专利名称：：鼠疫疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗鼠疫耶尔森氏菌感染的保护性新疫苗以及这些疫苗的接种方法。本发明特别提供非肠道吸收的活性疫苗和口服的活性疫苗，这些疫苗能提供抗腺鼠疫和肺鼠疫的保护作用。特别是通过这些疫苗在人和动物中诱导粘膜免疫。鼠疫耶尔森氏菌是在多种动物包括人中引起鼠疫的毒性很强的病原微生物。感染这种微生物有很高的死亡率。研究表明，其强毒性是由染色体和三种质粒编码的多种因素复杂组合决定的，这些因素包括Lcr基因、溶纤维蛋白酶和荚膜。人类是这种疾病自然周期的一种偶然宿主，腺鼠疫可发生在被感染蚤叮咬之后，其特征是局部淋巴结肿大。腺鼠疫的一个并发症是继发性肺炎，在这种情况下，疾病很容易通过空气中的飞沫在人群中传播。鼠疫是南北美洲、非洲、中国和亚洲的一种地方性流行病(见Butler，(1983)《鼠疫和其它耶尔森氏菌感染》；PlenumPress，纽约)。这种疾病的最近暴发据信是其第四次世界大流行的一部分，因此很明显需要为在疫源区居住或旅行的人们以及操作这种细菌的实验室工作人员提供保护。现在用于预防鼠疫的全菌疫苗具有很高的异源性，产生的副作用限制了其广泛使用(如Meyer等，(1974)《传染病杂志》(J.InfectDis)第129卷增刊，13-18页和85-120页；Marshall等，(1974)《传染病杂志》(J.InfectDis)第129卷增刊，19-25页)。Cutter疫苗是正在使用的一种鼠疫疫苗，它含有用甲醛灭活的鼠疫杆菌，并通过肌肉注射进行接种。但是非肠道免疫接种，虽然能有效地诱导全身免疫，却不能有效地诱导粘膜免疫(McGhee等，(1992)《疫苗》(Vaccine)第10卷，75-88页)，并且有报导说在疫苗接种者中发现了肺鼠疫病例(Meyer(1970)WHO简报42卷653-666页)。迄今为止，没有任何能够在粘膜表面产生保护性免疫应答的疫苗获得报导。虽然活的EV76减毒疫苗在人体中激发免疫应答的效果值得怀疑(Meyer等，(1974)《传染病杂志》(J.Infect.Dis.)129卷增刊13-18页)，但这种疫苗自1939年起就在前苏联进行了广泛的检测和使用。人们已发现EV76在多种动物种群中毒性各不相同，而且非人灵长类动物对这种菌株的慢性感染非常敏感。在西方，由于其非常严重的副作用和毒性回复的可能性，这种疫苗被认为不适于大规模免疫接种。两种已知的鼠疫耶尔森氏菌抗原为鼠疫耶尔森氏菌LcrV(V抗原)和F1抗原，已经发现这两种抗原都能在动物中引起保护性免疫应答。本发明的发明者在此之前已经提供了分别能表达V抗原和F1抗原的口服活疫苗，它们都能在用103cfu的鼠疫耶尔森氏菌攻菌时提供良好的保护作用。这些疫苗是共同未决的专利申请PCT/GB94/02818和GB9404577.0的内容。本发明的发明者惊奇地发现只有危险性难以接受的EV活疫苗显示能在用109cfu或更多的鼠疫耶尔森氏菌GB菌株攻击时提供良好的保护作用，单独的V抗原和F1抗原仅能在用105cfu的鼠疫耶尔森氏菌攻菌时提供完全的保护作用，用含有V抗原和F1抗原的组合疫苗接种至少能达到EV76提供的保护水平，并且不具备任何妨碍EV疫苗广泛使用的那些危险性。更有利的是，他们发现用于接种的载剂仅是这两种蛋白组分的简单混合物，而不是更复杂的完整的减毒有机体。为了提供长期保护作用和产生粘膜免疫，他们提供在活的减毒疫苗中含有这两种抗原组分的优选疫苗形式，例如表达F1和V抗原的AroA和C伤寒沙门氏菌(参考上文提到的共同未决的专利申请)；更优选的疫苗形式为分别表达这两种抗原或表达包含这两种抗原的融合蛋白的单个或双重突变减毒疫苗。本发明进一步提供一类微生物，这类微生物携带含有F1和V两种抗原的构建物或上文所述共同未决的申请中的质粒，包括能转化人或动物肠道定居微生物的构建物，因此这些微生物能够表达分别与F1和V抗原序列相同的蛋白质；当这类微生物通过口服或非肠道途径接种时，就会在人或动物体中产生抵抗鼠疫耶尔森氏菌的保护性免疫应答。优选的方案是使微生物保持在人或动物肠道中定居的能力。特别优选的重组DNA、质粒或人或动物的肠道定居微生物能够编码或表达鼠疫耶尔森氏菌的完整成熟V蛋白或其保护性表位，及能够编码或表达鼠疫耶尔森氏菌的完整成熟F1蛋白或其保护性表位。编码完整或部分F1抗原的DNA和编码完整或部分V抗原的DNA可直接用作基因疫苗。特别优选的编码V抗原的重组DNA包含SEQIDNo.1或SEQIDNo.3列出的DNA序列，更优选与一个启动子如lacz或nirβ位于同一阅读框，并优选存在于一个能在沙门氏菌中复制与表达的载体上。特别优选的编码F1抗原的重组DNA包含SEQIDNo.10中列出的DNA序列。SEQIDNo.2和SEQIDNo.4显示了两种优选V抗原蛋白的氨基酸序列；SEQIDNo.2为V抗原自身的序列，而SEQIDNo.4为在N末端带有四个载体决定氨基酸的V抗原序列。SEQ1DNo.11是由SEQIDNo.10编码的F1蛋白序列。在本发明的微生物体中使用的优选DNA构建物允许微生物体进行繁殖，用这样的微生物口服接种能够诱导肠相关淋巴组织(GLAT)的局部刺激，并通过淋巴细胞在共同粘膜免疫系统中迁移而对支气管相关淋巴组织(BALT)产生继发性刺激。通过这种方式在呼吸道粘膜表面产生分泌型IgA应答。用含这种DNA的载体转化或直接用这种DNA插入整合所提供的微生物优选为减毒的微生物，更优选的是减毒的沙门氏菌。减毒微生物如鼠伤寒沙门氏菌已证明是多种异源抗原的优良载体(Curtiss，(1990)；Cardenas和Clements，(1992))。减毒可通过多种途径进行，例如可以采用aroA和/或aroC突变途径(见Hosieth等(1981)《自然》(Nature)291卷，238-239页；Dougan等(1986)《寄生虫免疫》(ParasiteImmunol)第9卷，151-160页；Chatfield等(1989)《(疫苗》(Vaccine)第7卷，495-498页)；多重突变如Hone等在(1991)《疫苗》(Vaccine)第9卷810-816页介绍的aroA和aroC突变体也可以使用。任何合适的符合安全要求的缺陷微生物都可以使用。对上述微生物以及其它微生物来说，还有多种类似的缺失或突变减毒方法，使它们适合于用本发明的构建物进行转化并在动物的肠道内表达疫苗蛋白和/或定居，从而用来治疗鼠疫耶尔森氏菌。对人来说，含有本发明的构建物的疫苗载体放在减毒伤寒沙门氏菌内，转化后的微生物用作口服活疫苗中的活性成分。当DNA以直接插入微生物DNA的方式转化减毒微生物时，可能直接整合进一个基因。而当换成表达V蛋白或F1蛋白或其表位片段的质粒形式时，就可能只有V或F1或其片段获得表达，或者上述抗原或其片段与一个前位蛋白或肽段组成融合蛋白进行表达，优选包含另一个抗原性F1/V组分。这种前位蛋白或肽段可以促使成熟蛋白或肽穿过细胞膜外运或者是另一个鼠疫耶尔森氏菌抗原。lcr基因是Price等人从鼠疫耶尔森氏菌KIM菌株中克隆得到的，其核苷酸序列发表在《细菌学杂志》(JBacteriol)(1989)171卷5646-5653页。在下面的实施例中这一序列的信息被用来设计寡核苷酸引物，用于从鼠疫耶尔森氏菌(菌株GB)中用聚合酶链反应(PCR)扩增该基因。所设计的PCR引物分别与lcrV基因的5’端和3’端两翼的相应序列互补，并且在引物的5’尾端含有一个限制内切酶识别位点，使扩增的lcrV基因可以直接克隆到一个质粒载体上(5’端PCR引物含有一个EcoRI位点，而3’端PCR引物含有一个SacI位点)。这两种限制酶切位点仅用作举例而不能视为排除其它的限制内切酶。在下面的实施例中，本发明的构建物含有一个lac启动子，但其它的启动子如巨噬细胞启动子(nirβ)也可以使用。F1的制备已由Oyston等人(1995)在《感染与免疫》(Infect.Immun.)63卷第2期563页中作了详细介绍—见564页结果的下面caf1的克隆和表达。疫苗中抗原组分的剂量可依动物个体的免疫特征而不同。但在对下面实施例的小鼠动物模型进行免疫接种时，我们发现V和F1的每次剂量为10ug时，按标准的初次免疫和加强免疫程序能够有效地提供完全的保护作用。抗原可与一种传统的可以药用的载剂混合，这里没有特别的限制。通常将抗原混合到一种水包油乳剂中。疫苗组合物可含有佐剂，福氏不完全佐剂IFA在处理小鼠模型时特别有效。当疫苗以微生物体为基础时，所用的载剂可为一种适于非肠道接种特别是腹膜内接种的载剂，而不一定是口服载剂。还可用微滴或被囊形式的载剂例如脂质体或微囊体进行接种，它们可以有效地将组合物运送至个体的呼吸道，从而引发粘膜免疫应答。载剂还可含有延迟释放系统如氢氧化铝凝胶。另一种包被方法包含使用聚合结构，特别是线性嵌段共聚物。也可以使用生物降解性聚合物，如含有或不含有羟基乙酸的聚乳酸或嵌段共聚物；它们可包含下列重复单位(POP-POE)n，其中POP是聚氧丙烯，POE是聚氧乙烯。含有(POP-POE)n的嵌段共聚物特别有用。本发明的方法、构建物、微生物和疫苗将用下面的序列表、图和实施例举例说明。由此更进一步的实施方案对本领域的技术人员来说是显而易见的。图1是用条图来说明多组动物在用鼠疫耶尔森氏菌攻菌时的存活率。图2是用曲线来说明在Balb/c小鼠中肌肉接种BSA后的IgG初次应答。序列表SEQIDNo1显示一个编码V抗原并带有克隆载体pMAL-p2或pMAL-c2六个碱基的DNA的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列，该DNA在上述载体中克隆时，5’用序列为GAATTC的EcoRI位点(来自5’端PCR引物)；3’用序列为GTCGAC的SalI位点(来自3’端PCR引物)。该DNA1006位的碱基用PCR诱变的方法改变成T，从而产生了第二个框内终止密码子。氨基酸序列的起始部分是Xa因子切割位点的C末端。SEQIDNo2显示本发明的插入DNA片段表达的多肽的氨基酸序列，并在N末端带有载体(IE+FS)编码的四个额外氨基酸。SEQIDNo3显示本发明的第二个编码V抗原的DNA核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列，该DNA带有克隆载体pGEX-5X-2的10个碱基。该DNA在载体中克隆时，5’用序列为GAATTC的EcoRI位点(GA来自5’端PCR引物)；3’用序列为GTCGAC的SalI位点(GTCGAC来自3’端PCR引物)。第1006位的碱基用PCR诱变的方法产生了第二个框内终止密码子；第16位的碱基由A换成C，产生了一个EcoRI位点。氨基酸序列的起始部分是Xa因子切割位点的C末端。SEQIDNo4显示SEQIDNo3DNA表达的多肽的氨基酸序列，并在N末端带有载体(G、I、P和G)编码的4个氨基酸。SEQIDNo5显示用来产生SEQIDNo1中V抗原编码DNA的5’端寡核苷酸引物序列。SEQIDNo6显示用来产生各实施例中所用的V抗原编码DNA的3’端寡核苷酸引物序列。SEQIDNo7显示与编码成熟caf1的前21个碱基相对应并在5’端带有一个SacI位点的PCR寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNo8显示与编码caf1终止密码子下游“茎环”结构的序列相对应并在5’端带有SacI和AccI位点的PCR寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNo9显示与第一个寡核苷酸的末端至下游107个碱基的caf1基因内部终止区域相对应的PCR寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNo10显示pFGAL2a构建物的核苷酸序列，这个序列显示了载体上β-半乳糖苷酶的前几个碱基与去掉信号肽序列的caf1相融合，并在5’端含有一个SacI限制酶切位点；这个序列一直显示到caf1的AACC3’端并附带了一些载体碱基。SEQIDNo11显示pFGAI2a编码的蛋白质的氨基酸序列。这一序列可前导有Met、Thr、Met、Ile、Thr、Asn。SEQIDNo12是用于扩增F1操纵子的引物FIOU2的序列。SEQIDNo13是用于扩增F1操纵子的引物M4D的序列。SEQIDNo14是用于扩增F1操纵子的引物M3U的序列。SEQIDNo15是用于扩增F1操纵子的引物FIOD2的序列。SEQIDNo16是一个编码F1-V融合蛋白的DNA片段的核苷酸序列及由其推导的氨基酸序列。在该DNA片段的5’端有一个SacI克隆位点，在其3’端有一个HindIII克隆位点。克隆的插入片段含有一段452-472序列，其碱基来源于PCR引物(鼠疫耶尔森氏菌DNA中不含这段序列)。SEQIDNo17是SEQIDNo16的氨基酸序列。SEQIDNo18是引物5’FAB2的序列，该引物用于扩增含有信号序列的F1操纵子。SEQIDNo19是引物3’FBAM的序列，该引物用于扩增含有信号序列的F1操纵子。SEQIDNo20是用SEQIDNo18和SEQIDNo19中引物扩增得到的含有信号序列的F1抗原的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDNo21是SEQIDNo20的氨基酸序列。SEQIDNo22是包括一个六氨基酸连接区域的F1/V融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列。其中1522位的T是由G修饰而成，从而产生了第二个框内终止密码子。SEQIDNo23是SEQIDNo22的氨基酸序列。SEQIDNo22中所说的连接区域位于171-176位氨基酸(SEQIDNo22的523-540位碱基)。SEQIDNo24显示用于产生SEQIDNo3中V抗原编码DNA的一个5’端寡核苷酸引物序列。实施例克隆SEQIDNo3材料与方法用于制备培养基的材料获自Oxoid公司和Difco实验室。DNA操作所用的酶获自BoehringerMannheimUK公司，并按产品说明进行操作。其它的化学药品和生物化学药品除非另行说明都获自Sigma化学公司。特异性的兔多克隆抗V血清和鼠抗GST血清分别由RBrubaker博士(密执安州立大学微生物系)和EDWilliamson博士(化学和生物防御局)提供。菌株及培养鼠疫耶尔森氏菌GB在液体培养基中28℃通气培养，所用的培养基(PH6.8)每升含有15g蛋白胨、2.5g肝脏水解物、5g酵母抽提物和5gNaCl，并补加80ml0.25％用0.1MNaOH溶解的氯化血红素(血肉汁)。大肠杆菌JM109按Sambrook等在《分子克隆实验指南》中介绍的方法培养与保存。重组V蛋白和F1蛋白的制备DNA操作，从鼠疫耶尔森氏菌中分离染色体DNA按Marmur的方法进行。重组V抗原的制备编码V抗原的基因(lcrV)用聚合酶链反应(PCR)从鼠疫耶尔森氏菌DNA中扩增，所用的引物浓度为125pmol并与该基因5’端和3’端序列同源(见Price等(1989)《细菌学杂志》(J.Bacteriol)171卷5646-5653页)。5’引物(V/5’EGATCGAATTCGAGCCTACGAACAA)和3’引物GGATCGTCGACTTACATAATTACCTCGTGTCA)的序列分别还含有编码EcoRI和SalI限制酶切位点的5’区域。另外，对发表的lcrV序列(Price等，1989)的两个核苷酸进行了改变，使EcoRI酶切位点完整并使扩增的基因编码一个额外的终止密码子(TAA)。PCR引物用DNA合成仪(392AppliedBiosystems)制备。经过30个循环的扩增(95℃、20秒；45℃、20秒；72℃、30秒Perkin9600GeneAmpPCRSymtem)获得了一个DNA片段。将片段纯化，用EcoRI和SalI消化，并与适当消化的pGEX-5X-2质粒连接，然后电穿孔转化到大肠杆菌JM109中(见Sambrook等1989)。用30聚体引物(5’核苷酸位于54和794位，见Price等1989)通过PCR鉴定到了一个带有重组质粒(pVG100)的克隆，还扩增到lcrV的一个内部片段。rV在大肠杆菌中的表达。大肠杆菌JM109/pVG100在含有100μgml-1的氨苄青霉素的LB中37℃培养至光吸收值(600nm)为0.3。然后在培养物中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，继续培养5小时。细菌的全细胞裂解物按Sambrook等介绍的方法制备，GST/V融合蛋白的表达用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Mini-ProteanII，BioRad)电泳后考马斯亮蓝R250染色和Western印迹法(见Sambrook等)进行检测。Western印迹使用的探针为1/4000稀释的兔抗V血清或1/1000稀释的鼠抗GST血清，蛋白条带用胶体金标记的二抗进行显色(AuroprobeBlplus，Cambio)。体外GST/V表达的定量。含有pVG100或pGEX-5X-2的大肠杆菌JM109如上所述进行培养。从对数生长期和稳定期的培养物中各取若干份样品，每份均为1ml，接种在含有氨苄青霉素的L-琼脂中，测定活细胞数量。另取1ml培养物离心收集细胞，并用1ml的磷酸盐缓冲液(PBS)重新悬浮。将重新悬浮的细胞在-20℃冷冻1小时，融化后在冰浴中超声破碎，超声破碎时温度应低于10℃，共进行3×30秒(XL2015型超声仪，3.2mmMicrotipprobe；HeatSystemInc.)。在微量滴定板中用PBS对超声物和一个rV标准溶液(5μgml-1)作梯度稀释并4℃包被过夜。每次超声产物中GST/V融合蛋白的量以兔抗V血清作一抗用标准的ELISA进行测定。抗体温育在含1％脱脂奶粉的PBS中。大肠杆菌rV的纯化。JM109/pVG100按上面所述的方法用5×100ml体积的LB进行培养。离心收集细胞，并用3ml磷酸盐缓冲液(PBS)重新悬浮。加入80ul溶菌酶(10mgml-1)，22℃温育10分钟。在细胞悬浮物中加入TritonX-100至终浓度为1％，并将其冷冻(-20℃)，融化后在冰上用70％的功率超声破碎3×30秒(XL2015型超声仪)。细胞裂解物离心，用PBS将上清调整至30ml，并与5ml的谷胱甘肽Sepaharose4B(PharmaciaBiotech)混合，谷胱甘肽Sepaharose4B在使用前用PBS+0.1％TritonX-100洗涤三次。混合物在4℃搅拌18小时，离心并用100mlPBS洗涤两次。然后调成50％的悬液装入层析柱(Poly-Prep；Bio-rad)。GST/V融合蛋白用10ml含5mM还原性谷胱甘肽(PharmaciaBiotech)的50mMTrispH8.0洗脱。用PBS透析后，融合蛋白用Xa因子(BoehringerMannheimUK公司)按产品说明在22℃切割18小时。按上面介绍的方法用亲和层析方法将切割下来的GST和未切割的多余GST/V从溶液中去除，剩下的即为纯化的重组V(rV)。用rV免疫接种。本试验使用特殊无菌条件下饲养的6周龄雌性Balb/c小鼠(Charles.RiverLaboratories，Margate，Kent，UK)。16只一组的小鼠用腹膜内注射法(i.p.)进行初次免疫，免疫剂量为0.2ml，其中含有10.13ug的rV抗原并与福氏不完全佐剂(IFA)一起溶于1∶1油包水乳剂中。在第14天和第34天，按上述剂量对每只小鼠进行加强免疫。在第64天，取6只小鼠处死，取出其组织按下面的方法做免疫学分析。剩下的小鼠用鼠疫耶尔森氏菌进行攻菌。含16只同龄小鼠的非处理对照组按相同的方法分组进行组织取样和攻菌。在后面测定对高剂量鼠疫耶尔森氏菌攻菌的保护程度的试验中，使用含5或6只小鼠的rV免疫组和对照组。血清抗体滴度的测定。用心脏穿刺采血法从用0.1ml含6mgDomitor(NordenLaboratories)和27ugKetalar(Parke-Davies)的混合物腹膜麻醉的小鼠中采集血样。集中血样并分离血清。血清抗体滴度用一种改进的ELISA法(Willamson和Tiball，(1993)《疫苗》(Vaccine)11卷1253-1258页)进行测定。简单地说，将rV(5μgml-1的PBS溶液)包被在微量滴定板中，待测血清在板上做梯度倍比稀释。结合的抗体用过氧化物酶标记的抗鼠多价抗体结合物进行检测。特异性抗体的滴度用减去非特异性对照血清的光吸收值后吸收值仍大于0.1单位的血清的最大稀释度来估算。从脾脏中分离纯化的T细胞。混合脾细胞的粗制悬液用脾脏在细线筛上轻轻碾磨进行制备。用2ml的组织培养液(含20mM的L-谷氨酰胺，105U1-1青霉素和100mgl-1链霉素的DMEM)从脾被膜组织和结缔组织中洗出细胞。在Ficoll-Hypaque(淋巴细胞分离液，ICNFLOW)中密度梯度离心分离脾细胞悬液中的混合淋巴细胞群体。用吖啶橙(0.0003％w/v)和溴化乙啶(0.001％w/v)染色测定制备物中活细胞的百分比。混合淋巴细胞与羊抗鼠IgG包被的Dynabeads(M450，DynalUK)按1∶3的比例混合，在4℃保温30分钟。与Dynabead连接的B细胞用磁力分离的方法去除，剩下的T细胞按接种到微量滴定板上所需的细胞浓度用补加有抗生素和10％v/v胎牛血清(FCS)的DMEM悬浮。抗rV脾细胞粗制备物和纯化T细胞的体外增殖。在微量滴定板的小孔中用DMEM对rV和伴刀豆球蛋白A(阳性对照)做倍比稀释(范围为0-50μgml-1)，每孔中剩余0.1ml。阴性对照仅含0.1ml的DMEM。将等体积的脾细胞粗制备物或纯化T细胞悬液按最小浓度为5×104个细胞接种到每个小孔中，37℃(5％CO2)温育72小时。在每孔中加入30ul含1uCiH3胸腺嘧啶(甲基[3H]胸腺嘧啶S.A.74GBqmmol-1；Amersham)并补加有10％FCS的DMEM，继续温育24小时。小孔中的内容物用细胞收集器(Titertek)收集到玻璃纤维滤膜上，将对应于每个小孔的园盘从滤膜垫上打孔取出，加到1.5ml闪烁液(Cyoscint，ICNBiomedicalsInc.)中测定细胞中H3胸腺嘧啶的掺入。细胞刺激指数可用四次重复试验的平均cpm(刺激后)/平均cpm(阴性对照)进行计算。重组F1抗原的制备。克隆caf1DNA用Marmur等(1961)在《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)第3卷208-218页介绍的方法从鼠疫耶尔森氏菌中分离。用聚合酶链反应(PCR)从中扩增到一段编码cafl的开放阅读框但缺少信号序列的DNA片段。PCR中所用的寡核苷酸用Beckman200ADNA合成仪制备。pFGAL2a的构建。寡核苷酸GATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC(SEQIDNo7)根据cafl中紧接信号肽编码序列的前21个碱基进行合成，并在5’端含有一个编码SacI位点的额外区域，互补寡核苷酸CAGGTCGAGCTCGTCGACGGTTAGGCTCAAAGTAG(SEQIDNo8)对应于编码caf1终止密码子下游推测“茎环”结构的序列，并在5’端加上了一个编码SacI和AccI位点的区域。经过35个循环的扩增(95℃、15秒；50℃、15秒；72℃、30秒，使用PerkinElmer9600GeneAmpPCRSystem)获得了一个DNA片段。将片段纯化，用SacI和AccI消化，与同样消化的pUC18质粒连接，然后电穿孔转化到大肠杆菌JM109中。电穿孔用BioradGenePulser进行，使用0.2cm的样品杯，反应条件为1.25kV、25μF、800Ohms，持续时间为20。用PCR的方法鉴定了一个含有caf1克隆基因的pFGAL2a菌落，PCR所用的寡核苷酸探针为TGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTAT(SEQIDNo9)，这一序列与caf1基因上从已鉴定的信号序列切割位点(见Galyov等(1990))开始第128-153位核苷酸的内部序列和SEQIDNO2一致。携带pFGL2a并表达F1的大肠杆菌在含有1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB肉汤中37℃振荡培养18小时。细菌的全细胞裂解物、周质和胞浆按Sambrook等(1989)介绍的方法制备。SDS-PAGE和Western印迹SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹按Hunter等(1993)在《感染与免疫》(Infec.Immun.)61卷3958-3965页中介绍的方法进行。印迹所用的探针是用灭活的鼠疫耶尔森氏菌(37℃培养的EV76菌株)在绵羊(B283)中制备的多克隆抗血清，结合的抗体用辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊IgG(Sigma)进行检测。组合V/F1疫苗的实施例1和实施例2比较实施例用鼠疫耶尔森氏菌(GB)菌株攻菌时疫苗对小鼠死亡率的影响动物Barrierbred6周龄雌性无菌Balb/c小鼠获自Charles-RiverLaboratories，Margate，Kent，UK，在下面各实施例中全部使用这种小鼠。免疫接种5或6只小鼠分为一组按下述方法进行免疫接种。比较疫苗EV76共50只小鼠在免疫程序的第0天接受单一的初次皮下接种(s.c.)，接种剂量为总体积100ul的EV76活疫苗。比较疫苗CutterUSP疫苗另取50只小鼠接受剂量为100ulCutter疫苗的初次免疫接种，接种方式为肌肉接种(i.m.)，这一剂量相当于人接种剂量的0.2，并含大约2×108甲醛灭活的鼠疫杆菌。在初次接种后的第16天对每只动物进行相同剂量的加强免疫。F1和V疫苗对一组62只小鼠腹膜(i.p)接种初次免疫剂量的重组V抗原或F1抗原，上述抗原溶解在1∶1油包水乳剂中并含有福氏不完全佐剂(IFA；Sigma)。两种抗原的初次免疫剂量均为10ug，接种乳剂的总体积为0.1ml。免疫动物在初次接种后的第14天(V和F1实验组)和第28天(所有F1实验组和含12只动物的V亚组)用相同的抗原进行加强免疫。另取一组12只小鼠分别在第0、14和28天进行初次免疫和加强免疫，免疫剂量为10ugF1抗原和10ugV抗原，两种抗原组合在含有IFA的1∶1油包水乳剂的水相中(终体积为每只小鼠0.1ml)。在免疫过程的第50天，从每个处理组中随机取6只小鼠做脾细胞应答分析。剩下的动物用鼠疫耶尔森氏菌进行攻菌。没有进行处理的同龄小鼠对照组也进行相同的划分。多倍LD攻菌来确定保护的极限将免疫小鼠和未处理的对照小鼠分为5或6只一组，用鼠疫耶尔森氏菌GB菌株经皮下途径进行攻菌，攻菌剂量的范围为20至2×109活菌数。密切观察小鼠在攻菌后14天内的症状发展，并仔细记录死亡的确切时间。对攻菌后的死亡小鼠进行尸检，取血涂片、肝和脾进行细菌学分析。对照和试验动物的攻菌结果列于下表1；两组结果分别对应于两轮实验和各自的对照。从下面的结果可明显看出，V抗原比Cutter疫苗有效得多，虽然不如EV76有效，但当它与效果稍差一些的F1抗原组合应用时，其效果与EV76相当并且没有副作用。表1*＝实施例1**＝实施例2实施例3用于口服疫苗的减毒沙门氏菌的制备在鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌中表达重组V抗原。扩增后的lcrV基因克隆到三种不同的质粒载体中pMAL-p2一个设计用于使克隆基因与麦芽糖结合蛋白(MBP)形成融合产物的载体。MBP的C末端与V抗原的N末端融合。表达产生的融合蛋白分泌到周质中。含V抗原DNA序列的载体被命名为pVMP100。pMAL-c2一个与pMAL-p2类似的载体，差别在于MBP-V抗原融合蛋白在细胞质中表达。这一重组质粒被命名为pMVC100。pGEX-5X-2一个设计用于以谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白形式表达克隆基因的载体。GST的C末端与V抗原的N末端融合，融合蛋白表达在细胞质中。这一重组质粒被命名为pVG100。上述三种质粒均含有Ptac启动子和lacIQ基因，后者在大肠杆菌中编码能关闭Ptac转录起始的lac抑制物，IPTG可解除这种抑制作用。这三种质粒均含有来自pBR322的复制起点，因而能在细菌中低拷贝复制。上述三种质粒都用电穿孔的方法转到鼠伤寒沙门氏菌SL3261菌株中，该菌株为一株减毒菌株，广泛用作表达外源抗原的活疫苗载体。SL3261的aroA基因有特异性缺失，使其生长依赖于特定的芳香族化合物(见Hosieth等)。为制备适用于人体的疫苗，用电穿孔的方法将载体转入减毒的伤寒沙门氏菌中。用特异性抗V抗原多克隆抗血清作探针对鼠伤寒沙门氏菌培养物做western印迹，结果显示，所有重组质粒均表达V抗原。该抗血清由密执安州立大学微生物系(Eastlansing，MI48824-1101，USA)的RBrubaker提供。重组鼠伤寒沙门氏菌按5×107cfu/剂经静脉接种到小鼠中，结果显示该菌能高水平定居于肝脏和脾脏；每个器官可回收8×106到5×108cfu的细菌。回收细菌大多数仍具有氨苄青霉素抗性，这表明细菌保留有重组质粒。在鼠伤寒沙门氏菌中表达F1抗原质粒pFGAL2a用Sambrook等人(Sambrook等，《分子克隆实验手册》(MolecularCloning；aLaboratoryManual)第二版，冷泉港实验室，纽约)介绍的通用技术分离。纯化好的质粒用电穿孔的方法转入鼠伤寒沙门氏菌LB5010(限制-，修饰+)中，然后从LB5010中分离甲基化的pFGAL2a，并电穿孔到鼠伤寒沙门氏菌SL3261(aroA-)中。制备周质部分和胞质部分，用前面介绍的方法进行SDS-PAGE和Western印迹。构建物的稳定性5只Balb/c雌性小鼠用静脉接种的方法接种5×105或5×107cfu保存于200ul磷酸盐缓冲液并携带pFGAL2a的鼠伤寒沙门氏菌。对照小鼠按相似的方法接种携带不含插入片段的pUC18的鼠伤寒沙门氏菌。7天后用断颈椎法将小鼠处死，取出肝脏和脾。将取出的器官在10ml的磷酸盐缓冲液中用stomacher设置到最大匀浆2分钟，匀浆物用磷酸盐缓冲液做梯度稀释并涂布到L琼脂平板或含55μgml-1氨苄青霉素的L琼脂平板上。F1操纵子的构建用PCR方法一次性扩增完整的F1操纵子没有获得成功。因此设计了一个构建策略，用PCR方法从鼠疫耶尔森氏菌MP6菌株的模板DNA中扩增了两个不连续的大小分别为336kb和1.89kb的片段，所用的引物对分别为(A)SEQIDNo12和SEQIDNo13序列和(B)SEQIDNo14和SEQIDNo15序列。模板DNA使用未经CsCl2纯化的按Marmur方法制备的DNA抽提物。PCR所用的条件为96℃30秒、57℃30秒和72℃1分钟，共进行30个循环。两个片段用Nhel消化后连接。融合后的片段编码全长的操纵子(5.25kb)，将此融合片段用EcoRI和SalI消化后克隆到多种载体上。当这一片段克隆到pBR322上并在大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌LB5010或SL3261中表达时，发现重组质粒不稳定。为解决这个难题，将操纵子克隆到了一个低拷贝kmR质粒pLG339上。另外还将全长的F1操纵子用载体pBRD1084插入到鼠伤寒沙门氏菌染色体的AroC基因上。序列表(1)一般信息(i)申请人SECRETARYOFSTATEFORDEFENCE(ii)发明名称疫苗(iii)序列数24(iv)通讯地址(A)联系人SECRETARYOFSTATEFORDEFENCE(B)街道WHITEHALL(C)城市伦敦(D)州伦敦(E)国家UNITEDKINDOM(GB)(F)邮政编码SW1A2HB(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，#1.30版(vi)现申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)长度1014碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物鼠疫耶尔森氏菌(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..987(xi)序列表述SEQIDNO1ATTTCAGAATTCATTAGAGCCTACGAACAAAACCCACAACATTTTATT48IleSerGluPheIleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIle151015GAGGATCTAGAAAAAGTTAGGGTGGAACAACTTACTGGTCATGGTTCT96GluAspLeuGluLysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySer202530TCAGTTTTAGAAGAATTGGTTCAGTTAGTCAAAGATAAAAATATAGAT144SerValLeuGluGluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAsp354045ATTTCCATTAAATATGATCCCAGAAAAGATTCGGAGGTTTTTGCCAAT192IleSerIleLysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsn505560AGAGTAATTACTGATGATATCGAATTGCTCAAGAAAATCCTAGCTTAT240ArgValIleThrAspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyr65707580TTTCTACCCGAGGATGCCATTCTTAAAGGCGGTCATTATGACAACCAA288PheLeuProGluAspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGln859095CTGCAAAATGGCATCAAGCGAGTAAAAGAGTTCCTTGAATCATCGCCG336LeuGlnAsnGlyIleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerPro100105110AATACACAATGGGAATTGCGGGCGTTCATGGCAGTAATGCATTTCTCT384AsnThrGlnTrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSer115120125TTAACCGCCGATCGTATCGATGATGATATTTTGAAAGTGATTGTTGAT432LeuThrAlaAspArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAsp130135140TCAATGAATCATCATGGTGATGCCCGTAGCAAGTTGCGTGAAGAATTA480SerMetAsnHisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeu145150155160GCTGAGCTTACCGCCGAATTAAAGATTTATTCAGTTATTCAAGCCGAA528AlaGluLeuThrAlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGlu165170175ATTAATAAGCATCTGTCTAGTAGTGGCACCATAAATATCCATGATAAA576IleAsnLysHisLeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLys180185190TCCATTAATCTCATGGATAAAAATTTATATGGTTATACAGATGAAGAG624SerIleAsnLeuMetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGlu195200205ATTTTTAAAGCCAGCGCAGAGTACAAAATTCTCGAGAAAATGCCTCAA672IlePheLysAlaSerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGln210215220ACCACCATTCAGGTGGATGGGAGCGAGAAAAAAATAGTCTCGATAAAG720ThrThrIleGlnValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLys225230235240GACTTTCTTGGAAGTGAGAATAAAAGAACCGGGGCGTTGGGTAATCTG768AspPheLeuGlySerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeu245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laAlaGly758085GATCCCATGTACTTAACATTTACTTCTCAGGATGGAAATAACCACCAA340AspProMetTyrLeuThrPheThrSerGlnAspGlyAsnAsnHisGln9095100TTCACTACAAAAGTGATTGGCAAGGATTCTAGAGATTTTGATATCTCT388PheThrThrLysValIleGlyLysAspSerArgAspPheAspIleSer105110115120CCTAAGGTAAACGGTGAGAACCTTGTGGGGGATGACGTCGTCTTGGCT436ProLysValAsnGlyGluAsnLeuValGlyAspAspValValLeuAla125130135ACGGGCAGCCAGGATTTCTTTGTTCGCTCAATTGGTTCCAAAGGCGGT484ThrGlySerGlnAspPhePheValArgSerIleGlySerLysGlyGly140145150AAACTTGCAGCAGGTAAATACACTGATGCTGTAACCGTAACCGTATCT532LysLeuAlaAlaGlyLysTyrThrAspAlaValThrValThrValSer155160165AACCAAGGATCCATC547AsnGln170(2)SEQIDNO21信息(i)序列特征(A)长度170个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑构型线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列表述SEQIDNO21MetLysLysIleSerSerValIleAlaIleAlaLeuPheGlyThrIle151015AlaThrAlaAsnAlaAlaAspLeuThrAlaSerThrThrAlaThrAla202530ThrLeuValGluProAlaArgIleThrLeuThrTyrLysGluGlyAla354045ProIleThrIleMetAspAsnGlyAsnIleAspThrGluLeuLeuVal505560GlyThrLeuThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThrThrSerThrSer65707580ValAsnPheThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyrLeuThrPheThr859095SerGlnAspGlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLysValIleGlyLys100105110AspSerArgAspPheAspIleSerProLysValAsnGlyGluAsnLeu115120125ValGlyAspAspValValLeuAlaThrGlySerGlnAspPhePheVal130135140ArgSerIleGlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAlaGlyLysTyrThr145150155160AspAlaValThrValThrValSerAsnGln165170(2)SEQIDNO22信息(i)序列特征(A)长度1530碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物鼠疫耶尔森氏菌(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置13..1515(xi)序列表述SEQIDNO22TAGAGGTAATATATGAAAAAAATCAGTTCCGTTATCGCCATTGCATTA48MetLysLysIleSerSerValIleAlaIleAlaLeu1510TTTGGAACTATTGCAACTGCTAATGCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC96PheGlyThrIleAlaThrAlaAsnAlaAlaAspLeuThrAlaSerThr152025ACTGCAACGGCAACTCTTGTTGAACCAGCCCGCATCACTCTTACATAT144ThrAlaThrAlaThrLeuValGluProAlaArgIleThrLeuThrTyr303540AAGGAAGGCGCTCCAATTACAATTATGGACAATGGAAACATCGATACA192LysGluGlyAlaProIleThrIleMetAspAsnGlyAsnIleAspThr45505560GAATTACTTGTTGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACC240GluLeuLeuValGlyThrLeuThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThr657075ACTAGCACATCTGTTAACTTTACAGATGCCGCGGGTGATCCCATGTAC288ThrSerThrSerValAsnPheThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyr808590TTAACATTTACTTCTCAGGATGGAAATAACCACCAATTCACTACAAAA336LeuThrPheThrSerGlnAspGlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLys95100105GTGATTGGCAAGGATTCTAGAGATTTTGATATCTCTCCTAAGGTAAAC384ValIleGlyLysAspSerArgAspPheAspIleSerProLysValAsn110115120GGTGAGAACCTTGTGGGGGATGACGTCGTCTTGGCTACGGGCAGCCAG432GlyGluAsnLeuValGlyAspAspValValLeuAlaThrGlySerGln125130135140GATTTCTTTGTTCGCTCAATTGGTTCCAAAGGCGGTAAACTTGCAGCA480AspPhePheValArgSerIleGlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAla145150155GGTAAATACACTGATGCTGTAACCGTAACCGTATCTAACCAAGGATCC528GlyLysTyrThrAspAlaValThrValThrValSerAsnGlnGlySer160165170ATCGAAGGTCGTATTAGAGCCTACGAACAAAACCCACAACATTTTATT576IleGluGlyArgIleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIle175180185GAGGATCTAGAAAAAGTTAGGGTGGAACAACTTACTGGTCATGGTTCT624GluAspLeuGluLysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySer190195200TCAGTTTTAGAAGAATTGGTTCAGTTAGTCAAAGATAAAAATATAGAT672SerValLeuGluGluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAsp205210215220ATTTCCATTAAATATGATCCCAGAAAAGATTCGGAGGTTTTTGCCAAT720IleSerIleLysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsn225230235AGAGTAATTACTGATGATATCGAATTGCTCAAGAAAATCCTAGCTTAT768ArgValIleThrAspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyr240245250TTTCTACCCGAGGATGCCATTCTTAAAGGCGGTCATTATGACAACCAA815PheLeuProGluAspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGln255260265CTGCAAAATGGCATCAAGCGAGTAAAAGAGTTCCTTGAATCATCGCCG864LeuGlnAsnGlyIleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerPro270275280AATACACAATGGGAATTGCGGGCGTTCATGGCAGTAATGCATTTCTCT912AsnThrGlnTrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSer285290295300TTAACCGCCGATCGTATCGATGATGATATTTTGAAAGTGATTGTTGAT960LeuThrAlaAspArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAsp305310315TCAATGAATCATCATGGTGATGCCCGTAGCAAGTTGCGTGAAGAATTA1008SerMetAsnHisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeu320325330GCTGAGCTTACCGCCGAATTAAAGATTTATTCAGTTATTCAAGCCGAA1056AlaGluLeuThrAlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGlu335340345ATTAATAAGCATCTGTCTAGTAGTGGCACCATAAATATCCATGATAAA1104IleAsnLysHisLeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLys350355360TCCATTAATCTCATGGATAAAAATTTATATGGTTATACAGATGAAGAG1152SerIleAsnLeuMetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGlu365370375380ATTTTTAAAGCCAGCGCAGAGTACAAAATTCTCGAGAAAATGCCTCAA1200IlePheLysAlaSerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGln385390395ACCACCATTCAGGTGGATGGGAGCGAGAAAAAAATAGTCTCGATAAAG1248ThrThrIleGlnValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLys400405410GACTTTCTTGGAAGTGAGAATAAAAGAACCGGGGCGTTGGGTAATCTG1296AspPheLeuGlySerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeu415420425AAAAACTCATACTCTTATAATAAAGATAATAATGAATTATCTCACTTT1344LysAsnSerTyrSerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPhe430435440GCCACCACCTGCTCGGATAAGTCCAGGCCGCTCAACGACTTGGTTAGC1392AlaThrThrCysSerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSer445450455460CAAAAAACTCAGCATCTGTCTGATATTACATCACGTTTTAATTCAGCT1440GlnLysThrThrGlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAla465470475ATTGAAGCACTGAACCGTTTCATTCAGAAATATGATTCAGTGATGCAA1488IleGluAlaLeuAsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGln480485490CGTCTGCTAGATGACACGTCTGGTAAATGACACTAGAAGCTT1530ArgLeuLeuAspAspThrSerGlyLys495500(2)SEQIDNO23信息(i)序列特征(A)长度501个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑构型线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列表述SEQIDNO23MetLysLysIleSerSerValIleAlaIleAlaLeuPheGlyThrIle151015AlaThrAlaAsnAlaAlaAspLeuThrAlaSerThrThrAlaThrAla202530ThrLeuValGluProAlaArgIleThrLeuThrTyrLysGluGlyAla354045ProIleThrIleMetAspAsnGlyAsnIleAspThrGluLeuLeuVal505560GlyThrLeuThrLeuGlyGlyTyrLysThrGlyThrThrSerThrSer65707580ValAsnPheThrAspAlaAlaGlyAspProMetTyrLeuThrPheThr859095SerGlnAspGlyAsnAsnHisGlnPheThrThrLysValIleGlyLys100105110AspSerArgAspPheAspIleSerProLysValAsnGlyGluAsnLeu115120125ValGlyAspAspValValLeuAlaThrGlySerGlnAspPhePheVal130135140ArgSerIleGlySerLysGlyGlyLysLeuAlaAlaGlyLysTyrThr145150155160AspAlaValThrValThrValSerAsnGlnGlySerIleGluGlyArg165170175IleArgAlaTyrGluGlnAsnProGlnHisPheIleGluAspLeuGlu180185190LysValArgValGluGlnLeuThrGlyHisGlySerSerValLeuGlu195200205GluLeuValGlnLeuValLysAspLysAsnIleAspIleSerIleLys210215220TyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsnArgValIleThr225230235240AspAspIleGluLeuLeuLysLysIleLeuAlaTyrPheLeuProGlu245250255AspAlaIleLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGlnLeuGlnAsnGly260265270IleLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerProAsnThrGlnTrp275280285GluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSerLeuThrAlaAsp290295300ArgIleAspAspAspIleLeuLysValIleValAspSerMetAsnHis305310315320HisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeuAlaGluLeuThr325330335AlaGluLeuLysIleTyrSerValIleGlnAlaGluIleAsnLysHis340345350LeuSerSerSerGlyThrIleAsnIleHisAspLysSerIleAsnLeu355360365MetAspLysAsnLeuTyrGlyTyrThrAspGluGluIlePheLysAla370375380SerAlaGluTyrLysIleLeuGluLysMetProGlnThrThrIleGln385390395400ValAspGlySerGluLysLysIleValSerIleLysAspPheLeuGly405410415SerGluAsnLysArgThrGlyAlaLeuGlyAsnLeuLysAsnSerTyr420425430SerTyrAsnLysAspAsnAsnGluLeuSerHisPheAlaThrThrCys435440445SerAspLysSerArgProLeuAsnAspLeuValSerGlnLysThrThr450455460GlnLeuSerAspIleThrSerArgPheAsnSerAlaIleGluAlaLeu465470475480AsnArgPheIleGlnLysTyrAspSerValMetGlnArgLeuLeuAsp485490495AspThrSerGlyLys500(2)SEQIDNO24信息(i)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iv)反义链无(vi)原始来源(A)生物鼠疫耶尔森氏菌(xi)序列表述SEQIDNO24GATCGAATTCGAGCCTACGAACAA正如本申请前面所讨论的，F1抗原和V抗原可以用微囊体包被。V抗原和F1抗原可以单独用微囊体包被，然后将组合的微囊体亚单位用于免疫接种。本发明的发明者认为，组合的微囊体亚单位所提供的保护作用要优于现有的鼠疫疫苗，而且微囊体亚单位在组合后还可增强其效果。组合微囊体亚单位的保护效果还能进一步用与佐剂如霍乱毒素B亚单位(CTB)同时接种来加强。亚单位疫苗在微囊体包被后能延长疫苗在体内的释放，并能口服、经鼻腔或吸入给药而发挥作用。组合V抗原和F1抗原亚单位疫苗的微囊体包被将在下面介绍。同时还将证明这种配方能同时诱导抵抗鼠疫的粘膜免疫和全身免疫。亚单位的微囊体包被用溶剂蒸发技术在PLA2000中进行。按下面的方法用微囊体包被的亚单位进行免疫接种。对一组21只小鼠用25ug的V抗原或F1抗原进行初次免疫，抗原结合在微球体上并悬浮于PBS，接种方式为腹膜内(i.p.)注射。另外一组21只小鼠接受含F1抗原和V抗原各25ug的组合物，两种抗原均结合在微球体上。每个25ug剂量的F1抗原结合在5.42mg微球体中，而25ug的V抗原则结合2.08mg微球体。所需数量的微球体悬浮在PBS中，每只小鼠注射100ul。所有的动物在第14天和第28天用合适的相应抗原加强免疫。另取两个21只小鼠的动物组进行初次免疫，并在第14天和第28天加强免疫，免疫途径均为腹膜内注射。免疫所用的抗原为10ug的F1和10ug的V，两种抗原溶解在含25％(v/v)氢氧化铝凝胶(氢氧化铝凝胶1.3％，Superfos.丹麦)的PBS悬液的水相中。所选动物组在每次免疫时，还另外接种10ug溶于载剂的CTB(Sigma，Poole)。含21只小鼠的各对照组只接受单一的氢氧化铝凝胶(100ul的25％溶液)或CTB(100ul含10ugCTB的PBS)，或者不进行处理。为比较用游离的或微囊体包被的组合亚单位疫苗免疫接种与用Greer疫苗(购自Greer实验室)免疫接种的保护效果，用鼠疫耶尔森氏菌毒株对动物经皮下进行攻菌。用Greer疫苗接种的动物，在用2×105cfu鼠疫耶尔森氏菌攻菌时有60％的存活率(图1)。而在用组合的F1+V微囊体免疫接种的动物(第1组)中，用同样的菌数攻菌有80％的存活率，在第2组动物(μV+μF1+10ugCTB)中则有100％的存活率。因此组合的微囊体配方能够抵抗毒性鼠疫耶尔森氏菌并且没有发现副作用。处理组概括如下组处理125ug微囊体包被的F1(μF1)+25ug微囊体包被的V(μV)i.p.225ugμF1+25ugμV+10ugCTBi.p.325ugμF1i.p.425uVi.p.525ugF1+25ugV混合于氢氧化铝凝胶中i.p.6Greer0.1mli.m也可用嵌段共聚物进行微囊体包被。在下面的实验中，使用标准蛋白抗原BSA。微球体的制备和分析如下。携带有蛋白的微球体用稍作修改的水/油溶剂蒸发技术程序(详见R.L.Hunter和B.Bennet，《免疫学杂志》133卷第六期，3167-3175页，(1984))进行制备。聚合物(聚-D-乳酸；Resomer206，BochringerIngelheim，德国；125或250mg)溶解在丙酮(22.5ml)中，并含有标准蛋白(抗原)BSA(理论携带量为15-25％)和获自Zeneca的0.11％w/v的PluronicL101(或0.09％w/v的L121)。探针超声10秒，然后加入水相(22.5ml)，100rpm混合5分钟，旋转蒸发直到有机溶剂全部去除。剩下的胶体物质洗涤后冷冻干燥。微球体的平均直径为大约1um(MalvernMastersizer测定)，在这种条件下制备可携带大约0.5-1％的蛋白。制备的微球体的外部形态用扫描电镜(SEM)进行分析。表面特征用Z电位和疏水性进行描述。疏水性测量微球体的疏水性用H.O.Alpar和A.J.Almeida报导的(H.O.Alpar和A.J.Almeida，《欧洲药物和生物药物杂志》40卷，第4期，198-202页(1994))疏水相互作用层析(HIC)进行测定。微球体在修饰有疏水残基的琼脂糖梯度中进行洗脱，辛基琼脂糖上滞留的微球体作为疏水性指标。免疫接种设计了一个试验来研究不同微球体种类和表面特征在免疫应答上的差别。给雌性Balb/c小鼠(每组5只)肌肉注射单一剂量的用Pluronic微球体包被的BSA，或者注射100ul单独或含有表面活性剂的BSA。对照组小鼠接受相同剂量的抗原，抗原用含PVA作为乳剂稳定剂的微球体包被。在两个月中定期采集尾静脉血样，用酶联免疫试验(ELISA)分析样品血清中的抗BSA抗体。结果绘制在图2中。与PVA配方相比，含有PluronicL101和L121使微球体表面具有更高的疏水性(在辛基琼脂糖层析柱中70％滞留而30％乳胶对照为95％滞留)。疏水性表面有利于巨噬细胞作用和摄取，因而更可能介导增强的免疫应答。图2显示不同的BSA配方所诱导的不同免疫应答效果。用PluronicL101制备的样品产生的血浆抗BSA抗体滴度比用PVA制备的样品要高。用PluronicL121制备的样品在用少量抗原(1ug)诱导初次抗体应答时稍弱于PVA微球体。PluronicL101制备物产生的血清IgG水平明显高于其它制备物，这可能部分归因于其具有较高的表面疏水性。本申请前面已经提到过，编码完整或部分F1抗原的DNA以及编码完整或部分V抗原的DNA可直接用作基因疫苗。操作方法如下。1/编码鼠疫耶尔森氏菌F1和V的DNA用聚合酶链反应(PCR)从鼠疫耶尔森氏菌基因组的特定区域扩增而来，或从前面构建的质粒克隆中进行分离。例如，编码V的DNA可为I.D.no3序列。2/F1和V基因克隆到哺乳动物表达载体质粒上，使它们位于一个真核启动子的下游。合适的质粒包括pCMVβ(购自Clontech)，该质粒含有巨细胞病毒的立即早期启动子。F1和V可单独克隆也可组合在一起克隆，还可与谷胱甘肽S-转移酶或真核信号序列这样一些基因融合克隆。与上述基因融合克隆可使表达的蛋白产物稳定并有利于从哺乳细胞中分泌。3/重组质粒在大肠杆菌中扩增，纯化后的质粒用于转染哺乳动物模型和免疫接种实验动物，免疫途径包括肌肉内注射、皮内注射和吸入途径。实施例1为构建一个表达V抗原的DNA疫苗，载体质粒pCMV用限制性内切酶Not1消化以去除LacZ基因的编码序列。消化后的质粒用Klenow酶处理，产生平末端的载体DNA。从重组质粒pVG100中分离含有V抗原和谷胱甘肽S转移酶融合蛋白编码序列的ssp1限制酶切片段，并与载体DNA连接。这里所用的V序列为实例SeqIDNo3中介绍的序列。将重组质粒转化到大肠杆菌NovaBlue中，提纯后的质粒用肌肉注射法接种给Balb/c小鼠。在接种动物血清中检测到了针对V抗原的免疫球蛋白应答。实施例2为构建一个表达F1抗原的DNA疫苗，设计PCR引物来扩增全长的caf1开放阅读框。这一阅读框编码F1和引导蛋白从细菌细胞中分泌的信号肽。所用的PCR引物在其5’端带有含限制酶识别位点的“尾巴”，使扩增产物能直接插入到载体质粒中。PCR引物5’FAB2和3’FBAM的序列分别见SeqIDNo18和SeqIDNo19。使用5’FAB2和3’FBAM扩增得到一个PCR片段，这个PCR片段的序列见SeqIDno20。用限制内切酶NheI和BamHI消化这一PCR片段，并克隆到用相同酶消化的pBKCMV质粒中。所得到的重组质粒pF1AB转化大肠杆菌NovaBlue，提纯后的质粒用肌肉注射法接种到Balb/c小鼠中。在接种动物中检测到了针对F1的免疫球蛋白应答。实施例3为构建同时表达F1和V的DNA疫苗，将V抗原编码序列插入到实施例2中介绍的表达F1的DNA疫苗中。在F1和V的编码序列之间有一个编码6个氨基酸的连接区，使两种蛋白都能独立形成各自的构型。编码连接区-V的序列用BamHI和HindIII消化重组质粒placFV6来获得，将编码连接区-V的序列与用相同酶切的质粒pFIAB连接。所得到的质粒pFVAB转化大肠杆菌NovaBlue。将质粒提纯以备后用。融合的F1/V序列和推导的氨基酸序列见SeqIDNo22。下面介绍含F1和V抗原的融合蛋白的实施例。酶和试剂用于制备培养基的材料获自Oxoid公司和Difco实验室。DNA操作所用的酶获自BoehringerMannheimUK公司，并按产品说明进行操作。其它的化学药品和生物化学药品除非另行说明都获自Sigma化学公司。特异性的兔多克隆抗V血清由RBrubaker博士(密执安州立大学微生物系)提供。鼠抗F1IgA单克隆抗体(Mab)F13G8-1获自美国典型培养物保藏中心。菌株及培养鼠疫耶尔森氏菌GB在液体培养基中28℃通气培养，所用的培养基(pH6.8)每升含有15g蛋白胨、2.5g肝脏水解物，5g酵母抽提物和5gNaCl，并补加80ml0.25％用0.1M的NaOH溶解的氯化血红素(血肉汁)。大肠杆菌JM109按Sambrook等在《分子克隆实验指南》中介绍的方法培养与保存。DNA操作染色体DNA按Marmur(Marmur，J.1961，《分子生物学杂志》第3卷，208-218页)的方法从鼠疫耶尔森氏菌中分离。编码F1抗原(caf1)和V抗原(lcrV)的基因用PCR的方法从鼠疫耶尔森氏菌DNA中扩增(Galyov，E.E.等，1990，FEBSLett277卷，230-232页；PriceSB等，1989，《细菌学杂志》171卷，5646-5653页)，所用的引物浓度为125pmol并分别与各基因的5’端和3’端序列同源。但对caf1来说，只能扩增到编码成熟F1抗原的区域。F15’引物的序列为(F/5’BGATCGAGCTCGGCAGATTTAACTGCAAGCACC)。F13’引物序列为(Flink/3’AGCATGGATCCTTGGTTAGATACGGTTACGGT)。V5’引物序列为(Vlink/5’AATGGATCCATCGAAGGTCGTATTAGAGCCTACGAACAA)。V3’引物序列为(VG/3’AGCATAAGCTTCTA★GTGTCATTTACCAGACGT)。上述引物分别在5’尾端含有SacI、BamHI和BamHI、HindIII限制酶切位点。另外，核苷酸A★与发表的lcrV基因(PriceSB等，1989，《细菌学杂志》171卷5646-5653页)不同，使扩增后的DNA拥有一个额外的终止密码子(TAA)。引物Vlink/5’A尾端还含有编码Xa因子切割序列Ile-Glu-Gly-Arg的核苷酸。上述PCR引物用DNA合成仪(392型AppliedBiosystems)制备。经过30个循环(95℃，20s；45℃，20s；72℃，30s；9600型GeneAmpPCRSystem；PerkinElmer)的扩增后，回收DNA片段并进行纯化。所获得的cafIPCR产物用SacI和BamHI消化，并与相同酶消化的pUC18质粒连接，电穿孔转化到大肠杆菌JM109中。然后，用BamHI和HindIII消化lcrV-连接区PCR产物，并与中间质粒连接，组成重组质粒placFV6。使用30聚体的引物(位于54和794的5’核苷酸，PriceSB等，1989，《细菌学杂志》171卷，5646-5653页)用PCR方法证明其中一个菌落带有placFV6，该引物扩增到了lcrV基因的一个内部片段。为证实插入片段的核苷酸序列，依照caf1和lcrV的基因设计引物对placFV6进行测序，测序反应使用荧光标记的双脱氧核苷酸按自动化的Taq聚合酶循环测序程序(CATALYSTMolecularBiologyLabstation；AppliedBiosystems)进行。反应产物用DNA自动测序仪(373A型，AppliedBiosystems)分析。克隆的融合蛋白的DNA序列和推导的氨基酸序列见实施例1。融合蛋白由6氨基酸连接区Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg分隔的F1抗原和V抗原组成。该融合蛋白克隆在lac启动子的下游并符合载体编码的LacZ’片段阅读框。这样，完整的融合蛋白在N末端编码9个额外的氨基酸(Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser)。并在胞质中积累。F1/V融合蛋白在大肠杆菌中的表达大肠杆菌JM109/placFV6在含有100μgml-1氨苄青霉素的LB中37℃培养至光吸收值(600nm)为0.3。然后在培养物中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，并继续培养5小时。细菌的全细胞裂解物按Sambrook等介绍的方法制备(SambrookJ等，1989，《分子克隆实验手册》冷泉港实验室出版，纽约)，F1/V融合蛋白的表达用在10-15％的梯度凝胶上做SDS-PAGE(Phastsystem，PharmaciaBiotech)和用Western印迹法(SambrookJ等，1989，《分子克隆实验手册》冷泉港实验室出版，纽约)进行检测。Western印迹所用的探针为1/4000稀释的兔抗V血清或1/250稀释的F13G8-1单抗，蛋白条带用胶体金标记的二抗(AuroprobeBlplus，Cambio)或结合有辣根过氧化物酶的抗鼠IgA二抗(Sigma)进行显色。在JM109/placFV6的裂解物中，以抗V和抗F1血清为探针用Western印迹法检测到了一个分子量约为54.2kDa的融合蛋白。这一产物在对照JM109/pUC18的裂解物中没有检测到。鼠伤寒沙门氏菌SL3261的电穿孔转化质粒DNA用Qiaprep试剂盒从JM109/placFV6中提取和纯化，并电穿孔进鼠伤寒沙门氏菌LB5010(r-m+)中。然后提取修饰好的质粒并电穿孔进入鼠伤寒沙门氏菌SL3261(aroAhis)中。为在小鼠中进行接种，细菌在含有100μgml-1氨苄青霉素的LB中静置培养18小时。洗涤细菌细胞并悬浮在含10％甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)中-70℃保藏。在注射前将细胞悬液化冻并按要求用PBS稀释。用SL3261/placFV6免疫接种本研究使用无菌条件下饲养的6周龄雌性Balb/c小鼠(ChalesRiverLaboratoriesMargateKent，UK)。一组19只小鼠在第0天和第14天经静脉(iv)途径免疫接种0.1ml约含5×106cfu的SL3261/pFV6。为使placFV6在体内保留，在每次接种后的5天内，还给小鼠皮下(s.c)注射50ul的三水合氨苄青霉素(150mgml-1PenbritininjectablesuspensionPOM；SmithKlineBeechamAnimalHealth)。另取一组15只小鼠在第0天经静脉途径单用0.1ml约含5×106cfu的SL3261进行免疫接种或在第0天和第14天经腹膜(ip)途径用0.1ml氢氧化铝凝胶吸附的10ugV和10ugF1混合物进行免疫接种。一组10只同龄小鼠不作处理用作对照。在第7天，从接受SL3261/placFV或SL3261的免疫组中各取5只小鼠，处死后取脾脏。将取出的脾脏在5mlPBS中用stomacher(Seward医药公司)匀浆30秒。匀浆物用PBS做梯度稀释后接种于L琼脂或含100μgml-1氨苄青霉素的L琼脂，确定每只脾脏中含有的细菌数。鼠伤寒沙门氏菌实际剂量每只脾脏的平均cfu±sema％重组率L-琼脂L-氨苄SL3261/placFV63.3×106cfu1030±294380±13537％SL32611.6×107cfu1.85×107±3.57×106a均值的标准误血清抗体滴度的测量在第42天，对SL3261/placFV免疫小鼠做尾静脉采血并收集。用修改的ELISA法(Williamson，ED和RWTitball，1993，《疫苗》11卷，1253-1258页)测量血清中的抗V和抗F1滴度。简单地说，将V(5μgml-11PBS溶液)或F1(2μgml-1)包被在微量滴定板上，待测血清在板上做倍比稀释。结合的抗体用过氧化物酶标记的抗鼠多价Ig进行检测。用减去对照血清非特异性结合的光吸收值后，光吸收值仍大于0.1单位的血清的最大稀释度，来估计特异性抗体的滴度。所有实验小鼠用鼠疫耶尔森氏菌攻菌前的血清抗体滴度也进行测定。在第42天，SL3261/placFV6免疫小鼠的抗V和抗F1滴度分别为1∶5120和1∶2560。鼠疫耶尔森氏菌攻菌在第57天，免疫小鼠和对照小鼠按5或7只一组编组后进行皮下攻菌，攻菌剂量为0.1ml含7.36×102或7.36×104cfu的鼠疫耶尔森氏菌GB菌株。菌株GB分离于一个鼠疫死亡病人，Balb/c小鼠中皮下接种的半数致死剂量(MLD)＜1cfu(Russell，P等，1995，《疫苗》13卷，1551-1556页)。观察小鼠14天，记录死亡时间。尽可能对所有实验动物做尸检，将采集的血样、肝脏和脾涂布在刚果红琼脂上28℃培养48小时，检测鼠疫耶尔森氏菌的存在。*均值的标准误权利要求1.一种保护人或动物抵抗鼠疫耶尔森氏菌感染的方法，该方法包括给机体接种疫苗，所接种的疫苗包括一定形式的鼠疫耶尔森氏菌V抗原和F1抗原或这两种抗原的保护性表位，但不是完整的鼠疫耶尔森氏菌细胞。2.权利要求1的方法，其中抗原以活疫苗的形式接种。3.权利要求2的方法，其中活疫苗包括人或动物的肠道定居微生物，这些微生物转化有重组DNA使它们能表达V抗原和F1抗原中的一种或两者。4.权利要求3的方法，其中肠道定居微生物转化有重组DNA使它们能表达包含V抗原和F1抗原的氨基酸序列或这两种抗原各自的保护性表位部分的融合蛋白。5.权利要求3或4的方法，其中DNA包含SEQIDNo1或SEQIDNo3的DNA。6.权利要求5的方法，其中DNA与lacz或nirβ启动子位于同一个阅读框。7.权利要求3或4的方法，其中DNA包括SEQIDNo10的DNA。8.上述任一项权利要求的方法，其中疫苗包括分离和/或纯化的重组V和F1抗原。9.权利要求8的方法，其中抗原用一种可以药用的载剂提供。10.权利要求9的方法，其中载剂可制备成水包油乳剂。11.上述任一项权利要求的方法，其中疫苗含有一种佐剂。12.上述任一项权利要求的方法，其中疫苗接种后能诱导肠相关淋巴组织(GLAT)的局部刺激，并通过淋巴细胞在共同粘膜免疫系统中迁移对支气管相关淋巴系统(BALT)产生继发性刺激，使呼吸系统粘膜表面有分泌型IgA应答。13.上述任一项权利要求的方法，其中疫苗的形式为微滴或被囊。14.权利要求13的方法，其中被囊为能有效地将组合物运送至个体呼吸道以引起粘膜免疫应答的脂质体或微囊体。15.一种疫苗组合物，包含一定形式的鼠疫耶尔森氏菌V抗原和鼠疫耶尔森氏菌F1抗原，或这两种抗体的保护性表位，但不是完整的鼠疫耶尔森氏菌细胞。16.权利要求15的疫苗，其特征在于它是一种活疫苗。17.权利要求16的疫苗，其中活疫苗包括人或动物的肠道定居微生物，这些微生物转化有重组DNA使它们能表达V抗原和F1抗原中的一种或两者。18.权利要求17的疫苗，其中肠道定居微生物转化有重组DNA使它们能表达包含V抗原和F1抗原的氨基酸序列或这两种抗原各自的保护性表位部分的融合蛋白。19.权利要求17或18的疫苗，其中DNA包括SEQIDNo1或SEQIDNo3的DNA。20.权利要求19的疫苗，其中DNA与lacz或nirβ启动子位于同一个阅读框内。21.权利要求17或18的方法，其中DNA包括SEQIDNo10的DNA。22.上述任一项权利要求的疫苗，其中疫苗包括分离和/或纯化的重组V和F1抗原。23.权利要求22的疫苗，其中抗原用一种可以药用的载剂提供。24.权利要求23的疫苗，其中载剂可制备成水包油乳剂。25.上述任一项权利要求的疫苗，其中疫苗的特征是含有一种佐剂。26.上述任一项权利要求的疫苗，其中疫苗的特征是其形式为微滴或被囊。27.权利要求26的疫苗，其中被囊为能有效地将组合物运送至个体呼吸道以引起粘膜免疫应答的脂质体或微囊体。28.权利要求26的疫苗，其中被囊为嵌段共聚合物。29.权利要求26的疫苗，其中被囊包含生物降解性聚合物。30.权利要求29的疫苗，其中生物降解性聚合物为聚乳酸。31.权利要求30的疫苗，其中还含有羟基乙酸。32.权利要求30的疫苗，其中还含有嵌段共聚合物。33.权利要求28或32的疫苗，其中嵌段共聚合物含有(POP-POE)n重复单位。34.权利要求5的方法，其中DNA与一个体内诱导型启动子位于同一阅读框。35.权利要求34的方法，其中体内诱导型启动子选自HtrA、nirβ、OmpR、OmpC和PhoP。36.权利要求5的方法，其中DNA与一个组成型启动子位于同一阅读框。37.权利要求36的方法，其中组成型启动子是Osmz或lacz。38.权利要求3或4的方法，其中DNA包括SEQIDNo7、8或9的DNA。39.权利要求3或4的方法，其中DNA包括SEQIDNo16的DNA。40.权利要求3或4的方法，其中疫苗包括SEQIDNo1、3或10的DNA的任何一个。41.权利要求4的方法，其中DNA包括SEQIDNo20或22的DNA。42.权利要求41的方法，其中DNA位于一个真核启动子的下游。43.权利要求42的方法，其中真核启动子是一个CMV立即早期启动子。44.权利要求9的方法，其中载剂是水。45.权利要求17或18的疫苗，其中DNA包括序列7、8、9、10或16的DNA之一。46.权利要求19或45的疫苗，其中DNA与一个体内诱导型启动子位于同一阅读框，诱导型启动子选自htrA、nirB、ompR、ompC和phoP。47.权利要求19或45的疫苗，其中DNA与一个选自Osmz或lacz的组成型启动子位于同一阅读框内。48.权利要求19或45的疫苗，其中DNA位于一个真核启动子的下游。49.权利要求48的疫苗，其中DNA包含SEQIDNo22或20的DNA。50.权利要求23的疫苗，其中载剂是水。全文摘要本发明提供一种保护人或动物免受鼠疫耶尔森氏菌侵害的方法,该方法包括给机体接种疫苗,接种的疫苗包括一定形式的鼠疫耶尔森氏菌V抗原、F文档编号C07K14/195GK1184505SQ96193850公开日1998年6月10日申请日期1996年3月13日优先权日1995年3月13日发明者R·W·蒂巴尔,E·D·维利尔姆森,S·E·C·莱里,P·C·F·奥斯顿,A·M·奔内特申请人:英国国防部