方法，其特征在于所述步骤I)聚合物色谱柱为聚苯乙烯-聚乙烯苯为基质的聚合物树脂填料。
3.根据权利要求I所述纯化恩夫韦肽的方法，其特征在于所述步骤I)中磷酸盐缓冲液 pH 为 7. 5-8. O。
4.根据权利要求I所述纯化恩夫韦肽的方法，其特征在于所述步骤I)中梯度洗脱的B相体积百分浓度为30% 50%，检测波长为230nm。
5.根据权利要求I所述纯化恩夫韦肽的方法，其特征在于所述步骤2)中反相硅胶色谱柱为十八烷基键合硅胶填料。
6.根据权利要求I所述纯化恩夫韦肽的方法，其特征在于所述步骤2)中醋酸水溶液体积百分浓度为2. 0%，梯度洗脱的B相体积百分浓度为5%-20%-25%，检测波长为230nm。
全文摘要
本发明公开了一种利用反相高效液相色谱法纯化恩夫韦肽的方法，主要解决恩夫韦肽收率极低的技术问题。纯化包括如下步骤1)将恩夫韦肽粗品以稀氨水完全溶解后，以滤膜过滤后待用，以固定相为聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料的聚合物色谱柱，流动相中，磷酸盐缓冲液为A相，色谱乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；2)以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱进行二次纯化同时转盐，流动相中，醋酸水溶液为A相，色谱乙腈为B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；3)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。本发明提出了一条适合放大生产的高效液相色谱法纯化恩夫韦肽的纯化工艺。
文档编号C07K1/16GK102827258SQ20121037589
公开日2012年12月19日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者徐红岩, 任丽萍 申请人:吉尔生化(上海)有限公司, 上海吉尔多肽有限公司, 滨海吉尔多肽有限公司