一种高性能类蛛丝蛋白材料及其生物合成方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学与生物材料学领域，以蜘蛛拖丝基因为基础人工定向突变部分氨基酸序列，通过大肠杆菌过表达方法和Ni柱纯化技术获得新的重组蛛丝蛋白，静电纺丝后获得硬度和弹性都优于天然蛛丝蛋白的类蛛丝蛋白。本发明的类蛛丝蛋白是SEQ?ID?NO：5所示的氨基酸序列的n倍体，其中n为等于1或大于1的整数，例如，3倍体、6倍体或其它整数倍体。
【专利说明】一种高性能类蛛丝蛋白材料及其生物合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料领域，具体地，本发明涉及一种高性能类蛛丝蛋白，所述类蛛丝蛋白是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的η倍体，其中η为等于I或大于I的整数，本发明还涉及利用生物法合成高性能蛋白材料的方法。
技术背景
[0002]蜘蛛丝是一种天然蛋白质纤维，具有高强度、高弹性、高断裂能等机械性能以及显著的可降解性、组织相容性等生物学特性，在生物医学、材料、纺织和军事装备等领域均有重大潜在应用价值。蜘蛛丝作为一种蛋白质纤维，从上世纪90年代开始成为新材料的研究热点。蜘蛛丝的力学性能、热学性能优异，与杜邦公司生产的Kevlar相比，断裂伸长率是后者的7倍，断裂能是后者的10倍，性质足以超越Kevlar这种备受推崇的“合成钢丝”。在以后的研究中，有的研究者直接对蜘蛛丝冠以“生物钢”的美誉。从商业上讲，蜘蛛丝具有巨大的市场。
[0003]尽管蜘蛛丝有如此广泛的用途，但蜘蛛的产丝量少且不易大规模饲养，而天然蛛丝蛋白序列结构特征(含有多种重复序列)为人工获得高性能类蜘蛛丝提供了重要依据。运用化学或生物的手段生产高性能类蛛丝蛋白是目前研究的热点。天然蛛丝蛋白富含丙氨酸和甘氨酸，丙氨酸富集区可以形成疏水的β_折叠结晶结构，是蛛丝蛋白具有高强度的重要原因；而亲水的甘氨酸富集区形成了 α-螺旋，是蛛丝蛋白具有高弹性的关键原因
[I];其它氨基酸(丝氨酸，酪氨酸，精氨酸，脯氨酸等)也在蛛丝结构的形成中起到了重要的作用。这表明，蛛丝蛋白的序列结构特征造就了其它人造纤维材料无法比拟的优异性能。近20年来，随着基因技术和基因化学合成方法的建立与发展，诞生了利用活细胞的合成体系创造新蛋白质的蛋白质工程，国内外许多实验室据此已进行了人工合成蜘蛛丝蛋白的尝试[2，3]。但是经过纺丝工艺得到的人造蜘蛛丝，力学性能与天然蜘蛛丝还有较大的差距。因此，利用基因工程技术，通过改造天然蛛丝蛋白的序列结构特征来提高蛛丝的力学性能成为国内外研究热点。Valluzzi R等利用基因工程技术在蛛丝蛋白富含丙氨酸的区域侧翼添加甲硫氨酸[4], 一定程度上改善了蛛丝蛋白的水溶性；Winkler S等通过在蛛丝蛋白基因序列中并入AMP蛋白激酶的磷酸化位点，从而在蛋白中引入带有正电荷的磷酸基团，这种带有正电荷的磷酸基团可以阻止β -折叠之间的疏水相互作用[5]。Vendrely C和Huemmerich D等都推测在蛛丝蛋白序列中引入一些侧链化学活性较好的氨基酸可以改善蛛丝的性能[6，7]。但是，以上研究主要针对蛛丝蛋白的白组装进行研究，并没有取得弹性、韧性等性能优于天然蛛丝蛋白的异源表达蛋白。
[0004]蜘蛛丝基因组很大，目前国内外是利用已知蜘蛛丝基因组中DNA、氨基酸主要重复序列信息，人工合成其类似物的DNA片段，通过大肠杆菌[8-10]，毕赤酵母[11]，山羊乳腺细胞[12，13]、家蚕表达系统[14]以及植物马铃薯和烟草[15]来生产蜘蛛丝蛋白。但是动植物表达宿主存在着表达周期长、重组丝蛋白产量低和成本昂贵的缺点，酵母宿主与大肠杆菌宿主相比具有培养周期较长的缺点。大肠杆菌的表达系统优点是周期短，操作简便，细胞易于破碎，成本低廉，适合蛛丝蛋白低倍体的表达。然而受限于原核表达系统的固有缺陷，目前已报道的利用大肠杆菌生产蜘蛛丝蛋白存在表达量低、力学性能较差等问题。
【发明内容】
[0005]本发明针对大肠杆菌生产蜘蛛丝蛋白存在表达量低、力学性能较差等问题，利用蛛丝蛋白低倍体不宜产生翻译提前终止错误的特点进行表达，并且通过定点突变提高了蛛丝蛋白的弹性和韧性等性能，获得了性能优于天然蛛丝蛋白性能的突变体蛛丝蛋白。
[0006]本发明的一个目的是提供一种类蛛丝蛋白，所述类蛛丝蛋白是SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的η倍体，其中η为等于I或大于I的整数。所述类蛛丝蛋白的性能优于天然蛛丝蛋白性能，例如，与天然蛋白相比较，所述类蛛丝蛋白的硬度和弹性都有较大的提高。
[0007]在一个优选的实施方案中，所述类蛛丝蛋白是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍体或6倍体。SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的其它整数倍体与天然蛛丝蛋白相比较也具有改善的性能，因此也包含在本发明的范围内。
[0008]在一个更优选的实施方案中，所述类蛛丝蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:3，其是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍体。在另一个更优选的实施方案中，所述类蛛丝蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，其是SEQID NO:5所示的氨基酸序列的6倍体。
[0009]本发明的目的在于通过大肠杆菌异源表达技术和静电纺丝技术获得一种在硬度和弹性上都有所改善的丝蛋白，为实现该目标，本发明提供一种生物合成本发明的高性能类蛛丝蛋白的方法，所述方法包括下述步骤:
[0010](I)根据本发明所述的类蛛丝蛋白的氨基酸序列人工合成相应的核苷酸序列，并针对要用于表达的宿主进行密码子优化；
[0011](2)将步骤(I)合成的密码子优化的核苷酸序列重组到适当的表达载体中，然后克隆到所述宿主的细胞中，筛选得到工程重组宿主细胞；
[0012](3)培养步骤(2)得到的所述工程重组宿主细胞，表达所述类蛛丝蛋白；
[0013](4)纯化得到所述类蛛丝蛋白。
[0014]其中，所用的宿主可以是大肠杆菌，但并不限于此，还可以采用酵母菌等常用工程菌。其中步骤⑴所述人工合成相应的核苷酸序列为SEQ IDNO:8的η倍体，其中η为等于I或大于I的整数。
[0015]可以利用上述方法合成SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍体、6倍体或其它整数倍体的类蛛丝蛋白。当合成的类蛛丝蛋白为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍体时，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，相应地，针对大肠杆菌表达宿主密码子优化的编码核苷酸序列可以为SEQ IDNO:4。当合成的类蛛丝蛋白为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的6倍体时，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，相应地，针对大肠杆菌表达宿主密码子优化的编码核苷酸序列可以为SEQ ID Ν0:6。
[0016]当表达宿主选择大肠杆菌时，可用的表达载体可以为本领域常用的大肠杆菌表达载体，例如，但不限于，pET-30a(+) ,pACY dut-1等。本领域技术人员根据现有技术的知识，能够依据所选用的宿主选择适用的表达载体。另外，本领域技术人员应该理解，密码子优化、基因的人工合成、重组方法和克隆方法、以及蛋白的表达和纯化均是本领域中的常规方法。[0017]更具体地，合成本发明的高性能类蛛丝蛋白的方法的步骤如下:
[0018]a、本发明所涉及蛛丝蛋白11R26来源于金丝蜘蛛大壶状腺丝蛋白(Nephilaclavipes major ampul late spidroin 1)，蛋白序列见 SEQ ID NO:1,其基因序列是根据蛋白序列人工合成的，并针对大肠杆菌对基因序列进行了密码子优化，获得的基因序列为SEQID N0:2。基因序列密码子优化及合成由上海生工生物公司提供；
[0019]b、将11R26单倍体序列中的所有Ser (见图7，SEQ ID NO:1中下划线标出)转变成Cys，得到ZF4(见图7，SEQ ID NO:3，下划线标出对应的位点)，相应人工合成并优化突变体ZF4基因序列为SEQ ID N0:4(见图7，SEQ ID NO:4，相应突变位点下划线标出)。基因序列密码子优化及合成由上海生工生物公司提供；
[0020]C、将11R26和ZF4的基因(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4)分别重组到表达质粒pET-30a(+) (Novagen)上，转化Ε.coli BL21 (DE3)，获得工程大肠杆菌菌株(转化技术为常规技术，具体方法参见分子克隆试验指南，美国冷泉港出版社);
[0021]d、挑取带有重组质粒pet30a_llR26/ZF4的阳性克隆接种到添加50 μ g ?πι1卡那霉素的LB培养基中，180-220rpm条件下，37°C过夜培养；
[0022]e、将过夜培养的工程大肠杆菌按I %的接种量转接到50mL含50 μ g mL—1卡那霉素的LB培养液中，在37°C和180-220rpm的条件下振荡培养至OD6tltl约为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol.L_\继续培养3_5小时，离心收集菌体；
[0023]f、菌体用ddH20洗涤后用裂解缓冲液(IOmM咪唑，6M尿素，lOmMTris-HCl，IOOmM磷酸二氢钠，pH 8.0)溶解，130W超声破碎菌体细胞，4°C，1000Orpm离心30min，收集上清，Ni柱纯化目的蛋白；
[0024]g、将纯化的蛛丝蛋白11R26(即，野生型蛛丝蛋白，作为对照)和ZF4(即，本发明的一种重组类蛛丝蛋白)进行透析，收集沉淀，_80°C冻干；将冻干的两种蛛丝蛋白溶于六氟异丙醇(IOOmg πι1), 23-30kV静电纺丝在云母片上；
[0025]h、原子力显微镜(Dimension3100原子力显微镜)HARM0NIX模式检测云母片上丝的力学性能，比较两种丝纤维的力学性能后发现，经过转变序列后获得的蛛丝蛋白ZF4硬度和弹性都有明显改善。
[0026]本发明具有以下优点:
[0027]本发明通过定向突变，改变了蛋白质的一级结构，然后通过大肠杆菌表达的方法获得表达量较高的类蛛丝蛋白，相对于天然蛛丝蛋白(即，野生型蛛丝蛋白)序列，一级结构中的巯基数目增加，从而提高了丝纤维中肽链之间二硫键数目，增加了蛋白构象的稳定性，从而增加丝纤维的弹性和硬度。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0029]图1蛛丝蛋白11R26(A)和类蛛丝蛋白ZF4(B)基因重组载体构建图；
[0030]图2重组蛛丝蛋白11R26和类蛛丝蛋白ZF4Ni柱(GE healthcare)纯化后的电泳图，泳道I为11R26(即野生型)纯化后蛋白，泳道2为ZF4(即突变型)纯化后蛋白，箭头所指为表达的蛛丝蛋白，泳道3为ZF4表达菌株破碎液，M为蛋白质分子量标签；
[0031]图3重组蛛丝蛋白11R26(A)和类蛛丝蛋白ZF4(B)静电纺丝扫描电镜图；[0032]图4重组蛛丝蛋白11R26(A)和类蛛丝蛋白ZF4(B)硬度力学曲线变化图；
[0033]图5重组蛛丝蛋白11R26(A)和类蛛丝蛋白ZF4(B)弹性模量变化图；
[0034]图6重组蛛丝蛋白6倍体Ni柱(GE healthcare)纯化后电泳图，泳道I为重组蛛丝蛋白6倍体蛋白条带(即，η = 6)，M为蛋白质分子量标签；
[0035]图711R26蛋白(野生型蛛丝蛋白)和ZF4蛋白(突变型蛛丝蛋白)的氨基酸序列及其针对大肠杆菌密码子优化的编码核苷酸序列，其中下划线表示突变的位点。
【具体实施方式】
[0036]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0037]本领域技术人员应该理解，除非另外说明，实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。
[0038]实施例1:蛛丝蛋白拖丝基因11R26和ZF4序列合成和重组载体的构建
[0039]由上海生工有限公司合成SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4，并在5’和3’端分别引入EcoRI和HindIII酶切位点。
[0040]构建蛛丝蛋白11R26(野生型，对照)和ZF4(突变体)重组表达载体具体过程如下:将上海生工有限公司合成的重组载体pMD18-T-llR26/ZF4EcoRI/HindIII双切后，胶回收试剂盒(购自Omega)回收小的片段，同时EcoRI/Hindlll双切表达载体pET_30a(+)(Novagen),柱纯化试剂盒(购自Omega)直接过柱回收线性pET_30a (+)。将前面回收的小片段分别和线性表达载体pET_30a(+)用T4DNA Ligase(TaKaRa)进行连接，得到重组表达质粒 pet30a-llR26 和 pet30a_ZF4(图1)。
[0041]实施例2:重组质粒pet30a_llR26和pet30a_ZF4在大肠杆菌的表达和纯化
[0042]挑取带有重组质粒pet30a-l 1R26和pet30a_ZF4的阳性克隆接种到添加50μ g.ml/1卡那霉素的LB培养基中，180-220rpm条件下，37°C过夜培养，将过夜培养的工程大肠杆菌按I %的接种量转接到50mL含50 μ g.mL—1卡那霉素的LB培养液中，在37°C和180-220rpm的条件下振荡培养至OD6tltl约为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度
0.5mmol.L_\继续培养3_5小时，离心收集菌体；
[0043]菌体ddH20洗涤后用裂解缓冲液(IOmM咪唑，6M尿素，lOmMTris-HCl，IOOmM磷酸二氢钠，pH 8.0)溶解，130W超声破碎菌体细胞(工作时间5s，间歇时间5s，共50min)，4°C，IOOOOrpm离心30min，收集上清；将上清液过AKTA N1-NTA纯化柱，电脑记录，等流穿的蛋白量达到一定体积时，用裂解缓冲液洗涤至电压稳定；洗涤缓冲液(20mM咪唑，6M尿素，IOmMTris-HCl，IOOmM磷酸二氢钠，pH 8.0)洗涤杂蛋白，当电压不再变化或变化较小时用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗柱(250mM咪唑，6M尿素，IOmM Tris_HCl，IOOmM磷酸二氢钠，pH 8.0)，收集目的蛋白(目的蛋白SDS-PHAGE检测结果如图2所示)。
[0044]实施例3:重组蛛丝蛋白11R26和ZF4静电纺丝以及力学性能测试
[0045]将纯化的蛛丝蛋白11R26和ZF4洗脱液倒于透析袋，双蒸水透析24小时，每2_3小时更换一次，收集沉淀，-80°C冻干。将已冻干的两种蛛丝蛋白溶于六氟异丙醇(IOOmg/ml)，50°C加热套溶解12小时以上，注入Iml注射器，23_30kV静电纺丝，将云母片固定在倾斜60度角的硬纸片上，置于注射器下方铝箔纸上，变换角度，使纺出的丝落在云母片上，经扫描电镜观察如图3A和图3B所示；
[0046]原子力显微镜(Dimension3100原子力显微镜)HARM0NIX模式检测云母片上丝的力学性能，比较两种丝纤维的力学性能，获得硬度和弹性都优于天然蛋白的蛛丝蛋白。
[0047]通过比较图4A和图4B，改变序列(ser-cys)后的蛋白ZF4蛋白丝的硬度比未改变序列前的蛋白丝硬度有了明显的改善，反应在力学曲线上增加了 2倍左右；
[0048]通过比较图5A和图5B两种丝纤维的弹性模量变化图，改变序列(ser-cys)的ZF4蛋白丝的弹性模量值主要分布在0.8以上区域，0.SGPa区域以下没有值分布，最大弹性模量值约为2.3GPa，而未改变序列的11R26蛋白丝弹性模量变化值基本分布在小于0.8GPa区域，大于0.8GPa区域基本没有值分布，大部分分布在小于0.6GPa区域，最大弹性模量值约为1.3GPa，说明改变序列后的ZF4比11R26蛋白丝的弹性模量值要高，也说明弹性有了明显的改善和提闻。
[0049]在表1中，突变体ZF4的最大断裂强度(32.13nN)比11R26(10.08nN)增加了两倍；平均弹性模量ZF4(1.356GPa)比11R26(0.513GPa)增加了 1.5倍左右。
[0050]表1:突变体ZF4和未突变体蛋白丝的力学性能比较
[0051]
【权利要求】
1.一种类蛛丝蛋白，所述类蛛丝蛋白是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的η倍体，其中η为等于I或大于I的整数。
2.权利要求1所述的类蛛丝蛋白，其中所述类蛛丝蛋白是SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的3倍体、6倍体或其它整数倍体。
3.权利要求1所述的类蛛丝蛋白，其中所述类蛛丝蛋白的氨基酸序列为SEQID Ν0:3。
4.权利要求1所述的类蛛丝蛋白，其中所述类蛛丝蛋白的氨基酸序列为SEQID Ν0:7。
5.一种生物合成权利要求1所述的类蛛丝蛋白的方法，所述方法包括下述步骤: (1)根据权利要求1所述类蛛丝蛋白的氨基酸序列人工合成相应的核苷酸序列，并针对要用于表达的宿主进行密码子优化； (2)将步骤(I)合成的密码子优化的核苷酸序列重组到适当的表达载体中，然后克隆到所述宿主的细胞中，筛选得到工程重组宿主细胞； (3)培养步骤(2)得到的所述工程重组宿主细胞，表达所述类蛛丝蛋白； (4)纯化得到所述类蛛丝蛋白。
6.权利要求5所述的方法，其中所述宿主为大肠杆菌。
7.权利要求6所述的方法，其中步骤(I)所述人工合成相应的核苷酸序列为SEQIDNO:8的η倍体，其中η为等于I或大于I的整数。
8.权利要求7所述的方法，其中步骤(I)所述人工合成相应的核苷酸序列为SEQIDNO:4 或 SEQ ID NO:6。
9.一种纤维，所述纤维由通过权利要求5所述的方法得到的类蛛丝蛋白通过纺丝获得。
10.由权利要求5所述的方法得到的类蛛丝蛋白的应用。
【文档编号】C07K14/435GK103833838SQ201210478545
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2012年11月22日
【发明者】咸漠, 张海波, 刘炜, 周凤丽 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所