专利名称：一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin及其纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin及其纯化方法,属于蛋白质技术领域。
背景技术：
Hemolin作为昆虫所特有的一种防御蛋白，在研究昆虫的免疫机制中有重要的意义。目前对其结构和功能的研究都取得了一定的成果，但是对其在体外的功能研究较少，所以本实验通过简单的纯化得到较纯的Hemolin,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础, 也可以在此基础上对它的结构做更深入的探索。
因为基因工程产品的组分复杂、对产品的纯度要求较高且蛋白在纯化过程中存在聚集变性的趋势，所以它的制备和纯化比一般产品要困难的多。虽然人们普遍使用制备型 HPLC进行基因工程产物的最后一步纯化，但由于HPLC具有对软硬件的要求较高，前期投入大，纯化量有限，价格昂贵，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多等缺点。而Superdex 75蛋白纯化系统具有纯化量大、流速快，负载量较大，层析条件易控制，非特异性吸附小等优点。发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin及其纯化方法， 该方法以家蚕杆状病毒感染的蚕蛹为原料，通过多种离心方法得到含有天然免疫蛋白的溶液；将母液进行活性测定后，将活性高的母液脱糖，脱糖溶液与母液按10:1比例通过宏吸的方法过300K膜包去除糖分；将去糖的母液与蛋白提取液按1:2. 5混合，在4°C冰箱中缓慢搅拌过夜；之后通过弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离，再通过琼脂糖凝胶柱 (SuperdexTM 200、SuperdexTM 75 )进一步纯化。
为达到上述目的，本发明提供一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。
上述家蚕天然免疫蛋白Hemolin的纯化方法,包括以下步骤(1)家蚕免疫蛋白母液的制备；(2)家蚕天然免疫蛋白的分离纯化。
进一步地，其中步骤(I)中所述家蚕免疫蛋白母液的制备具体包括a.保存于_20°C的蚕蛹与4°C预冷的灭菌ddH20以1:3的重量百分比混合在冰上匀浆2min,将匀楽液置于冰上停留5 min,重复9次；b.于15000rpm,4°C离心60 min,重复5次,最后一次用4层纱布过滤；c.过滤后的上清液取200mL与水按I:I的体积混合,用O. 22 μ m膜包过滤,重复10次, 上清溶液恢复到200mL的体积；d.步骤c所得上清液于50000rpm,10°C离心40min后，出现的黑团用超滤液重悬进行区带离心；取样品300ml进行蔗糖密度梯度离心3h;e.将步骤d离心3h后所得的上清液用质量体积浓度为60%的蔗糖溶液下样，按35mL/ 管收集，并在每管中取3mL做比活测定。
进一步地，其中步骤d中所述样品的蔗糖密度梯度离心为铺制pH 7. 4的磷酸盐缓冲液200ml，样品300ml，30%蔗糖400ml，55%蔗糖充满，22000rpm密度梯度离心3h。
进一步地，其中步骤d中所述区带离心的条件为50000rpm, 10°C离心40min ;样品为步骤c所得上清液；蔗糖浓度为质量体积浓度。
进一步地，其中步骤d中所述pH 7. 4的磷酸盐缓冲液的制备方法为将8g NaCl,O.2g KC1、3. 58g Na2HPO4 · 12Η20、0· 27g KH2PO4 溶于 800mL 无菌去离子水中，定容至 IOOOmL即得。
进一步地，其中步骤(2)中所述家蚕天然免疫蛋白的分离纯化具体包括a.将活性高于26的母液与脱糖组分按1:10的体积比例通过宏吸的方法，过300K膜包去除糖分；b.将去糖的母液与蛋白提取液按1:2.5的体积比混合，在4°C冰箱中缓慢搅拌过夜；c.之后通过弱阴离子交换柱DEAE初步分离，将分离所得的溶液用IOOkD的超滤管进行浓缩；d.琼脂糖凝胶柱分离，得到8个峰，并将每个不同的峰分批浓缩；e.浓缩含目的蛋白的峰，用琼脂糖凝胶柱进一步纯化得到目的蛋白，并用SDS-PAGE鉴定。
进一步地,其中步骤(d)中所述琼脂糖凝胶柱为SuperdexTM 200凝胶柱。
进一步地,其中步骤(e)中所述琼脂糖凝胶柱为SuperdexTM 75凝胶柱。
本发明以蚕蛹作为原料，通过不同的离心方法，超滤，得到含有免疫蛋白的组分， 将含有目的蛋白的上清溶液然经过AKTA explorer 10蛋白纯化系统(SuperdexTM 200、 SuperdexTM 75)中简单的层析技术分离纯化得到目的蛋白Hemolin ;此外,本发明所选择的层析条件不但有效地纯化了目的蛋白Hemolin,而且有效地防止了标Hemolin的失活变性，最终制备了纯度较高的具有天然活性的Hemolin。
图I是家蚕天然免疫蛋白Hemolin的弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离色谱图； 图2A是家蚕天然免疫蛋白Hemolin的弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离的SDS-PAGE图谱之一；其中4、5、17、21、25、32分别对应于分离得到的管子；图2B是家蚕天然免疫蛋白Hemolin的弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离的SDS-PAGE图谱之二 ；其中37、38、63、73、75、76等等数字分别对应于分离得到的管子；图3是SuperdexTM 200分离的色谱图；图 4A 是 SuperdexTM 200 分离后的 SDS-PAGE 谱图之一;其中 23、27、31、34、39、41、44、 47分别对应于分离得到的管子；图 4B 是 SuperdexTM 200 分离后的 SDS-PAGE 谱图之二 ；其中 52、56、60、66、68、73、75 等数字分别对应于分离得到的管子；图5是将47号多次收集的样品浓缩后用SuperdexTM 75分离的色谱图；图6是为图4第一个峰浓缩后的SDS-PAGE鉴定图；图7是将图3中第一块胶的最后一条泳道中取样的质谱鉴定图(一级)；图8是将图3中第一块胶的最后一条泳道中取样的质谱图(二级)；图9是将图3中第一块胶的最后一条泳道中取样的肽段比对数。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本发明提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的含义相同。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例I :家蚕免疫蛋白母液的制备步骤I :保存于-20°C的蚕蛹(购于浙江中奇生物药业股份有限公司)与灭菌4°C预冷的ddH20以1:3的重量百分比混合在冰上匀浆2 min,将匀浆液置于冰上停留5 min,重复9 次；步骤2 :15000 rpm, 4°C离心Ih,弃去上清,用水重悬沉淀，再于15000 rpm,4°C离心Ih, 如此重复5次，最后一次用4层纱布过滤；步骤3 :过滤后的上清液取200mL与水按I: I的体积混合,用O. 22 μ m膜包过滤,重复 10次，上清溶液恢复到200mL的体积；步骤4 :所得上清液于50000rpm, 10°C离心40min后，出现的黑团用超滤液重悬进行区带离心(50000rpm, 1(TC离心40min);取样品300ml进行鹿糖密度梯度离心3h (具体操作过程为铺制PBS (pH 7. 4的磷酸盐缓冲液)200ml，样品(步骤3所得上清液)300ml，30%(质量体积浓度)蔗糖400ml，55% (质量体积浓度)蔗糖充满，22000rpm密度梯度离心3h);步骤5 :将步骤4离心3h后所得的上清液用60%(质量体积浓度)的蔗糖溶液将不同蔗糖浓度的溶液挤出，即为下样，按35mL/管收集，并在每管中取3mL做比活测定。
实施例2 :家蚕天然免疫蛋白的分离纯化(1)将活性高于26的母液(用BCA法检测样品蛋白含量，活性=2nX4/样品浓度(mg/ mL), η=发生红细胞凝集的孔数)取200mL与脱糖组分按1:10的体积比通过宏吸的方法， 过300K膜包去除糖分。最后体积恢复到200mL ；(2)将去糖的母液与蛋白提取液按1:2.5的体积比混合，在4°C冰箱中缓慢搅拌过夜；(3)之后通过弱阴离子交换柱(DEAE，购于购自GEHealthcare公司)初步分离将上述步骤⑵中所得的蛋白样品与DEAE按2:1的体积比混合，在4°C冰箱中缓慢搅拌2h后， 将DEAE填料倒入柱子中；平衡柱子并保证柱子无气泡和填料不干燥；与系统结合后，分离如图I所示，10到50号的蛋白样品的紫外吸光值高达3000，说明蛋白浓度高；并将吸收分离得到的蛋白样品进行SDS-PAGE鉴定，如图2 A、图2B所示，大部分的蛋白都集中在25kDa 至60kDa之间，且在45kDa至60kDa之间蛋白浓度最高；将10到50管的收集样品用IOOkD 的超滤管进行浓缩；(4)琼脂糖凝胶柱(SuperdexTM200,购于购自GE Healthcare公司)分离,得到8个峰(见图2A、图2B);如图3所示，得到8个峰，按峰收集；SDS-PAGE鉴定，如图4A、图4B所示，蛋白样品能够分开，且第47号管的蛋白只有两条带，说明在47号管时，所得的蛋白比较纯；(5)重复步骤(4)，每次都收集47管并用30kD的超滤管浓缩；之后用琼脂糖凝胶柱 (SuperdexTM 75,购自GE Healthcare公司)进一步纯化，如图5所示,有4个主要的峰,按峰收集；将第一个峰用SDS-PAGE鉴定，如图6所示，只有一条目的条带，说明分离所得的目的蛋白较纯。
实施例3:家蚕天然免疫蛋白Hemolin的质谱鉴定I.样品制备将图4A中的47号的第二条带目的蛋白割胶后，切成Imm3左右的小块， 装入离心管中。送到质谱鉴定公司。注意要保证样品与其所接触的所有物品的干净，防止杂蛋白及其他污染物的污染。
2.质谱结果为鉴定上述样品为豕香天然免疫蛋白Hemolin,如图7所不，为一级质谱图，如图8所示，为二级质谱图；该蛋白的肽指纹图谱与西南农大蛋白库中的编号 gi69146821的蛋白覆盖率达49%，并获得其氨基酸序列如图9及SEQ ID NO. I所示，证明该蛋白即为家蚕天然免疫蛋白Hemolin。
本发明以蚕蛹作为原料，通过不同的离心方法，超滤，得到含有免疫蛋白的组分， 然后用蛋白提取液处理后，再经三步层析分离纯化，得到目的蛋白Hemolin，对天然免疫蛋白的纯化提出了一种全新的解决方法，具有重要意义。
以上所述，仅为本发明的实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说， 在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做若干的改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
权利要求
1.一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin,其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—种如权利要求I所述的家蚕天然免疫蛋白Hemolin的纯化方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤 (I)家蚕免疫蛋白母液的制备； (2)家蚕天然免疫蛋白的分离纯化。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述家蚕免疫蛋白母液的制备具体包括 a.保存于_20°C的蚕蛹与4°C预冷的灭菌ddH20以1:3的重量百分比混合，在冰上匀衆2 min,将匀楽:液置于冰上停留5 min,重复9次； b.于15000rpm,4°C离心Ih,弃去上清,用水重悬沉淀,再于15000 rpm, 4°C离心Ih,如此重复5次，最后一次用4层纱布过滤； c.过滤后的上清液取200mL与水按I:I的体积混合,用O. 22 μ m膜包过滤,重复10次，上清溶液恢复到200mL的体积； d.步骤c所得上清液于50000rpm,10°C离心40min后，出现的黑团用超滤液重悬进行区带离心；取样品300ml进行蔗糖密度梯度离心3h; e.将步骤d离心3h后所得的上清液用质量体积浓度为60%蔗糖溶液下样，按35mL/管收集，并在每管中取3mL做比活測定。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤d中所述样品的蔗糖密度梯度离心为铺制pH 7. 4的磷酸盐缓冲液200ml，样品300ml，30%蔗糖400ml，55%蔗糖充满，22000rpm密度梯度离心3h。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在干，步骤d中所述区带离心的条件为50000rpm, 10°C离心40min ;样品为步骤c所得上清液；蔗糖浓度为质量体积浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤d中所述pH7. 4的磷酸盐缓冲液的制备方法为:将 8g NaCl.O. 2g KC1、3. 58g Na2HPO4 · 12Η20、0· 27g KH2PO4 溶于 800mL 无菌去离子水中，定容至IOOOmL即得。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在干，步骤e中所述用质量体积浓度为60%的蔗糖溶液下样为用质量体积浓度为60%的蔗糖溶液将不同蔗糖浓度的溶液挤出。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述家蚕天然免疫蛋白的分离纯化具体包括 a.将活性高于26的母液与脱糖组分按1:10的体积比例通过宏吸的方法，过300K膜包去除糖分； b.将去糖的母液与蛋白提取液按1:2.5的体积比混合，在4°C冰箱中缓慢搅拌过夜； c.之后通过弱阴离子交換柱DEAE初步分离，将分离所得的溶液用IOOkD的超滤管进行浓缩； d.琼脂糖凝胶柱分离，得到8个峰，并将每个不同的峰分批浓缩； e.浓缩含目的蛋白的峰，用琼脂糖凝胶柱进一步纯化得到目的蛋白，并用SDS-PAGE鉴定。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤d中所述琼脂糖凝胶柱为SuperdexTM200凝胶柱。
10.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤e中所述琼脂糖凝胶柱为SuperdexTM75凝胶柱。
全文摘要
本发明涉及一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin及其纯化方法，属于蛋白纯化技术领域。本发明以蚕蛹作为原料，通过不同的离心方法，超滤，得到含有免疫蛋白的组分，将含有目的蛋白的上清溶液然经过AKTAexplorer10蛋白纯化系统中简单的层析技术分离纯化得到目的蛋白Hemolin。本发明主要是利用了Superdex200和Superdex75凝胶层析，这为天然免疫蛋白的纯化提出了一种全新的解决方法，具有重要意义。
文档编号C07K1/36GK102977200SQ20121045271
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者张耀洲, 杜瑶瑶, 刘玲玲, 陈剑清, 舒特俊 申请人:天津耀宇生物技术有限公司