一种从正常人血浆中提取纯化前白蛋白pa的方法
【专利摘要】本发明提供一种快速从正常人血浆中提取纯化前白蛋白（PA）的方法。包括以下步骤：1）人血浆中加入NaCl，充分溶解；2）用酚溶液处理，萃取富集含前白蛋白（PA）的组分；3）含前白蛋白（PA）的组分透析置换缓冲液；4)AKTA系统离子交换层析快速中度纯化PA；5)AKTA系统Sephacryl系列分子筛层析后续纯化PA；6）AKTA系统Superdex系列分子筛层析精细纯化PA；本发明的方法能够很好的分离PA，制备的PA具有非常高的纯度和活性，纯度可达98%以上，被倍比稀释64倍后仍能与抗血清发生清晰沉淀反应，且操作安全方便，提取周期短，适于工业化生产。
【专利说明】—种从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，具体涉及一种快速从正常人血浆中提取纯化前白蛋白(PA)的方法。
【背景技术】
[0002]前白蛋白(Prealbumin, PA)是肝脏细胞合成的一种血清蛋白质，由4个相同的亚基组成，分子量约55KD，消光系数(E280nm) 13.6，半衰期1.9天，电泳时迁移在白蛋白之前，故称为前白蛋白，主要生理功能是参与血清中甲状腺和视黄醇的运输，并具有胸腺激素活性，可通过促进篱淋巴细胞的成熟来增加机体免疫力。血清中前白蛋白的测定结果在临床上是反应肝功能和机体营养状态的重要指标，常见于营养不良者。由于前白蛋白半衰期很短，可以反映肝脏合成和分解代谢的轻微改变，其血清浓度降低的幅度与肝实质损害的程度密切相关，因此在临床上也常见于肝功能损伤、肝硬化、外伤及感染患者。临床上，把检测前白蛋白含量的变化作为衡量肝功能损害和营养不良的一种敏感可靠的指标。因此前白蛋白的提取纯化，在诊断中拥有良好的应用前景。对于前白蛋白已报道的分离纯化方法，大多是需要大量的血浆，步骤繁琐，操作复杂，难以用于生产用的常规操作和临床研究。EP0711786A2、US5310878A公开了一种纯化人血浆前白蛋白的方法，这一方法在特定环境下运用离子交换、免疫扩散、亲和层析、分子排阻层析以及多步缓冲液置换、浓缩等共计11步提取方法。然而，改方法步骤繁琐而复杂，从而目的蛋白得率降低，并且提取流程耗时较长，难于满足大规模工业化生产的需要。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计简便、快速提取纯化前白蛋白(PA)的方法。
[0004]本发明提供了一种从正常人血浆中提取纯化前白蛋白(PA)的方法。该方法包括下列步骤:
[0005]I)人血浆中加入NaCl，充分溶解；
[0006]2)用酚溶液处理，萃取富集含前白蛋白(PA)的组分；
[0007]3)含前白蛋白(PA)的组分透析置换缓冲液；
[0008]4) GE AKTA?快速蛋白层析仪purifierlOO系统离子交换层析快速中度纯化PA ；
[0009]5) AKTA系统Sephacryl系列分子筛层析后续纯化PA ；
[0010]6) AKTA系统Superdex系列分子筛层析精细纯化PA，得到高纯度的PA。
[0011]所述步骤I)的人血浆为健康人群捐献的正常人血浆，加入NaCl的浓度为5%~30% (w/v)，优选 10~25%，最适 20% ;
[0012]所述步骤2)中所使用的酚溶液包含但不限于甲酚、萘酚、氯酚、苯酚或石炭酸。
[0013]所使用的酚溶液的浓度范围在0.5^10% (w/v)，优选2~7%，最优选5.5% ；
[0014]所述步骤2)中萃取PA的方法步骤为将待处理血浆在磁力搅拌器的持续搅拌的条件下逐滴加入酚溶液，酚溶液的滴入速度为f 10毫升/分钟；
[0015]所述步骤2)中萃取PA的方法，血浆与酚溶液混合物在4°C下静置0.5^2小时，用高速离心机离心取出沉淀，留上清液，离心力为300(Tl2000g ；
[0016]所述步骤3中所使用的透析液为磷酸缓冲液，浓度范围l(Tl00mM，优选50mM;pH范围 7-10，优选 pH7.4 ；
[0017]步骤3)的含前白蛋白PA的组分透析方法为将组分装入截留分子量为8000-20000道尔顿的透析袋，浸入上述磷酸缓冲液中，4°C下每隔3飞小时更换缓冲液一次，更换次数5~8次；
[0018]所述步骤4中所使用的AKTA纯化系统为阴离子交换层析，层析柱的选择包含但不限于 HiTrap Q FF, HiPrep Q FF, HiPrep DEAE FF 或 HiTrap Capto Q FF，优选 HiTrapCapto Q FF ；
[0019]所述步骤4中阴离子交换层析的操作条件为:A液:50mM磷酸缓冲液，pH7.4 ;B液:50mM磷酸缓冲液、IM氯化钠溶液，pH 7.4 ;流速为f 3毫升/分钟；首先使用A液过3个柱床体积，得穿透峰一；后0~20% (v/v) B液过3个柱床体积得洗脱峰二 ；最后用20%~?00%Β液过3个柱床体积，得洗脱峰三；
[0020]所述步骤5中所使用的AKTA纯化系统为分子筛层析，层析柱的选择包含但不限于Sephacryl S-100、S-200、S-300 ；Sephadex G-100、G-200、G_300 ;SuperdexG-100、G-200 或G-300 ;优选 S印hacryl S-100 ；
[0021]所述步骤5中Sephacryl S-100分子筛层析的层析条件为:层析液:50mM磷酸缓冲液，pH 7.4 ;流速为1-3毫升/分钟；洗脱体积为1-2个柱床体积；
[0022]所述步骤6中所使用的AKTA纯化系统为分子筛层析，层析柱的选择包含但不限于Sephadex G-75、G_100、；Superdex G-75、G-100 ;优选 Superdex G-75。
[0023]所述步骤6中Sephacryl S-100分子筛层析的层析条件为:层析液:50mM磷酸缓冲液，pH 7.4 ;流速为1-3毫升/分钟；洗脱体积为1-2个柱床体积；
[0024]本发明的方法能够很好的分离PA，制备的PA具有非常高的纯度和活性，纯度可达98%以上，被倍比稀释64倍后仍能与抗血清发生清晰沉淀反应，且操作安全方便，提取周期短，适于工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1HiTrap Capto Q FF强离子交换层析纯化PA:中间主峰为含PA组分；
[0026]图2S印hacryl S200分子筛层析纯化PA图谱:第二峰为含PA组分
[0027]图3Superdex G75分子筛层析纯化PA图谱:中间主峰为含PA组分；
[0028]图4纯化后PA组分琼脂糖双扩散结果:中间孔:抗PA抗体；周围孔:自顶端逆时针方向:lmg/ml PA依次为:原倍、1: 2、1: 4、1: 8、1:16、1:32倍稀释；
[0029]图5BCA法测总蛋白含量拟合直线图谱:
[0030]X轴:标准蛋白浓度(微克/毫升)'Y轴:标准蛋白A570吸光度值；
[0031]拟合公式:y=0.0Ollx+0.1757;线性相关系数 R2=0.9928
【具体实施方式】[0032]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0033]以下原料市售得到。
[0034]实施例1:酚沉淀法富集PA
[0035]取100ml人血浆中溶解20g NaCl，充分溶解使NaCl溶解度达到20% (w/v);配置120ml的5.5% (w/v)的苯酚水溶液，通风橱内缓慢逐滴滴入，充分混匀，静置30min ；1000Og(8500转/分钟)离心15min后，弃去沉淀，保留上清液；上清液经0.8 μ m的水相滤头过滤后，装入透析袋，4°C透析(50mMPBS pH7.4) 48小时，每隔6~12小时更换一次透析液；
[0036]实施例2:强阴离子交换层析中度纯化PA
[0037]HiTrap Capto Q FF (美国GE医疗公司产品)强阴离子交换层析:A液(50mM磷酸缓冲液(pH7.4) ；B液(50mM磷酸缓冲液、IM氯化钠，ρΗ7.4)，待100ml待纯化组分泵入层析柱后，首先在ΑΚΤΑ?快速蛋白层析仪purifierlOO系统上用50ml A液冲洗层析柱，洗掉非特异性吸附的杂蛋白，然后设定程序，洗脱50ml的A、B混合液形成总体积为5个柱床体积的0~20% (v/v) B液(100%~80%Α液)的线性洗脱，除去杂蛋白，后用50ml (5个柱床体积)20%~100% B液(80%~0%Α液)线性洗脱，洗脱峰中含PA，收集PA洗脱液约45ml ；
[0038]实施例3:分子筛 层析精度纯化PA
[0039]首先用S印hacryl S200分子筛(美国GE医疗公司产品)层析柱中度纯化，纯化条件为:待纯化样品上样量约12ml，洗脱流速为I毫升/分钟，洗脱400ml(洗脱图谱见图2)，收集吸收峰二 30ml，弃峰一；
[0040]Superdex G75 (美国GE医疗公司产品)分子筛层析精细纯化，纯化条件为:待纯化样品上样量约5ml，洗脱流速为I毫升/分钟，洗脱250ml (洗脱图谱见图3)收集最大的吸收峰组分20ml，得到高纯度的前白蛋白。
[0041 ] 实施例4:纯化PA纯度的鉴定
[0042]将用Superdex G75 (美国GE医疗公司产品)分子筛层析精细纯化的蛋白组分含量用BCA法蛋白浓度定量试剂盒(ThermoFisher公司Pieirce1''BCA ProteinAssay Kit)检测；BCA法是世界上常用的蛋白浓度监测方法之一，参考文献:Smith，P.K.etal.Anal.Biochem.，150，76-85 (1985).拟合曲线后(见图 5)代入公式(y=0.0011χ+0.1757)测得纯化后组分总蛋白浓度为1.01mg/ml;
[0043]同时将用Superdex G75 (美国GE医疗公司产品)分子筛层析精细纯化的蛋白组分用市售上海复星长征医学科学有限公司生产的人载脂蛋白A/B定量检测试剂盒，在全自动生化检测分析仪(日立AU400)上检测，在全自动生化检测分析仪上检测，检测到PA含量为 0.997mg/ml;
[0044]PA 纯度为(0.997/1.01) *100%=98.7%
[0045]表1BCA法测总蛋白含量标准蛋白与待测蛋白的A5700D值
【权利要求】
1.一种从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤: O人血浆中加入NaCl，充分溶解； 2)用酚溶液处理，萃取富集含前白蛋白PA的组分； 3)含前白蛋白PA的组分透析置换缓冲液； 4)GE AKTA?快速蛋白层析仪purifierlOO系统离子交换层析快速中度纯化PA ； 5)AKTA系统S^hacryl系列分子筛层析后续纯化PA ； 6)AKTA系统Superdex系列分子筛层析精细纯化PA，得到高纯度的PA。
2.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤1)加入NaCl的浓度为5%~30% w/v，优选10~25%，最优选20%。
3.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤2)中所使用的酚溶液选自甲酚、萘酚、氯酚、苯酚或石炭酸；酚溶液的浓度范围为0.5%~10% w/v，优选2%~7%，最优选5.5%。
4.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤2)中萃取PA的方法步骤为将待处理血浆在磁力搅拌器的持续搅拌的条件下逐滴加入酚溶液，酚溶液的滴入速度为1-10毫升/分钟；血浆与酚溶液混合物在4°C下静置0.5^2小时，用高速离心机离心取出沉淀，留上清液，离心力为3000-l2000g。
5.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤3)中所使用的透析液为磷酸缓冲液，浓度范围l0-l00mM，优选50mM;pH范围7_10，优选pH7.4。
6.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤3)含前白蛋白PA的组分透析方法为将所述组分装入截留分子量为8000-20000道尔顿的透析袋，浸入上述磷酸缓冲液中，4°C下每隔3飞小时更换缓冲液一次，更换次数为5、次。
7.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤4)中所使用的AKTA纯化系统为阴离子交换层析，层析柱选自HiTrap Q FF、HiPr印Q FF, HiPrep DEAE FF 或 HiTrap Capto Q FF，优选 HiTrap Capto Q FF。
8.根据权利要求7所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤4)中阴离子交换层析的操作条件为:A液:50mM磷酸缓冲液，pH 7.4 ；B液:50mM磷酸缓冲液、IM氯化钠溶液，pH 7.4 ;流速为f 3毫升/分钟；首先使用A液过3个柱床体积，得穿透峰一；后0-20%Β液过3个柱床体积得洗脱峰二 ；最后用20%~?00%Β液过3个柱床体积，得洗脱峰二。
9.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤5)中所使用的AKTA纯化系统为分子筛层析，层析柱选自S^hacryl S-100、S-200、S-300 ；Sephadex G-100、G-200、G-300 ；Superdex G-100、G-200 或 G-300 ；优选Sephacryl S-1OO ;分子筛层析的层析条件为:层析液:50mM磷酸缓冲液，pH 7.4 ;流速为1-3毫升/分钟；洗脱体积为f 2个柱床体积。
10.根据权利要求1所述的从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步骤6)使用的AKTA纯化系统为分子筛层析系统，层析柱选自Sephadex G-75、G_100、Superdex G-75 或 G-100 ;优选 Superdex G-75 ;所述步骤 6 中 Sephacryl S-1OO 分子筛层析的条件为:层析 液:50mM磷酸缓冲液，pH7.4 ;流速为1~3毫升/分钟；洗脱体积为1~2个柱床体积。
【文档编号】C07K1/18GK103833843SQ201210489310
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2012年11月27日
【发明者】张海涛, 张跃建, 孙卫兵, 高晓猛 申请人:上海复星医药（集团）股份有限公司, 上海复星长征医学科学有限公司